Peptida Pemberi Rasa Gurih
Pada umumnya, peptida yang mempunyai rasa gurih mengandung asam amino glutamat (Glu) dan aspartat (Asp) seperti terlihat pada Tabel 1. Adanya residu asam amino asam ini sangat penting untuk menghasilkan rasa dari peptida-peptida yang ada dalam bahan pangan (Tamura et al. 1989). Akan tetapi, bukan berarti rasa gurih dari suatu peptida hanya ditentukan oleh kedua jenis asam amino tersebut. Asam amino yang bersifat hidrofilik seperti serin (Ser), threonin (Thr), glisin (Gly) dan glutamin (Gln) apabila diikat melalui ikatan peptida bersama dengan asam amino glutamat dan aspartat, juga menghasilkan rasa gurih (Noguchi et al 1975).
Rasa gurih dari suatu peptida juga dipengaruhi oleh urutan asam amino penyusunnya dan jenis garam yang ditambahkan untuk mencapai pH 6 (Nakata et al, 1995). Di-peptida Asp-Glu mempunyai rasa gurih dengan nilai threshold 3.32 mM, sedangkan di-peptida Glu-Asp mempunyai rasa asin dengan nilai threshold 1.74 mM. Tamura et al. (1989) menemukan bahwa posisi Asp dan Glu dalam garam sodium peptida asam merupakan faktor yang sangat penting untuk menghasilkan rasa gurih. Contohnya adalah garam sodium dipeptida Asp-Glu.2 Na menghasilkan rasa gurih yang lebih kuat dibandingkan Glu-Asp.2Na. Selain itu, ia juga menduga bahwa suatu peptida yang menghasilkan rasa gurih dan asin memiliki kation dan anion yang berdekatan.
Selain di- dan tripeptida sintetik yang mempunyai rasa gurih, juga terdapat oktapeptida yang berhasil diisolasi dari kaldu daging sapi oleh Yamasaki dan Maekawa (1978) yang mempunyai rasa gurih. Urutan asam amino penyusun oktapeptida ini adalah H-Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala-OH yang sering disebut sebagai delicious peptide atau beefy meaty peptide (BMP). Rasa gurih yang dihasilkan oleh oktapeptida ini disebabkan oleh interaksi antara fragmen basa (Lys-Gly) dan fragmen asam (Asp-Glu-Glu) (Tamura et al. 1989 dan Nakata et al. 1995). Selain berpengaruh terhadap rasa, kedua fragmen ini juga berpengaruh terhadap intensitas rasa yang dihasilkan. Timbulnya rasa gurih ini
Tabel 1 Peptida-peptida yang mempunyai rasa gurih pada pH 6
Peptida pHa Na+ b Nilai threshold
(mM) Asp-Glu* 3.31 1.75 3.32 Glu-Glu* 3.54 1.90 2.22 Asp-Asp-Glu* 3.18 2.78 2.06 Asp-Glu-Asp* 3.32 2.55 2.68 Asp-Glu-Glu* 3.32 2.68 2.09 Glu-Glu-Asp* 3.47 2.53 3.47 Glu-Glu-Glu* 3.33 2.68 2.09 Asp-Glu-Ser** - - 300c Glu-Ser** - - 200 c Thr-Glu** - - 300 c Glu-Gly-Ser** - - 200 c Ser-Glu-Glu** - - 200 c Glu-Gln-Glu** - - 300 c Asp-Asp*** 3.24 1.74 3.32 Glu-Asp*** 3.33 1.04 1.74 Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala**** - - 1.25 a
pH pada saat sebelum ditambahkan NaOH
b
jumlah ion sodium (mol) yang ditambahkan hingga mencapai pH 6 (mM) c
satuannya : mg%
* sumber: Nakata et al. (1995) ** sumber: Noguchi et al. (1975) *** sumber: Kuramitsu et al. (1996)
**** sumber: Yamasaki dan Maekawa (1978)
diduga dihasilkan oleh lokalisasi kation pada fragmen basa dan anion pada fragmen asam (Nakata et al. 1995).
