Botani dan Morfologi Tanaman Kakao (Theobroma cacao L.)
Tanaman kakao (Theobroma cacao L.) merupakan tanaman dikotil dan termasuk ke dalam famili Sterculiaceae. Jumlah kromosom yang dimiliki tanaman kakao yaitu 2n = 20. Tanaman kakao dewasa bisa mencapai ketinggian 6-9 m (Tjasadiharja 1987). Daerah dataran rendah tropis dengan ketinggian 1000 m di atas permukaan laut merupakan daerah tanaman kakao tumbuh. Curah hujan yang merata sepanjang tahun dengan minimal 90-100 mm per bulan diperlukan pula oleh tanaman kakao. Curah hujan yang baik untuk pertumbuhan tanaman kakao dipengaruhi juga oleh sifat fisik tanah itu sendiri (Siregar et al., 2004). Tanaman kakao juga memerlukan pH tanah yang berkisar antara 6.0-7.0 (Goenadi & Hardjono 1985).
Kingdom : Plantae (Tumbuhan)
Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh) Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji) Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga) Kelas : Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil) Sub Kelas : Dilleniidae
Ordo : Malvales Famili : Sterculiaceae Genus : Theobroma
Spesies : Theobroma cacao L.
Suhu lingkungan yang baik untuk kakao tumbuh adalah 18-32°C dengan suhu rata-rata tahunan 25°C. Suhu rata-rata bulanan terdingin tidak boleh kurang dari 15°C. Pengaruh suhu ini sangat erat hubungannya dengan sinar matahari, ketersediaan air, dan kelembaban udara. Jika suhu rendah maka akan menyebabkan pembungaan terlambat. Penurunan suhu di bawah 22°C bisa menyebabkan primordia bunga terhenti (Wachjar & Iskandar 1988). Kondisi pada suhu tinggi akan menyebabkan pertumbuhan pucuk terhambat, tetapi merangsang
pembentukan cabang sehingga mengakibatkan daun-daun tidak berkembang (Wood 1985).
Salah satu sifat khusus dari daun kakao adalah adanya dua persendian (articulation) yang terletak di pangkal dan ujung tangkai daun. Persendian ini berperan pada pergerakan untuk menyesuaikan dengan arah datangnya sinar matahari. Bentuk helai daun bulat memanjang, ujung daun meruncing, dan pangkal daun runcing. Susunan tulang daun menyirip dan tulang daun menonjol ke permukaan bawah helai daun. Warna daun dewasa yaitu hijau tua. Panjang daun dewasa 30 cm dan lebarnya 10 cm. Permukaan daun mengkilap dan licin (PPKKI 2004).
Kakao merupakan tanaman yang kaulifloral, yaitu bunga tumbuh dan berkembang dari bekas ketiak daun pada batang dan cabang (PPKKI 2004). Tanaman ini mempunyai bunga yang berwarna merah muda sampai putih, reguler, hermafrodit, sebuah ovari superior yang merupakan gabungan dari lima karpel, memiliki lima sepal, lima petal, dan 10 stamen (Tjasadiharja 1987). Menurut Siregar et al., (2004) kelopak daun bunga kakao berwarna putih dan kadang-kadang makin ke ujung warna kelopak terlihat ungu kemerahan. Mahkota bunga bentuknya seperti cawan, mempunyai panjang 8-9 mm dan berwarna putih kekuningan atau putih kemerahan. Bunga kakao akan muncul secara bergerombol pada bantalan bunga. Bantalan bunga yaitu jaringan yang menebal pada ketiak bekas menempelnya tangkai daun. Waktu yang diperlukan dari munculnya bakal bunga sampai mekar yaitu 30 hari. Bila saat mekar bunga tidak mengalami penyerbukan maka bunga akan gugur (Tjasadiharja 1987). Pembungaan kakao dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu umur tanaman, status nutrisi, korelasi internal, aktivitas kambium, naungan, suhu, distribusi hujan dan kelembapan.
Warna buah kakao ketika muda yaitu hijau agak putih dan berwarna kuning jika masak. Selain itu ada juga jenis lain yaitu berwarna merah ketika muda dan berwarna jingga ketika masak. Buah akan masak setelah berumur enam bulan. Biji tersusun dalam lima baris mengelilingi poros buah. Jumlahnya beragam yaitu 20-50 butir per buah. Pembuahan kakao dipengaruhi oleh beberapa hal yaitu jumlah bunga yang tumbuh, persentase bunga yang diserbuki, persentase bunga yang dibuahi, persentase buah muda yang mampu berkembang sampai
masak (PPKKI 2004). Bentuk bunga kakao dapat dilihat pada Gambar 1 (Hinsley 2010). Se Pe Sta Std Pi
Gambar 1 Bagian bunga kakao, stamen (Sta), sepal (Se), petal (Pe), pistil (Pi) dan staminod (Std).
