1. Tinjauan tentang Sclaniun. xurightii Benth 1.1. Tanaman SolcLnvm wrightii Benth
Solanxtm wrightii Benth atau disebut juga Solarium. grandiflor-um. beraeal dari Peru dan banyak ditanam di Jawa sebagai tanaman hias ( 14 ) . Solanwn wrightii Benth mengandung solasodina yang relatif tinggi pada bagian buahnya, yaitu + 3,5 % ( 15 ).
Sistematika Solanvm. wrightii- Benth menurut Lawrence ( 16 ) adalah sebagai berikut :
Divisi : Spermatophyta Anak divisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledonae Bangsa : Solanales
Suku : Solanaceae
Marga : Solanum
Jenis : Solanum wrightii Benth
1.2. Kalus SclctnxuTL wrightii Benth
Kalue Solanum wrightii Benth yang ada di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Farmasi Univereitas Airlangga pertamakali ditumbuhkan oleh Andayani pada tahun 1987 ( 9 ). Kandungan eteroida
dalam kalus Solnnum wrightii Benth adalah golongan sterol yang terdiri dari empat komponen ( 17 ). Sarwetini mencoba menambahkan buah pisang ambon mentah agar warna kalus menjadi hijau ( 1 1 ). Pada tahun 1989 dilakukan isolaoi protoplae kalus Solam/wi wrightii Benth dan porcobaan fueinya dengan kalufi Soian-u™. mamnvDsxwi. Ratna mencoba menginduksi pembentukan solasodina dengan meningkatkan kadar klorofil ( 12 ). Dalam percobaan induksi ini tidak terdeteksj. adanya solasodina.
Gambar 1. l<‘oto kalut*: Sot.amm wrightii Benth x^ada media MS dorian pt^Kimbahan Kinotin 2 ppm dan NAA 0,5 ppm
2. T i n j a u a n t e n t a n g Solanxim indicxim L 2.1. T a n a m a n Solanxim indicxtm L
Solanxmi indicxtm L merupakan tanaman yang banyak ditanam untuk diambil buahnya dan banyak terdapat di pulau Davao, Mindanau, Rocky bluffs, India, Cina dan Melayu ( 18 ). Solanxim indicxtm L mengandung solasodina pada bagian akar, buah dan daunnya, yaitu 0,32 % berat kering pada bagian daun dan 0,2-1, 8 % berat kering pada bagian buahnya ( 19 ).
Sistematika Solanxim indicum L menurut Lawrence (16) adalah sebagai berikut :
Divisi : Spermatophyta Anak divisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledonae Bangsa : Solanales
Suku : Solanaceae
Marga : Solanum
Jenis : Solari/uT^ indicxxm L
2.2. )Calus Solaixxim indicxtm L
Kalus Solanxon indicxtm L yang ada di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Farmasi Universitas Airlangga pertamakali ditumbuhkan pada tahun 1987 oleh Purwanto. Kalus Solanxim indicxim L mengandung steroida golongan sterol. Ekstrak
petroleum eter serbuk kering dari kalus Solanxim indicxim L mempanyai efek antifertilitas terhadap sejumlah mencit ( 20 ). Pada tahun 1969, dilakukan penelitian pengaruh suinber nitrogen terhadap kecepatan pertumbuhan dan profil kandungan steroida kaluc Solanxufi indicxan L. Pada tahun yang sama, Anik mencoba men^induksi pembentukan solasodina dengan meninfjkatkan kadar klorofil, tetapi tidak terdeteksi adanya solasodina ( 13 ).
m
Gambar 2. Koto kalus Solanum indicum L pada media MS dengan penambahan Kineitn 2 ppm, 2,4 D 0,5 ppm dan GAg 0,5 ppm
3. T i n j a u a n t e n t a n g k u l t u r j a r i n g a n t a n a m a n 3.1. K u l t u r J a r i n g a n t a n a m a n
Sel tumbuhan merupakan eatuan biologis terkecil yang mampu melakukan aktivitas metabolieme, reproduksi dan tumbuh. Berdasarkan teori totipotensi, seinua eel tumbuhan mengandung semua informasi genetik yang sama, sehingga apabila sel tumbuhan ditanam pada media yang seeuai, mampu tumbuh menjadi tanaman baru ( 2 1 ).