Faktor lainnya yang berperan dalam pembentukan rasa gurih suatu peptida adalah pH larutan dan jenis garam yang ditambahkan. Rasa gurih dari BMP mempunyai intensitas tertinggi pada pH 6.5, kemudian menurun pada pH 9.5. Sedangkan pada pH asam (3.5) tidak menghasilkan rasa gurih (Wang et al. 1996). Adapun jenis garam yang dapat menimbulkan suatu peptida mempunyai rasa gurih adalah garam sodium (Nakata et al. 1995). Kuramitsu et al. (1996) menemukan bahwa penambahan garam Na pada larutan dipeptida Asp, Asp-Glu, Glu-Asp dan Glu-Glu hingga pH larutan menjadi 6.0 akan menghasilkan rasa gurih/asin, sedangkan jika pH larutan menjadi 5.0 atau 7.0, rasa gurih/asin akan hilang.
Sumber Peptida Pemberi Rasa Gurih
Seperti disebutkan di atas, peptida yang mempunyai rasa gurih, pertama kali diisolasi dari kaldu daging sapi oleh Yamasaki dan Maekawa (1978). Berawal dari penemuan ini, banyak dilakukan penelitian mengenai keberadaan peptida gurih pada bahan pangan yang mempunyai rasa gurih seperti hidrolisat protein ikan, keju dan moromi dari kacang kedelai.
Konsentrat Protein Ikan
Pada tahun 1973, Fujimaki et al. melakukan hidrolisis konsentrat protein ikan dengan menggunakan enzim pronase dan kemudian difraksinasi untuk mengetahui hubungan antara distribusi berat molekul dengan sifat organoleptik hidrolisat protein ikan. Senyawa yang bertanggung jawab terhadap rasa gurih hidrolisat protein ikan adalah peptida asam yang memiliki residu asam amino hidrofilik, dimana peptida ini mempunyai berat molekul di bawah 1000 dalton.
Keju
Keju merupakan bahan pangan yang disukai oleh kebanyakan orang, karena rasanya yang gurih dan mempunyai mouthfeel yang enak. Pengujian terhadap kandungan dan kontribusi peptida yang terdapat pada fraksi larut air terhadap flavor berbagai jenis keju telah dilakukan, yaitu keju Cheddar yang difermentasi selama 9 bulan (Fernandez et al. 1998), keju yang terbuat dari susu sapi, domba dan kambing (Molina et al. 1999) dan keju Bouton de Culotte-BC dan Crottin de Chavignol-CC yang terbuat dari susu kambing (Salles et al. 2000). Pada umumnya, peptida-peptida yang berperan dalam pembentukan karakteristik rasa dan flavor keju adalah peptida yang mempunyai berat molekul kurang dari 1000 Da. Akan tetapi penelitian-penelitian itu menunjukkan bahwa peptida yang terdapat dalam fraksi berberat molekul kurang dari 1000 Da dan 500 Da tidak berkontribusi secara langsung terhadap pembentukan flavor keju, demikian pula terhadap rasa umami keju. Peptida yang terdapat pada keju berperan secara sinergis dengan mineral untuk menurunkan rasa pahit (Engel et al. 2000).
Kacang Kedelai
Sumber peptida gurih lainnya adalah kacang kedelai. Protein kacang kedelai dapat langsung dihidrolisis baik secara enzimatik, hidrolisis dengan asam ataupun dengan cara hidrolisis enzimatik yang direaksikan dengan glukosa melalui pemanasan menghasilkan Hydrolyzed Vegetable Protein (HVP) yang mempunyai rasa gurih (Aaslyng et al. 1998).