Gen Pembungaan
Perkembangan organ bunga sangat penting pada proses pembungaan. Pembentukan organ ini dikendalikan oleh gen-gen yang berperan pada proses tersebut. Pengembangan gen pada bunga dapat diisyaratkan menjadi model ABC. Model ini mengkoordinasikan ekspresi dan fungsi dari gen menjadi transkripsi A, B dan C. Aktivitas transkripsi tipe A disandikan oleh gen APETALA1 (AP1) dan APETALA2 (AP2) yang mengontrol pembentukan sepal dan petal. Tipe B yang disandikan oleh gen APETALA3 (AP3) dan APETALA1 (AP1) mengontrol pembentukan petal dan stamen. Sedangkan tipe C disandikan oleh gen AGAMOUS (AG) yang mengontrol perkembangan stamen dan karpel (Pinero & Couplan 1998).
Gen AGAMOUS merupakan keluarga dari gen MADS-Box (MCM1, AGAMOUS, DEFICIENS, and SRF) yang diperlukan dalam pembentukan identitas bunga (Bao et al., 2004). Gen yang berperan dalam mengontrol pembentukan stamen dan karpel ini, ekspresinya dapat ditekan oleh gen lain yaitu gen BELLRINGER (BELL) sehingga pengaruh dari gen AG dalam pembentukan meristem bunga dan inflorensia menjadi terhambat (Bao et al., 2004). Menurut Jordan (2006) ekspresi AG bisa ditekan oleh gen lain yaitu gen APETALA2 (AP2),
LEUNIG (LUG), SEUSS (SEU), STERILE APETALA (SAP), CURLY LEAF (CLF), INCURVATA2 (ICU2) dan BELLRINGER (BELL).
Chaidamsari (2005) melaporkan bahwa kloning dari cDNA encoding TcAG (homolog AG dari kokoa) telah diekspresikan pada stamen dan ovari, yang dibandingkan dengan AG pada Arabidopsis. Gen TcAG selalu diekspresikan pada dinding buah (sebagian kecil) selama perkembangan. Kakao homolog dari AG pada Arabidopsis (TcAG) berpengaruh pada pembentukan kelopak bagian dalam dari organ pembungaan, staminode, stamen dan ovari. Pada tanaman yang lain, TcAG hanya terekspresi pada pembungaan dan predominan pada staminode, stamen dan ovari. Homolog gen pembungaan kakao pada Arabidopsis berpengaruh baik pada koregulasi inisiasi pembungaan dan berpengaruh juga pada determinasi identitas dari sepal dan petal (Chaidamsari 2005).
Gen LFY diketahui mampu mengaktifkan ekspresi dari gen kelas A, kelas B dan kelas C (Gambar 2) (Jordan 2006). Model ekspresi dari gen A, B dan C diperlihatkan pada Gambar 3. Ekspresi AG diketahui diaktifkan oleh LFY dan protein LFY yang berperan untuk mengikat in vitro pada intron kedua AG. Pembatasan berikutnya dari transkripsi AG ke pada perkembangan bunga adalah hasil dari kombinasi aktivitas LFY dan WUSCHEL (WUS). Gen WUS mengkodekan homeodomain faktor transkripsi yang diperlukan untuk menentukan proliferasi seluler dalam meristem. Keberadaan LFY dinyatakan kuat dalam organ bunga muda primordia dan meristem bunga. Gen LFY juga terlibat dalam aktivasi ekspresi AP1 dan CAL. Gen LFY memiliki efek yang kuat pada identitas meristem karena mengaktifkan transkripsi dari rangkaian gen lain (Glover 2007).
Jenis gen kakao lain yang mengkode faktor transkripsi dari kelas MADS-box yang diperkirakan mempengaruhi regulasi waktu pembungaan dan pembentukan bunga yaitu Theobroma cacao L. APETALA1 (TcAP1) (Chaidamsari 2005). Gen TcAP1 diekspresikan pada pembungaan dan dalam bunga predominan terekspresi pada sepal dan petal pada level yang rendah pada organ pembungaan yang lain. Menurut Parcy et al., (1998) protein LFY juga diketahui mampu mengaktifkan ekspresi dari gen AP1 dengan cara mengikat sekuen promoter AP1.