Kultur jaringan tanaman didefinisikan sebagai bagian atau jaringan tanaman yang telah dipisahkan dari tanaman asalnya dan ditumbuhkan dalam keadaan steril pada suatu medium artifisial dan sel-selnya mampu tumbuh dan mengadakan pembelahan-pembelahan.
Kultur yang dihasilkan dapat berupa kultur organ tertentu yang telah terdefferensiasi dan sel-sel meristematik yang belum terdeffrensiasi atau disebut kultur kalus ( 22 ).
Beberapa keuntungan kultur jaringan tanaman antara lain ( 23 ),
- tidak terpengaruh oleh letak geografis, iklim, hama dan penyakit tanaman
- kondisi dapat dikontrol, sehingga dapat dihasilkan produk tertentu sesuai dengan keinginan
tidak dibutuhkan lahan pertanian yang luas
- waktu yang diperlukan untuk pembudidayaan dapat dipersingkat
Sedangkan kekurangannya adalah : - sel yang tumbuh heterogen
- kondisi media dan lingkungan harus steril - bahan pembuat media mahal
Khusus di bidang farmasi dan biokimia, sistem kultur jaringan tanaman dapat dipakai untuk ( 24 ) : - Perkembangbiakan tanaman obat secara cepat dan
seragam
- Studi jalur biosintesis senyawa kimia tertentu - Biotransformasi senyawa kimia tertentu
- Mencari senyawa kimia baru dengan aktivita© tertentu
- Isolasi senyawa kimia tertentu, seperti enzim-enzim senyawa intermediat yang sukar diperoleh dari tanaman yang ditanam secara konvensional
3.2. P e n e r a p a n m e t o d e k u l t u r j a r i n g a n t a n a m a n untuk produksi m e t a b o l i t s e k u n d e r
Kultur jaringan tanaman mungkin memproduksi senyawa-senyawa yang identik dengan tanaman asal, senyawa yang sama sekali berbeda dari tanaman asal,
bahkan kadang-kadang tidak mampu memproduksi senyawa spesifik dari tanaman asalnya. Hal ini karena adanya kondisi lingkungan yang sangat berbeda bila sel-sel tanaman ditumbuhkan secara in vitro dibandingkan dengan di alain. Kadar metabolit sekunder yang dihasilkan dapat sama, lebih besar maupun lebih kecil bila dibandingkan dengan kadar pada tanaman asalnya ( 25 ).
Beberapa kriteria yang harus dipenuhi, supaya produksi metabolit ' sekunder dengan metode kultur jaringan tanaman mempunyai nilai ekonomis ( 26 ) : - konsentrasi produk harus lebih besar dari tanaman
asalnya
- bahan dasar tanaman untuk isolasi sukar diperoleh - untuk produksi senyawa kimia yang sukar sekali
diperoleh pada tanaman asalnya, seperti intermediat biosintesis, enzim-enzim tertentu
- produk biotransformasi dari bahan dasar relatif lebih murah dan proses transformasi tidak dapat dilakukan secara kimia atau mikroorganisme
3.3. F a k t o r - f a k t o r yang m e m p e n g a r u h i p e m b e n t u k a n m e t a b o l i t s e k u n d e r d a l a m k u l t u r j a r i n g a n t a n a m a n
Faktor-faktor yang mempengaruhi pembentukan metabolit sekunder dalam kultur jaringan tanaman,
M 1 L ] K
P E R f 'U i s l A K A A N " U N I V E R S H A S A i K L A N G O A *
S U R A B A Y A
antara lain : cahaya, prekursor, nutrien, hormon pertumbuhan, pH, elisitor, adanya penambahan ekstrak yeast, konsentrasi oksigen, karbondioksida, etilen
( 27 ).
Pemberian prekursor termasuk salah satu cara manipulasi pembentukan metabolit sekunder ( 2 0 ). Penambahan suatu prekursor dalam media kultur dapat meningkatkan produk ( 29 ).
4. T i n j a u a n t e n t a n g s t e r o i d a
Steroida merupakan suatu produk alam yang cukup luas kegunaannya dalam bidang pengobatan, antara lain kardiotonik, anti inflamaei, prekursor vitamin D dan senyawa anabolik ( 30 ).