Selain itu, peptida gurih dapat diambil dari fermentasi kacang kedelai dalam bentuk moromi yang merupakan salah satu tahap dalam pembuatan kecap, dimana penelitian mengenai hal ini telah dilakukan oleh Apriyantono et al. (2003). Mereka menemukan bahwa peptida yang berkontribusi terhadap rasa gurih kecap adalah peptida berberat molekul kurang dari 500 Da yang dihasilkan dari proses ultrafiltrasi ekstrak moromi. Selanjutnya Lioe et al. (2003) melakukan fraksinasi fraksi yang mengandung peptida kurang dari 500 Da dengan kromatografi filtrasi gel dan menghasilkan 4 fraksi. Dari keempat fraksi yang diuji, fraksi ke 2 mengandung asam glutamat dalam jumlah yang paling besar (15.48%), akan tetapi kandungan asam glutamat bebasnya hanya 1.43% (b/b). Hal ini menunjukkan bahwa asam glutamat yang ada didalam fraksi 2 berada terikat dalam suatu peptida yang menghasilkan rasa gurih.
Produk Olahan Ikan Tradisional
Hasil olahan produk-produk perikanan secara tradisional seperti ikan asin, ikan peda dan kecap ikan dikenal sebagai produk yang mempunyai cita rasa yang khas khususnya untuk rasa asin dan gurihnya. Berdasarkan hasil penelitian Saleha (2004) terhadap berbagai jenis ikan asin, ikan peda dan kecap ikan, diketahui bahwa ekstrak ikan asin jambal roti goreng, ekstrak ikan peda putih goreng dan ekstrak kecap ikan cap ikan merah, merupakan produk-produk yang mempunyai rasa gurih tertinggi. Penelitian selanjutnya menemukan bahwa fraksi berberat molekul kurang dari 1000 Da mempunyai rasa gurih tertinggi daripada fraksi-fraksi berberat molekul lebih dari 1000 Da. Hal ini menunjukkan bahwa
senyawa-senyawa yang berperan terhadap rasa gurih ketiga ekstrak adalah senyawa-senyawa berberat molekul kurang dari 1000 Da.
Keberadaan peptida yang mempunyai rasa gurih pada ekstrak ikan asin jambal roti goreng (Rahmawaty 2004) dan ekstrak kecap ikan cap ikan merah (Priliandari 2004) diketahui setelah dilakukan fraksinasi lebih lanjut menggunakan kromatografi gel dengan kolom Sephadex G 10. Penggunaan kolom ini dapat menghasilkan 5 fraksi peptida yang terpisah dengan garamnya, dimana pada umumnya garam terdapat pada fraksi 2. Dugaan adanya peptida yang mempunyai rasa gurih pada ketiga ekstrak adalah tingginya skor rasa gurih pada fraksi 1. Fraksi 1 ini tidak mengandung garam dan mempunyai proporsi asam glutamat bebas per total asam glutamat yang kecil, sehingga diduga asam glutamat terikat dalam bentuk peptida yang memberikan rasa gurih.
Teknik Isolasi Peptida
Tahap-tahap yang dilakukan untuk mengisolasi peptida yang memberikan rasa gurih secara umum adalah ekstraksi, filtrasi dan fraksinasi hingga mendapatkan satu fraksi yang berpotensi mengandung peptida gurih. Setelah itu dilakukan pemurnian dengan teknik elektroforesis untuk mendapatkan senyawa tunggal (peptida gurih). Tahap akhir adalah identifikasi untuk mendapatkan struktur primer peptida gurih. Skema isolasi peptida yang mempunyai rasa gurih dapar dilihat pada Gambar 1.