Gambar 2 Aktivasi gen kelas A,B dan C oleh gen LFY (Jordan 2006).
Gambar 3 Model ABC dari perkembangan pembungaan Arabidopsis, fungsi gen kelas A, B dan C yang mempengaruhi bentuk dari meristem bunga (Se: sepal, Pe: petal, St: stamen, Ca: karpel).
Promoter DNA
Promoter adalah bagian gen yang berfungsi sebagai pengatur proses ekspresi genetik (transkripsi) bagian struktural. Promoter ini bagian yang akan dikenali pertama kali oleh enzim RNA polimerase dan protein regulator sebelum proses transkripsi dimulai (Yuwono 2005). Daerah promoter merupakan daerah awal terjadinya sintesis RNA dan proses sintesis ini berlangsung hingga bagian akhir sekuen. Daerah promoter terdiri dari daerah kecil dengan urutan basa-N yang pada umumnya mempunyai urutan yang tetap atau sering disebut TATA-box. TATA-box merupakan bagian DNA yang banyak mengandung basa timin dan adenin dan berada pada bagian upstream dan dilokasikan pada -10 dan -35 bp upstream (Murray et al., 2003). Sekuens pada kotak TATA menentukan titik inisiasi transkripsi secara tepat. Penghilangan kotak TATA pada β-globin menyebabkan penurunan transkripsi secara invitro. Pengubahan sekuens TATA menjadi TAGA atau TAAA akan menghilangkan proses transkripsi (Yuwono 2005).
Kotak TATA mempunyai peranan yang penting dalam proses transkripsi, namun ada banyak gen yang tidak mempunyai kotak TATA. Gen yang tidak mempunyai kotak TATA dapat dikelompokkan menjadi dua kelas yaitu gen house keeping dan gen-gen yang diatur ekspresinya berdasarkan atas perkembangan organisme. Gen house keeping yaitu gen-gen yang diekspresikan secara konstitutif pada semua sel karena gen ini diperlukan dalam metabolisme utama. Gen-gen yang diatur ekspresinya berdasarkan atas perkembangan organisme yaitu gen-gen homeotik yang mengatur perkembangan lalat buah atau gen-gen yang terlibat di dalam perkembangan sistem kekebalan pada mamalia (Yuwono 2005). Posisi promoter dalam suatu gen untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada Gambar 4 (Hunter 2011). Promoter mempunyai aktivitas spesifik pada jaringan atau organ spesifik. Salah satu aktivitas tersebut yaitu dalam hal pengkontrolan ekspresi toksin pada jaringan atau organ spesifik (Chaidamsari 2005).
Gambar 4 Posisi promoter dalam suatu gen (Hunter 2011).
Tanaman Tembakau
Tembakau berkembang luas pada berbagai bagian dunia. Tembakau mempunyai stuktur batang tegak, kuat dan berkayu. Tinggi tanaman bervarisasi tergantung pada varietasnya. Jika kondisi lingkungan baik, maka tingginya bisa mencapai 2 meter. Batang tembakau tidak bercabang, tetapi pada saat berbunga di bagian atas ketiak daun akan tumbuh tunas-tunas lateral. Tunas-tunas tersebut akan tumbuh menjadi sirung atau sulang. Jika batang tembakau rebah, maka tunas-tunas lateral tersebut akan berpotensi tumbuh menjadi sulang. Varietas yang banyak sulang tidak disukai karena pertumbuhannya akan mengurangi zat-zat hara dan nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan daun (Suwarso 1999).
Tembakau merupakan jenis tanaman dikotil yang berakar tunggang. Bentuk daun dipengaruhi oleh posisi di batang. Daun bawah bentuknya lebih bulat dibandingkan daun-daun di atasnya. Daun pucuk bentuknya lebih runcing. Daun ditopang oleh ibu tulang daun dengan cabang-cabang yang berbentuk menyirip. Permukaan atas dan bawah daun terdapat stomata dan bulu-bulu kelenjer (trikom). Stomata lebih banyak terdapat di permukaan bawah daun (Suwarso 1999).
Kingdom : Plantae (Tumbuhan)
Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji) Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga) Kelas : Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil) Sub Kelas : Asteridae
Ordo : Solanales
Famili : Solanaceae (suku terung-terungan) Genus : Nicotiana
Spesies : Nicotiana tabacum L.