Senyawa steroida mempunyai inti
siklopentanoperhidrofenantren. Rumus bangun dari inti steroida ditunjukkan pada gambar 3.
Semua golongan steroida dianggap turunan dari inti tersebut yang mengalami substitusi, oksidasi atau dehidrogenasi ( 29 ) .
5. T i n j a u a n t e n t a n g s o l a s o d i n a
5.1. Si fat fisikokimia solasodina ( 30 )
Dalam tanaman Solanum sp, solasodina terikat dalam bentuk glikosidanya dengan gula (glDkosa, galaktosa dan rhamnosa). Solasodina sebagai aglikon dari solasonin, soladamin, solaradixina, dan lainnya. Solasodina mempunyai rumus molekul C ^ H ^ O ^ N , dengan bobot molekul 413,62. Solasodina larut bebas dalam benzena, piridina kloroform. Larut dalam alkohol, metanol dan aseton, sedikit larut dalam air serta praktis tidak larut dalam eter. Kristal solasodina berbentuk heksagonal dengan titik lebur 2 0 0°“2 0 2° C .
5.2. B i o s i n t e s i s s o l a s o d i n a
Jalur biosintesis solasodina berawal dari asam asetat sampai squalen. Squalen dengan konformasi SWSWg akan menuju ke kolesterol. Sedangkan konformasi SSSWg akan menjadi senyawa-senyawa triterpen. Biosintesis solasodina dari kolesterol terlihat pada lampiran 5,6,7.
6. T i n j a u a n t e n t a n g sterol
Kolesterol (gambar 5 ) adalah salah satu tipe dari sterol alam dan sebagai suatu sub group dari steroida yang mempunyai karakteristik pada panjang rantai samping C ^ .
Penelitian beberapa tahun terakhir menunjukkan bahwa kolesterol mempunyai fungsi yang sangat penting dalam tanaman, seperti pada hewan. Kolesterol merupakan prekursor, bahan awal untuk biosintesis dari semua jenis steroida ( 29 ). Jaringan tanaman tidak hanya mengandung sterol bebas, tetapi juga glikosida sterin dan ester sterin. Hanya sterol bebas yang mempunyai aktivitas menstabilkan membran. Contoh sterol yang lain adalah sitosterol, kampesterol, stigmasterol (gambar 5 ).
Kolesterol mempunyai sifat fisikokimia sebagai berikut ( 30 ) :
pemerian
titik lebur kelarutan
berat molekul
kristal berwarna putih atau kekuningan, berbentuk serpihan atau kristal lempeng, tidak berasa
148, 5°C
praktis tidak larut dalam air, mudah larut dalm alkohol dan alkohol panas, 1 : 2,8 eter, 1 : 4,5 kloroforrn, 1 : 1,5 benzena, petroleum eter dan piridin 386,64 R kolesterol kampesterol sitosterol. stigmasterol
7. E k s t r a k s i d a n a n a l i s i s s t e r o i d a 7.1. E k s t r a k s i d a n p r e p a r a s i sampel
Ekstraksi dan preparasi sampel sangat tergantung pada jenis sampel, polaritas dari kandungan yang dimaksud, apakah polar, semipolar atau non polar dan juga tergantung pada kandungan lain misalnya mengandung lemak atau tidak ( 32 ) . Bila sampel hanya mengandung Bteroida Bapogenin atau steroida alkaloid dan tidak mengandung lemak, dapat digunakan cara seperti yang dikemukakan oleh Carle ( 3 3 ), yaitu serbuk bahan kering dihidrolisis dengan metanol-HCl, ekstrak yang diperoleh dinetralkan dengan ammonia, disaring dan residu dikeringkan. Terakhir diekstraksi dengan kloroform. Untuk sampel yang berlemak dan hanya mengandung sterol tanpa ada jenis steroida lain, digunakan cara dari Helmbold ( 34 ), yaitu sampel disokletasi dengan petroleum eter 40-60 selama 4B jam, kemudian disabunkan dan bahan yang tidak tersabunkan diekstrakBi dengan eter. Bila bahan mengandung steroida polar, semi polar dan non polar, bisa dipilih cara seperti yang dikemukakan oleh Indrayanto ( 35 ). Serbuk bahan kering diekstraksi dengan petroleum eter 40-60 selama 3x2 jam (kalau perlu disabunkan), lalu residu diekstraksi
dengan aseton (untuk menarik steroida semi polar) dan akhirnya residu diperlakukan seperti Carle di atas (untuk menarik steroida sapogenin dan steroida alkaloid).