Ekstraksi peptida gurih cukup mudah tergantung dari bentuk bahan pangannya yaitu padatan, cairan atau campuran keduanya. Pelarut yang biasa digunakan adalah air karena peptida merupakan senyawa yang larut air. Untuk mengekstrak peptida dari bahan yang masih mengandung protein yang belum terhidrolisis seperti daging sapi, ekstraksi dilakukan dengan menggunakan air panas (Yamasaki dan Maekawa 1978). Akan tetapi bahan pangan yang telah melalui proses pengolahan yang menyebabkan proteinnya terhidrolisis menjadi peptida-peptida kecil, misalnya proses fermentasi, ekstraksi cukup dengan menggunakan air dingin seperti pada keju (Salles et al. 2000). Kacang kedelai yang telah melalui fermentasi oleh kapang dan garam yang sering disebut moromi
mempunyai bentuk campuran cairan dan padatan, sehingga untuk mengekstrak peptidanya cukup dengan menghomogenisasi moromi dan memerasnya hingga didapat ekstrak moromi (Apriyantono et al.2003 dan Lioe et al 2003). Senyawa-senyawa lain yang ikut terekstrak seperti lemak, karbohidrat dan lain sebagainya, dapat dihilangkan dengan cara sentrifugasi.
Tahap isolasi selanjutnya adalah penyaringan ekstrak larut air dengan menggunakan teknik ultrafiltrasi. Pada umumnya, ultrafiltrasi dilakukan hingga mendapatkan fraksi peptida dengan berat molekul kurang dari 1000 Da (Salles et al. 2000; Molina et al. 1999 dan Mojarro-Guerra et al. 1991), akan tetapi Apriyantono et al (2003) dan Lioe et al. (2003) melakukannya hingga mendapatkan fraksi berberat molekul kurang dari 500 Da. Selain dengan menggunakan teknik ultrafiltrasi, penyaringan juga dapat dilakukan dengan menggunakan kromatografi filtrasi gel dengan menggunakan kolom sephadex G-25 (Yamasaki dan Maekawa 1978) dan sephadex G-15 (Oka dan Nagata (1974).
Setelah didapat fraksi-fraksi peptida berberat molekul tertentu, dilakukan fraksinasi terhadap fraksi-fraksi dengan menggunakan teknik kromatografi. Teknik kromatografi yang umum digunakan adalah kromatografi filtrasi gel dan kromatografi pertukaran ion. Proses fraksinasi dapat dilakukan dengan menggabungkan teknik-teknik kromatografi ini, seperti Oka dan Nagata (1974) melakukan tiga kali fraksinasi dengan menggunakan kromatografi pertukaran ion, dimana masing-masing menggunakan kolom yang berbeda-beda sehingga dapat memisahkan fraksi non ionik, asam, basa dan netral. Yamasaki dan Maekawa (1978) menggabungkan teknik kromatografi filtrasi gel dengan kolom sephadex G-25 dengan kromatografi pertukaran ion yang menggunakan kolom Dowex 50 x 4. Peneliti lainnya, Mojarro-Guerra et al. (1991) menggabungkan teknik kromatografi pertukaran ligan dan pertukaran ion dengan kolom aminex. Teknik lainnya yang telah digunakan adalah re-kromatografi fraksi dengan teknik kromatografi filtrasi gel (kolom Sephadex G-25) (Fernandez et al. 1998). Adanya perbedaan penggunaan teknik kromatografi yang digunakan, tergantung dari jenis-jenis peptida yang terdapat pada ekstrak.
• untuk mendapatkan fraksi terpilih dapat dilakukan dengan beberapa teknik kromatografi
Gambar 1 Skema isolasi peptida pemberi rasa gurih
Bahan pangan ¬ Air panas ¬ Enzimatis Identifikasi : Elektroforesis, LC-MS, peptide sequencer
Fraksinasi dengan kromatografi Ultrafiltrasi
Ekstraksi
Fraksi 1 Fraksi 2 …….. Fraksi n
Fraksi tergurih
………
Fraksi B
Fraksi A Fraksi n
Profil peptida yang terdapat pada fraksi berpotensi hasil fraksinasi dapat diketahui dengan menggunakan teknik elektroforesis, baik elektroforesis kertas (Yamasaki dan Maekawa, 1978 dan Oka dan Nagata, 1974) maupun Capillary Electroforesis (Lioe et al. 2003). Teknik lainnya adalah dengan menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (Mojarro-Guerra et al. 1991; Fernandez et al. 1998 dan Molina et al. 1999).