Spesies N. Tabacum L. pada umumnya merupakan tanaman hari netral. Waktu pembungaan tidak dipengaruhi oleh lamanya waktu penyinaran matahari. Tanaman akan membentuk karangan bunga di ujung batang pada fase generatif tanaman. Bunga dewasa mempunyai mahkota berbentuk terompet sepanjang 4-5 cm yang mempunyai lima lekuk di bagian tepinya. Mahkota bunga berwarna merah muda pada bagian atas dan berwarna putih pada bagian bawahnya. Beberapa saat sebelum bunga mekar, tepung sari telah masak dan kepala putik reseptif sehingga siap menerima tepung sari. Bila penyerbukan berhasil, pembuahan akan terjadi sekitar 36 jam kemudian. Buah akan mulai masak 3-4 minggu setelah terjadi pembuahan (Suwarso 1999).
Tanaman tembakau mempunyai kecendrungan yang kuat untuk melakukan proses penyerbukan sendiri. Hal ini menjadi salah satu alasan dipilihnya tanaman tembakau sebagai tanaman untuk transformasi. Selain itu pertumbuhan dari tanaman tembakau sangat mudah, proses pembungaan yang cepat dan pembungaan yang tidak dipengaruhi oleh penyinaran (Bock 2007).
Transformasi Tanaman
Transformasi tanaman adalah penyisipan materi genetik asing yang masuk melalui dinding sel tanaman.Teknik transformasi ke tanaman ada banyak macam tetapi secara garis besar dapat dibagi ke dua kelompok yaitu menggunakan bakteri Agrobacterium tumifaciens dan transformasi secara langsung. Transformasi secara langsung antara lain mikroinjenksi, fusi steroplas, fusi liposom, imbisi embrio, injeksi tabung putik, transformasi protoplas, dan penempakan DNA dengan
pendekatan biolistik. Teknik ini dinamakan teknik transformasi secara langsung karena DNA diintroduksi tanpa menggunakan perantara (Loedin 1994).
Transformasi menggunakan Agrobacterium tumifaciens merupakan metode transformasi yang paling sering digunakan. Bakteri gram negatif ini menginfeksi pada tanaman dikotil yang menyebabkan penyakit tumor batang (crown gall). Kemampuan ini didukung oleh keberadaan plasmid Ti pada bakteri. Ketika Agrobacterium tumifaciens menginfeksi tanaman, bagian dari molekul DNA berupa transferred DNA (T-DNA) akan terintegrasi pada DNA kromosom tanaman. sifat unik ini memungkinkan plasmid Ti menjaid alat transpor dari gen lain dengan menyisipkan gen asing tersebut pada T-DNA. Kemudian dengan teknik transformasi Agrobacterium tumifaciens diinfeksikan pada sel tanaman. Teknik ini telah berhasil diterapkan pada tanaman tembakau, tomat, pepaya, pisang, kentang, dan tanaman dikotil lainnya (Zupan et al., 2000). Keuntungan dari teknik ini adalah gen yang terintegrasi umumnya hanya satu kopi karena disisipkan pada T-DNA (Loedin 1994).
Plasmid yang digunakan untuk transformasi dinamakan juga dengan vektor. Vektor inilah yang membantu untuk transfer gen ke tanaman. Selain gen target terdapat pula gen reporter. Gen reporter yang biasa digunakan adalah gen Gus penyandi β-glukuronidase, synthetic green fluorescent protein (sGFP), luciferase (LUC), enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), dan enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) (Nakagawa 2007). Hasil positif Gus adalah terdapatnya warna biru sedangkan GFP terdapatnya warna hijau. Analisis yang tercepat untuk menunjukkan gen terintegrasi secara stabil pada tanaman adalah dengan analisis histokimia enzim gen penanda (gen reporter) dan analisis PCR (Loedin 1994).
Kultur Jaringan
Kultur jaringan adalah metode untuk mengisolasi bagian tanaman berupa sekelompok sel atau jaringan yang ditumbuhkan pada kondisi aseptik, sehingga bagian tanaman tersebut dapat memperbanyak diri menjadi tanaman yang lengkap membentuk daun, batang dan akar. Teknik kultur jaringan ini memanfaatkan perbanyakan secara vegetatif (Hameed et al., 2006).