7.2. A n a l i s i s d e n g a n K r o m a t o g r a f i L a p i s a n T i p i s CKLT)
Analisis dengan KLT membutuhkan jumlah cuplikan sedikit, waktu lebih cepat dan memberikan pemisahan yang cukup baik.
Sebagai parameter untuk menentukan letak bercak pada kromatogram KLT adalah harga Rf yaitu haail bagi jarak bercak dari titik awal dengan jarak yang ditempuh oleh eluen dari titik awal ( 3 6 ). Faktor-faktor yang mempengaruhi harga antara lain :
- struktur kimia dari senyawa yang akan dipisahkan - sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya - ketebalan dan kerataan dari penyerap
- kemurnian eluen atau ketepatan perbandingan eluen bila digunakan dalam bentuk campuran
- derajat kejenuhan dari bejana
- tehnik eluasi ; menurun, menaik, horisontal atau melingkar
- jumlah cuplikan yang digunakan ; cuplikan yang berlebihan menyebabkan penyebaran bercak membentuk
ekor (tailing) yang dapat mengakibatkan kesalahan dalam perhitungan
- suhu pemisahan
Selain letak bercak (Rf)> dari kromatogram KLT bisa dilihat spesifikasi jumlah bercak dengan masing-masing warnanya.
7.3. A n a l i s i s d e n g a n K r o m a t o g r a f i Gas C G O 7.3.1. M e k a n i s m e kerja
Pada kromatografi gas, mekanisme kerja yang mendasari terjadinya pemisahan adalah proses partisi. Pada Bistem ini dikenal parameter K yaitu koefisien partisi/distribusi yang dinyatakan dengan persamaan :
Ca K =
---Cm
C» = konsentrasi solut dalam fase diam Cm = konsentrasi solut dalam fase gerak
Harga K adalah spesifik untuk masing-masing senyawa (suatu solut tertentu dalam sistem tertentu akan mempunyai harga K yang tertentu). Dari persamaan kesetimbangan dinamis ini fraksi waktu yang dialami solut dalam fase diam ekivalen
dengan fraksi solut yang berada dalam fase gerak. V»
Sehingga K = --- = k' yang disebut faktor Vrr.
kapasitas yaitu merupakan perbandingan jumlah molekul solut dalam fase diam dan fase gerak.
Sebagai parameter digunakan waktu retensi (tR ) yaitu waktu yang diperlukan solut untuk mencapai jarak sepanjang kolom. Untuk suatu sistem kromatografi tertentu harga tR hanya dipengaruhi oleh harga K.
Dalam praktek, parameter yang diamati adalah waktu retensi relatif yang diperoleh dengan membandingkan harga t^ dari komponen yang satu dengan yang lain atau pembanding.
7. 3..2. P e m i l i h a n f a s e d i a m
Menurut Willard ( 36 ), fase diam harus memenuhi syarat : menghasilkan harga K yang berbeda-beda untuk setiap komponen ; melarutkan komponen yang dipisahkan ; tekanan uap yang dihasilkan pada suhu analisis tidak berpengaruh dan bersifat termostabil serta inert.
Untuk analisis steroida alami dapat digunakan fase diam selektif maupun non selektif ( 37 ). Fase diam non selektif yang banyak digunakan oleh
para peneliti adalah polimer-polimer dari metil siloksan seperti SE-30, OV-1 dan OV-lOl ( 38 ), sedangkan fase diam yang selektif misalnya QF-l dan OV-17 ( 37 ).
Analisis dengan kolom kapiler lebih dianjurkan karena akan memberikan hasil pemisahan yang lebih baik daripada kolom “packed column" ( 32 ).Namun penggunaan kolom logam sangat tidak dianjurkan karena dapat menyebabkan degradasi.