Tahap akhir dari isolasi peptida adalah menentukan urutan asam amino penyusun peptida tersebut yang dapat dilakukan dengan metode degradasi Edman untuk menentukan urutan N – terminal dan metode Carboxypeptidase A (Cpase A) untuk menentukan urutan C-terminal terpisah (Yamasaki dan Maekawa 1978). Metode lainnya adalah gas phase isothiocyanate degradation yang merupakan modifikasi degradasi Edman (Mojarro-Guerra et al. 1991). Cara lain yang lebih mudah dan cepat adalah dengan menggunakan peptide sequencer (Wassenar et al. 1995) atau asam amino analyzer (Fernandez et al. 1998).
Identifikasi Peptida
Capillary Electrophoresis (CE)
Peptida maupun asam amino merupakan senyawa yang dapat mengion dalam larutan, dimana jenis ion yang terbentuk sangat tergantung dari pH larutan. Sifat inilah yang menyebabkan analisis terhadap kedua senyawa ini banyak dilakukan menggunakan Capillary Electrophoresis (CE). Adapun prinsip kerjanya adalah kolom kapiler yang berisi buffer ditempatkan pada 2 bejana buffer dan dialiri medan listrik. Hal ini menyebabkan pembentukan ion-ion pada kapiler sehingga mengakibatkan perpindahan ion-ion analit yang didasarkan oleh electrophoretic mobility masing-masing komponen (Sorensen et al. 1999). Sistem peralatan pada CE dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2 Skema komponen-komponen utama pada sistem Capillary Electrophoresis
Mode pemisahan yang dapat digunakan untuk peptida adalah Capillary Zone Electrophoresis (CZE), Capillary Isoelectric Focusing (CIF), Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography (MECC) dan Capillary Gell Electrophoresis (CGE). Akan tetapi, yang banyak digunakan adalah mode CZE karena mempunyai efisiensi yang tinggi terhadap molekul-molekul kecil, mudah diotomatisasi, memungkinkan untuk kuantifikasi secara langsung (Schoneich et al. 1993). Kolom kapiler dalam mode ini terdiri dari fused silica yang permukaannya bermuatan negatif karena terionisasinya gugus silanol (SiO-), dimana derajat muatannya tergantung dari pH larutan dalam kapiler (Sorensen et al. 1999).
Pemisahan senyawa pada CE, idealnya disebabkan oleh perbedaan mobilitas elektroforetik, dimana suatu peptida mempunyai mobilitas elektroforesis tertentu yang bersifat konstan tergantung dari muatan, viskositas larutan dan radius ion (Messana et al. 1997). Masalah utama pada peptida adalah adanya beberapa peptida dan protein yang berinteraksi kuat dengan permukaan silanol-silanol kapiler yang mengandung fused-silica. Interaksi ini menghasilkan penyimpangan bentuk peak dan ireprodusibiliti waktu elusi dan kuantifikasi. Untuk mencegahnya perlu penggunaan buffer ber-pH rendah sehingga kondisi
ionisasi permukaan silanol akan ditekan sehingga interaksi peptida bermuatan positif (pH<pI) akan diminimisasi (Schöneich et al. 1993).
Detektor yang dapat digunakan untuk mendeteksi peptida adalah Diode Array Detector dengan menerapkan absorbansi UV/VIS sehingga didapat informasi spektral yang sangat penting dalam identifikasi dan purifikasi (Kitagishi 1997). Adanya peptida dapat dideteksi dengan menggunakan panjang gelombang 215 nm yang merupakan daerah penyerapan ikatan peptida, selain itu panjang gelombang 230 atau 254 nm juga sering digunakan (Bailey 1992). Untuk asam amino aromatik seperti L-Phe, L-Tyr dan L-Trp dapat dilakukan pendeteksian pada panjang gelombang 280 nm (Bailey 1992). Dari 20 asam amino, hanya 3 asam amino inilah yang dapat menyerap sinar UV secara nyata (Cancalon 1997).
Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS)
Liquid Chromatography tandem MS (LC-MS/MS) merupakan alat yang banyak digunakan untuk mengidentifikasi campuran beberapa peptida baik hasil sintesis maupun yang berasal dari sampel biologi. Di dalam reviewnya, Mehlis dan Kertscher (1997), memperlihatkan luasnya aplikasi LC-MS/MS untuk analisis peptida yaitu telah melebihi 100 peptida dan protein yang terdaftar pada review biannual (1994/95).
Person et al. (2004) telah berhasil melakukan identifikasi dan karakterisasi peptida berberat molekul rendah (di- dan tripeptida) dari minuman anggur dengan menggunakan LC-MS/MS tanpa memerlukan persiapan sampel yang rumit yaitu hanya dengan ultrafiltrasi hingga MWCO 1000 Da. Untuk sampel peptida yang berasal dari bahan-bahan biologi yang diekstrak dengan air harus melalui tahap persiapan sampel sebelum disuntikkan ke LC-MS/MS. Hal ini disebabkan sampel hanya mengandung peptida dalam jumlah kecil sehingga perlu dilakukan pengkayaan (enrichment) yang dapat dilakukan dengan menggunakan teknik SPE (Solid Phase Extraction) (Heraiz dan Casal 1995) dan mengandung garam yang tinggi (Mehlis dan Kertscher 1997). Garam dapat mengganggu sistem MS jika terdeposit di dalamnya. Sedangkan untuk menganalisa peptida sintetis tidak memerlukan persiapan sampel karena sudah mengandung peptida murni seperti yang dilakukan oleh Petitris et al. (2002) yang menganalisis campuran 23 peptida
berberat molekul rendah (20 dipeptida, 2 tripeptida dan glutathione teroksidasi) dengan menggunakan ion pair reverse phase LC-ESI-MS tanpa melakukan derivatisasi.
Untuk mendapatkan hasil yang optimum dalam mengidentifikasi peptida menggunakan LC-MS/MS perlu dilakukan pengembangan metode LC dan MS-nya sehingga dapat menghasilkan spketrum massa yang baik tetapi tidak merusak sistem detektor MS (Careri dan Mangia 2003). Penelitian untuk mendapatkan kondisi pemisahan yang optimum telah banyak dilakukan. Dalam reviewnya, Mehlis dan Kertscher (1997) menyatakan bahwa standar fase gerak yang digunakan pada lebih dari 90% penelitian mengenai analisis peptida dengan LC-MS/MS adalah campuan asetonitril (ACN) dengan air dan diasamkan oleh trifluoroacetic acid (TFA, 0.05-0.1%). Penggunaan ACN/air sebagai solven disebabkan oleh karakteristik campuran ini yang dapat membentuk larutan terprotonasi sebagai akibat dari reaksi solven dengan asam lemah seperti asam asetat, asam format atau asam propionat yang ditambahkan (Cech dan Enke 2001). Adapun teknik elusi yang umum digunakan adalah gradien agar dapat memperkecil kemungkinan hilangnya peptida yang sangat polar karena terelusi terlalu cepat atau kehilangan peptida yang sangat tidak polar karena berikatan kuat dengan fase diam (Mehlis dan Kertscher 1997).
Penggunaan zat aditif berupa ion pairing agent banyak digunakan untuk lebih mengoptimalkan pemisahan peptida dan untuk mempertajam bentuk peak (Petritis et al. 2002, McCalley 2004, Toll et al., 2005). Pada mulanya zat aditif yang banyak ditambahkan pada eluen adalah TFA (Trifluoroacetic acid), akan tetapi penelitian lebih lanjut menunjukkan bahwa penggunaan TFA dapat menurunkan sensitiftas MS (McCalley 2004). Sebagai alternatif penggunaan ion pairing agent dapat dengan menggunakan ammonium format (McCalley 2004), NFPA (Nonafluoropentanoic acid) dan TDFHA (Tridecafluoroheptaenoic acid) (Petritis et al. 2002).