Sebagian besar metode kultur jaringan menggunakan media garam mineral Murashige & Skoog (MS) sebagai media tanam yang diperkaya dengan sukrosa. Kultur jaringan disebut juga sebagai kultur in vitro. Tanaman yang pertumbuhannya dilakukan secara in vitro termasuk golongan heterotrof (Miller & Chandler 1990). Metode perbanyakan tanaman secara in vitro dapat dilakukan melalui perbanyakan tunas dari mata tunas apikal, melalui pembentukan tunas adventif, dan embriogenesis somatik. Jaringan yang digunakan sebagai eksplan dalam kultur jaringan yaitu jaringan muda yang belum mengalami diferensiasi dan masih aktif membelah sehingga memiliki kemampuan regenerasi yang tinggi. Jaringan tipe pertama ini biasa ditemukan pada tunas apikal, tunas aksiler, bagian tepi daun, ujung akar, maupun kambium batang. Tipe jaringan lain yang digunakan yaitu jaringan parenkim. Jaringan parenkim yaitu jaringan penyusun tanaman muda yang sudah mengalami diferensiasi dan menjalankan fungsinya. Contoh jaringan tersebut yaitu jaringan daun yang telah mampu melakukan aktivitas fotosintesis dan jaringan batang atau akar yang berfungsi sebagai tempat cadangan makanan (Evert et al., 2006).
Tanaman yang spesifik membutuhkan media tanam yang spesifik pula (Miller & Chandler 1990). Tanaman kentang yang dikulturkan pada media MS dengan dua kali unsur makro yang ditambah 60 g/L sukrosa dapat meningkatkan vigor tanaman akan tetapi tanaman akan menjadi lebih pendek, jumlah daun menjadi sedikit, diameter menjadi lebih sempit, dan percabangan lebih banyak (Purwito 1999). Menurut Hapsoro (1999) peningkatan konsentrasi sukrosa menyebabkan penurunan jumlah tunas dan panjang tunas pada tanaman famili.
Nutrien anorganik ditambahkan pada tanaman kultur dalam bentuk garam mineral. Bahan mineral yang diberikan tersebut dapat berupa kation dan anion. Seperti contoh kalsium, magnesium dan kalium diserap oleh akar tanaman kultur jaringan dalam bentuk kation Ca2+, Mg2+ and K+. Nitrogen diserap dalam bentuk anion NO3 dan kation NH4+. Tanaman kultur jaringan juga menyerap fosfat dalam bentuk ion HPO42- and H2PO4- dan menyerap sulfat dalam bentuk ion SO42-.
Sistem penyerapan pada kultur jaringan dipengaruhi oleh konsentrasi unsur lainnya, pH, suhu, dan status biokimia atau fisiologis tanaman jaringan. Faktor-faktor ini dapat dikendalikan oleh akar dalam menentukan keseimbangan
ioniknya. Misalnya, Mg2+ bersaing dengan kation lain untuk proses pengambilannya. Jika kondisi K+ tinggi maka konsentrasi Ca2+, Mg 2+ akan mengalami kekurangan. Penyerapan aktif fosfat terjadi jika pH larutan menjadi sedikit basa ketika ion (H2PO4) - berubah menjadi (HPO4)2 -. Amonium lebih mudah digunakan dibandingkan nitrat pada suhu rendah. Serapan amonium ke dalam sel tanaman ditingkatkan pada kondisi tingkat karbohidrat yang tinggi di dalam sel. Kalsium tidak diserap secara efisien dan konsentrasi dalam jaringan tanaman cenderung proporsional dengan yang ada di tanah (George 1996).
Tanaman relatif tidak sensitif terhadap ion sulfat. Jika konsentrasi fosfat terlarut tinggi maka bisa menekan pertumbuhan. Hal ini karena melalui proses kompetitif yang mengurangi penyerapan unsur-unsur minor Zn, Fe dan Cu. Proses penyerapan mineral pada tanaman kultur jaringan bisa terjadi melalui stomata daun dan dilanjutkan ke pembuluh xilem. Ketika eksplan yang pertama ditempatkan pada media, terdapat kebocoran ion dari sel yang rusak, terutama kation (Na+, Ca2+, K+, Mg2+) untuk 1-2 hari pertama, sehingga konsentrasi dalam jaringan tanaman benar-benar menurun. Penyerapan aktif dimulai dan konsentrasi internal sel perlahan-lahan naik. Fosfat dan nitrogen (terutama amonium) diserap lebih cepat dari ion yang lain (George 1996).