Untuk analisis steroida nabati kadang-kadang perlu dilakukan derivatiBasi. Tujuan dari derivatisasi antara lain untuk mempercepat penguapan, memperoleh senyawa yang stabil, memperoleh pemisahan yang sempurna dan untuk
identifikasi ( 36 ). Cara derivatisasi yang umum dilakukan adalah dengan sililasi, asetilasi,
trifluoroasetilasi dan oksimasi ( 38 ).
7.4. A n a l i s i s s t e r o i d a d e n g a n G C - M S
Penggunaan GC-MS di bidang farmasi, untuk mengidentifikasi obat atau metabolit dalam cairan tubuh dan senyawa-senyawa kimia dari bahan alam. Dalam analieie dengan GC-MS, esapat diperoleh profil kromatogram dan spektra massa suat molekul tertentu.
Dengan spektra massa, dapat dianalisis struktur molekul .
Dalam GC-MS fase gerak membawa uap solut melalui kolom kromatografi, pada tekanan, kecepatan alir dan temperatur yang ditentukan oleh sifat • senyawa yang dianalisis. Uap molekul yang menghasilkan puncak pada GC dimasukkan sumber ion,
selanjutnya mengalami ionisasi dan proses pemecahan. Dengan bantuan alat pengukur, maka jumlah ion positip yang meninggalkan sumber ion dapat diukur,
BAHAN, ALAT DAN METODE PENELITIAN BAB III
1. B a h a n - b a h a n y a n g d i g u n a k a n 1 . 1 . B a h a n K i m i a
Semua bahan kimia yang digunakan adalah produkei E. Merck Darmstadt dengan derajat "pro analisa" kecuali disebutkan lain. Kolesterol yang digunakan produksi Sigma . Agar yang digunakan adalah Gibco L87 Paisley, Scotland. Standar kolesterol, solasodina, solasodiena, fitosterol dan diosgenina diperoleh dari Laboratorium Bioteknologi Fakultas Farmasi Universitas Airlangga.
1 . 2 . K a l u s
Kalus Solanum wrightii Benth dan kalus Solanum indicum L diperoleh dari Laboratorium Bioteknologi Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, yang diperbanyak sendiri.
1.3. Media
Media yang digunakan adalah media dasar Murashige dan Skooq (MS) yang dimodifikasi dengan penambahan hormon kinetin 2 ppm dan NAA 0.5 ppm untuk kalus Solanum wrightii Benth (kode media: SW),
sedang untuk kalue Solanum indicum L ditambahkan hormon kinetin 2 ppm, 2,4-D 0.5 ppm, dan GA^ 0.5 ppm
(kode media: SI). Komposisi media MS tertera pada lampiran 1. Media percobaan adalah media SW dan SI dengan penambahan kolesterol seperti terlihat pada
lampiran 2 .
2. A l a t - a l a t y a n g d i g u n a k a n
- Laminar Air Flow Cabinet "Dalton model FA 11-12 Clean Bench PVC-750-APG : untuk pengerjaan aseptis - Otoklaf 25 L (American Portable Auto Claave WAF Co.
Inc.) : untuk sterilisasi media dan alat
- pH-meter "Corning Model" : untuk mengukur dan mengatur pH media
- Neraca analitis "Sartorius" - Vortex mixer (Thermolyne)
- Ultrasonic (Julabo Labortechnik GMBH) - Alat-alat untuk analisis KLT
- Jeol-JMX-DX303 GCMS yang dilengkapi dengan prosesor data Jeol-JMA-DA5000
- GC-14A yang dilengkapi dengan prosesor data CR-3A (Shimadzu)
- Sentifuse Janetaki T5 - Oven "Despatch"
- Botol bermulut lebar untuk pembiakan kultur - Sterilset untuk pengerjaan aeeptis
M e t o d e p e n e l i t i a n 1. T a h a p a n p e n e l i t i a n
Penelitian dilakukan melalui tahapan sebagai berikut :