Teknik ionisasi yang sesuai dengan LC-MS/MS adalah electrospray ionisation (ESI) (Burlingame et al. 1994). Menurut Van Bramer (1998), penggunaan teknik ESI ini disebabkan oleh sifat peptida yang labil terhadap panas, sehingga ionisasi tidak dapat dilakukan pada suhu tinggi. Adapun prinsip
dari ESI-MS in adalah solven polar yang mengandung ion-ion analit di semprot dari ujung logam kapiler, jika disertai potensial yang tinggi (4-5 kV, positif atau negatif dan tergantung dari muatan ion-ion analit) antara kapiler dengan lempeng logam, maka akan terbentuk droplet bermuatan tinggi (diameter 1 – 3 µm). Droplet tersebut dibantu oleh aliran gas inert kering dan panas (bukan prasyarat untuk pembentukan spray) kemudian bergerak menuju lempeng logam yang berpotensial lebih rendah. Hal ini menyebabkan droplet-droplet berkumpul dan akhirnya akan dikeluakan dari bentuk droplet menjadi fase gas (Mehlis dan Kertscher 1997). Untuk lebih jelasnya Cech dan Enke (2001) menjelaskan prinsip kerja ESI dengan menggunakan skema seperti terlihat pada Gambar 3.
Gambar 3 Skema proses ionisasi elektrospray. Larutan analit dipompa melalui needle dimana tegangan tinggi diberikan. ”Taylor cone’ dengan muatan positif berlebih dipermukaannya terbentuk sebagai hasil daru perbedaan medan listrik antar ESI needle dengan eletroda yang berlawanan. Droplet bermuatan terbentuk dari ujung Taylor cone dan droplet-droplet ini diuapkan dan masuk ke MS untuk menghasilkan molekul analit bebas dan bermuatan yang dapat dianalisa rasio massa per muatannya (m/z) (Cech dan Enke, 2001).
Untuk mengetahui atau menguraikan struktur peptida sehingga dapat diidenifikasi, digunakan teknik aktivasi tumbukan (Collisionally Activated decomposition : CAD) yang secara umum diasumsikan mengacu pada tumbukan-tumbukan dengan atom-atom gas pada tekanan tinggi (Burlingame et al. 1994). Peptida-peptida yang telah dikenakan CAD pada energi tertentu akan mengalami
fragmentasi, dimana kemungkinan pembentukan ion-ionnya sangat banyak tergantung jenis peptidanya (Gambar 4).
Secara umum pada fragmentasi peptida, jika energi tumbukan relatif tinggi, maka fragmentasi melibatkan pemecahan ikatan tunggal dan terbentuklah ion-ion tipe b. Sedangkan jika energi tumbukan relatif kecil, maka kerusakan ikatan akan terjadi secara simultan sehingga akan terbentuk ion-ion tipe y (Staudenmann et al. 2000 Di dalam : Petritis et al. 2002). Berdasarkan penelitian yang dilakukan Petritis et al. (2000) diketahui bahwa energi tumbukan (CAD) untuk dipeptida yang paling optimum adalah 15 eV.
Gambar 4 Pola fragmentasi peptida (Harrison et al. 2000)
Berdasarkan ion-ion yang terbentuk dapat dilakukan identifikasi kandungan asam amino serta urutannya. Wysocki et al. (2003) mengemukakan modifikasi penentuan urutan asam amino suatu peptidauntuk interpretasi dari spektrum sector-TOF SID yang bermuatan +1, yaitu (1) menentukan berat molekul peptida yang tidak diketahui dari m/z ion prekursor dan informasi komposisi dari ion-ion immonium, (2) menandai residu terminal-C dari ion-ion y1
dan y2, (3) menemukan pasangan ion b/a (kemudian residu terminal-N) dengan adanya ion yn-2, (4) menandai secara langsung ion b2 dengan adanya yn-1, selisih dari (yn-1) – (Yn-2) adalah massa dari residu terminal-C untuk ion b2.