1. Penanaman kalus pada media sesuai dengan lampiran 2.
2. Waktu pertumbuhan 5 minggu untuk kalus Solcavum wrightii dan 4 minggu untuk Solanxm indicvm.
3. Panen kalus
4. Persiapan bahan percobaan : pengeringan, penyerbukan. 5. EkstrakBi 6. Analisis kualitatip - KLT - GC - GC-MS 7. Analisis data \ 2. Cara k e r j a 2. 1. P e m b u a t a n m e d i a
Masing-masing komponen media MS dibuat larutan persediaan kecuali mio-inositol, sukrosa
dan agar. Larutan-larutan persediaan dicampur, kemudian ditambahkan hormon pertumbuhan, mio-inositol, kolesterol dan eukrosa dal.am jumlah yang tertentu. Larutan diatur pada pH 5,7-5, 8
dengan penembahan larutan NaOH 0,1 N atau HC1 0,1 N. Larutan ditambah air sampai volume yang ditentukan. Setelah ditambah agar, larutan dipanaskan sampai jernih dengan diaduk terus menerus. Larutan dituang panaa-panas ke dalam botol kultur, kemudian ditutup rapat-rapat dengan aluminium foil dan disteriikan dalain otoklaf 121°C selama 20 menit. Botol kultur disimpan dalam ruang kultur dengan suhu +25° C (skema pembuatan media tertera pada lampiran 3)
3.2.2. P e n a n a m a n d a n p e r b a n y a k a n kalus
Penanainan dan perbanyakan kalus dilakukan secara aseptis dalam Laminar Air Flow Cabinet. Setiap kali pemindahan kalus, dilakukan penimbangan berat media dan berat media ditambah kalus. Hasil pengurangan kedua harga tersebut adalah berat kalus awal.
3 . 2 . 3 . P e n g a m a t a n n i a k i o s k o p i s k a l u s
Pengamatan makroskopis meliputi warna kalus dan diferensiasi sel yang terjadi pada kalus
3.2. 4. Panen, p e n g a m a t a n k e c e p a t a n p e r t u m b u h a n d a n p e n g e r i n g a n kalus
Setelah masa waktu yang ditentukan, kalus dipanen. Kalus dipisahkan dari media dan ditimbang. Parameter kecepatan pertumbuhan kalus dinyatakan sebagai harga IP (Indeks Pertumbuhan), dihitung sebagai perbandingan bobot akhir kalus pada saat panen terhadap bobot awal kalus pada saat penanaman. Dinyatakan dengan rumus :
bobot akhir kalus IP =
---bobot awal kalus
Pengeringan kalus dilakukan di bawah sinar matahari, kemudian diserbuk dengan derajat kehalusan tertentu dan dihomogenkan.
3.3.5. E k s t r a k s i kalus
Dilakukan dua cara ekstraksi yaitu cara ekstraksi I dan cara II.
Cara ekstraksi I :
Serbuk kering kalus langsung dihidrolisis dengan ± 5 ml HC1 2 N selama 2 dam pada temperatur 100°C di dalam oven. Setelah dingin, dinetralkan dengan NaOH 10 N, dibasakan eampai pH 10. Kemudian diultrasonik dengan 10 ml kloroforrn selama 15 menit. Divorteke selama 2 menit. Fase kloroforrn
dipisahkan dengan disentrifugasi selama 10 menit dan diuapkan sampai kering dengan rotavapor (skema ekstraksi dapat dilihat pada lampiran 4).
Cara ekstraksi II :
Ditimbang 1,000 gram serbuk kering, diultrasonik selama 1 jam dengan 10 ml kloroforrn. Divorteks selama 10 menit, kemudian disaring, filtrat disisihkan. Residu diultrasonik kembali dengan 10 ml kloroforrn selama 1 Jam ( 40 ). Hasil ekstraksi kloroforrn yang ketiga telah memberikan hasil yang negatif terhadap golongan sterol bebas pada KLT, sehingga ekstraksi cukup dilakukan 2 kali. Filtrat yang terkumpul diuapkan sampai ker ing.
Residu dihidrolisis dengan ± 5 ml HC1 2 N selama 2 jam pada temperatur 100°C di dalam oven. Setelah dingin, dinetralkan dengan NaOH 10 N, dibasakan sampai pH 10. Kemudian diultrasonik dengan 10 ml kloroforrn selama 15 menit. Divorteks selama 2 menit. Fasa kloroforrn dipisahkan dengan disentrifugasi selama 10 menit dan diuapkan sampai kering dengan rotavapor (skema ekstraksi dapat dilihat pada lampiran '5 ).
3 . 2 . 6 . E k s t r a k s i i n e d i . a
Media hasil pemisahan pada saat pemanenan kalus, dicairkan. Dipipet 50 ml, kemudian diuapkan hingga kering dalam oven pada temperatur 90-100°C.
Selanjutnya diultrasonic dengan 20 ml kloroform selama 10 menit, filtrat ditampung. Eketraksi dilakukan tiga kali. Filtrat yang terkumpul diuapkan sampai kering.
3.2.7. A n a l i s a k u a l i t a t i p d e n g a n KLT
KLT dilakukan pada lempeng kieselgel 60 F ^ 54
dengan :
- fasa gerak : kloroform : metanol = 9 : 1
kloroform : etil asetat = 9 : 1 - penampak bercak : anisaldehid sulfat
dragendorf - pembanding : Kolesterol Diosgenina Solasodina Solasodiena 3.2.8. A n a l i s i s k u a l i t a t i p d e n g a n GC
Analisis kualitatip dengan GC dilakukan dengan : - Alat : GC-14A yang dilengkapi dengan prosesor
Roloiri : gelas 3 m x 3 mm
Materi pendukung : Chromosorb AW-DMCS OV-lOl 5 %
Detektor : FID Suhu detektor : 290°C
Suhu kolom : Isotermal 280°C Suhu injektor : 300°C
Gae pembawa : Nitrogen
Kecepatan aliran gas : 40 ml/min - Zat pembanding : Solasodina
- Cara pelaksanaan :
Ekstrak dilarutkan ke dalam kloroforrn, kemudian disuntikkan ke dalam ruang injektor. Zat akan menguap karena pengaruh pemanasan pada ruang injeksi uap akan terbawa oleh gas yang rnengalir, yang telah diatur kecepatan alirnya. Hasil diamati melalui detektor.
3.2.8. A n a l i s i s k u a l i t a t i p d e n g a n G C - M S
Analisis kualitatip dengan GC-MS dilakukan dengan
Alat : Jeol-JMS-DX303 GCMS yang dilengkapi dengan prosesor data Jeol-JMA-DA5000
Gas pembawa : Helium
Kolom : OV-lOl
Panjang kolom : 25 m ID 0,53 mm Suhu kolom : 240o ~280°C / 8°C / min Suhu injektor : 260°C
HASIL PENELITIAN BAB IV
1. P e n g a m a t a n I n d e k s P e r t u m b u h a n CIP)
Kalus Solanum wrightii Benth dipanen 5 minggu eetelah penanaman, sedangkan kalus Solanum indicum L, 4 minggu eetelah penanaman. Indeks pertumbuhan adalah perbandingan bobot akhir kalus pada saat panen terhadap bobot awal kalus pada saat penanaman. Hasil perhitungan dan histogram indeks pertumbuhan rata-rata kalus Solanum -wrightii Benth dapat dilihat pada tabel 1 dan gambar 6 , sedangkan untuk kalus Solanum indicum L dapat dilihat pada tabel 2 dan gambar 7.
2. P e n g a m a t a n m a k r o s k o p i s kalus
Selama masa pertumbuhan kalus, dilakukan pengamatan makroskopis kalus yang meliputi : warna kalus, tekstur dan terjadi. atau tidaknya diferensi.asi sel. Hasil pengamatan makroskopis kalus Solanum wrightii Benth terlihat pada tabel 3, untuk kalus Solanum indicum L pada tabel 4.
Tabel 1. Hasil Perhitungan Indeks Pertumbuhan ( IP ) kalus Solanum. w i g h t i i Benth
No Kode media replikasin IP
x ± SD 1 sw: 16 3,0 ± 1,67 2 swn 5 3,1 ± 1,32 3 swm 15 3,2 ± 1,18 4 swxv 9 3,3 ± 1,40 5 SWV .15 2 , 2 ± 0,76 KOBE MEOA
Gambar 6 . Histogram profil kecepatan pertumbuhan kalus Solanum. w i g K U i Benth pada media SW dengan penambahan berbagai konsentrasi kolesterol
Tabel 2. Basil Perhitungan Indeks Pertumbuhan ( IP ) kalus Solarium indicxm L
No Kode media n replikasi IP x t SD 1 SI! 12 6,9 ± 1,76 2 sin 14 5,6 ± 2,45 3 SIIII 14 7,8 ± 2,03 4 siIV 14 ' 7,0 ± 1,70 5 Sly 16 2,3 ± 1,01
Gambar 7. Histogram profil kecepatan pertumbuhan kalus
Solanum indicum L pada media SI dengan
Tabel 3. Hasil pengamatan makroskopis kalus Solarvuwi wrightii Benth
1 No Kode media Warna kalus Tekstur Kalus Diferensiaei Sel! ! 1 SW I hijau tua rapuh tidak terjadi !
i
1
: 2 SW II hijau tua rapuh tidak terjadi ! i ! 3 SW III hijau tua rapuh
* tidak terjadi J i t
: 4 SW IV hijau tua rapuh tidak terjadi !i i \
! 5 SW V hijau tua rapuh tidak terjadi 1
--- /
Tabel 4. Hasil pengamatan makroskopis kalus Solanum i ndictL'ri L / --- x I No i i i Kode
Media WarnaKalus TeksturKalus Diferensiasi [ Sel i
! 1
i SI I hijau kekuningan rapuh tidak terjadi !i i
! 2
i SI II hijau kekuningan rapuh tidak terjadi |1
! 3
i SI III hijau kekuningan rapuh tidak terjadi !1
i 1 4
i SI IV hijau kekuningan rapuh
1
tidak terjadi ! i
1 5 \-~
SI V hijau kekuningan rapuh tidak terjadi [ ---/
3. I d e n t i f i k a s i s t e r o i d a dari kalus 3.1. A n a l i s i s k u a l i t a t i p d e n g a n KLT
Dari hidrolisis total serbuk kering kalus Solanum wrightii Benth dan Solanum indicum L (cara ekstraksi X), didapatkan fraksi total hidrolisat, yang selanjutnya dilakukan analisis pendahuluan dengan KLT. Dari ekstraksi cara II, diperoleh ekstrak kloroforrn dan fraksi hidrolisat, yang selanjutnya juga dilakukan analisis pendahuluan dengan KLT. Profil kromatogram KLT masing-masing sampel terlihat pada gambar 8-19.
3.2. A n a l i s i s k u a l i t a t i p d e n g a n GC
Berdasarkan hasil KLT fraksi hidrolisat serbuk kering kalus Solanum wrightii Benth pada media SW^ dan SWjjj maka sampel tersebut dilakukan analisis lebih jauh, untuk menentukan ada tidaknya solasodina, dengan GC. Profil kromatogram GC dapat dilihat pada gambar 20-23.
3.3. A n a l i s i s d e n g a n G C - M S
Fraksi total hodrolisat (serbuk kering dari kalus Solanum. wrightii Benth dan Solanum. indic'ij/n. L) dianalisis lebih lanjut dengan GC-MS. Profil kromatogram massa dan total ion serta contoh spektra
massanya dapat terlihat pada gambar 25 dan lampiran 11,12 dan 13. Dari kurva kromatogram total ion dihitung relatip area, untuk kolesterol (BM 386), kampesterol (BM 400), stigmasterol (BM 412) dan sitosterol (BM 414). dengan komputer, kemudian ditabelkan. Contoh hasilnya terlihat pada gambar 25 - 54.
4. A n a l i s i s m e d i a d e n g a n KLT
Setelah kalus dipanen, masing-masing media percobaan diekstraksi dengan kloroform dan dianalisis ada tidaknya kolesterol yang tersisa secara KLT. Profil kromatogrambya terlihat pada gambar 24.
Gambar 8. Profil kromatogram KLT fraksi total hidrolisat serbuk kering kalus Solarium wrightii Benth pada lempeng Kieselgel 60 F254 den6an fase gerak kloroforrn : metanol = 9 : 1 dan penampak bercak dragendorf
Gambar 9 Profil kromatogram KLT fraksi total hidrolisat serbuk kering kalus Solanum wrightii Benth pada