Preservasi Ovarium
Preservasi jangka pendek ovarium diperlukan untuk transportasi ovarium, terutama jika lokasi sumber ovarium jauh dari laboratorium. Teknik penyimpanan ovarium jangka pendek telah dicoba pada kambing (Silva et al. 2000, Carvalho et al. 2001), pada sapi (Lucci et al. 2004), babi (Lucci et al. 2007), dan anjing (Lopes et al. 2009, Lima et al. 2010). Secara umum hasilnya menunjukkan bahwa suhu 4 oC memungkinkan preservasi folikel selama 18 atau 24 jam, sedangkan pada suhu 20 oC mampu mempreservasi folikel selama 4 atau 6 jam.
Kriopreservasi potongan jaringan cortex atau ovarium utuh memungkinkan penyimpanan jaringan ovarium jangka panjang. Kriopreservasi diaplikasikan diantaranya untuk mempertahankan fungsi ovarium, mempertahankan spesies yang terancam punah, dan menyelidiki fenomena folikulogenesis awal (Onions et al. 2008). Bagi pasien penderita kanker yang menjalani kemoterapi, kriopreservasi adalah alternatif untuk mempertahankan fungsi ovarium (Amorim et al. 2009). Kriopreservasi jaringan ovarium merupakan satu-satunya pilihan yang tersedia bagi wanita yang belum pubertas dan wanita yang tidak dapat menunda awal kemoterapi (Gosden et al. 2002). Jaringan ovarium dapat dibekukan mengunakan tiga pendekatan berbeda: sebagai fragmen cortex ovarium (Tsuribe et al. 2009, Muruvi et al. 2009), sebagai keseluruhan ovarium (Bedaiwy et al. 2006, Onions et al. 2008) atau folikel-folikel terisolasi (Donnez et al. 2006).
Folikel bukan objek ideal untuk kriopreservasi karena bersifat multiseluler dan heterogen. Untuk melindungi folikel selama pembekuan, banyak air harus digantikan oleh agen krioprotektan dan banyak diantaranya bersifat toksik dan konsentrasi yang dibutuhkan tinggi (Gosden et al. 2002). Keseimbangan harus diperhatikan dalam mengoptimalkan konsentrasi krioprotektan, lama pemaparan dan laju pendinginan serta pencairan kembali. Sebagian besar penelitian-penelitian awal ovarium menggunakan mencit dan tikus sebagai model, ovarium dibekukan dan isografting setelah thawing (Harp et al. 1994, Cox et al. 1996,
Candy et al. 1997, Gunasena et al. 1997). Litter size yang diperoleh dari grafting ovarium hasil kriopreservasi setara dengan grafting ovarium segar (Candy et al. 2000).
Beberapa metode kripopreservasi pada saat ini adalah metode konvensional dengan metode pendinginan lambat (slow freezing) dan pendinginan cepat (rapid freezing) serta metode vitrifikasi sebagai alternatif. Vitrifikasi adalah proses pemadatan cairan yang mengandung krioprotektan konsentrasi tinggi pada suhu -196 oC tanpa pembentukan kristal es sehingga terlihat seperti kaca (Rall & Fahy 1985). Pada metode vitrifikasi konsentrasi krioprotektan yang digunakan lebih tinggi dan laju pendinginan lebih cepat, tidak menimbulkan terbentuknya kristal serta tidak membutuhkan perlatan khusus (Yoeman et al. 2005). Metode vitrifikasi dapat mempertahankan viabilitas folikel preantral lebih baik dibandingkan metode pembekuan konvensional (Chen et al. 2006).
Penggunaan konsentrasi krioprotektan yang tinggi menyebabkan tingginya tingkat toksisitas (Chen et al. 2006). Etilen glikol (EG) merupakan salah satu krioprotektan yang paling rendah tingkat toksisitasnya, daya permeasi cepat sehingga sangat baik digunakan sebagai krioprotektan. Di samping EG, krioprotektan lain yang sering digunakan sebagai kombinasinya adalah dimetilsulfoksida (DMSO) (Lucci et al. 2007).
Gambaran Umum Perkembangan Folikel, Lingkungan dan Medium Kultur
Pada semua spesies mamalia, perkembangan folikel dan oosit mengikuti sekuen-sekuen peristiwa yang muncul seiring terbentuknya ovarium setelah konsepsi dan diakhiri peristiwa ovulasi oosit fertil tahap metaphase II. Sepanjang fase preantral yang panjang dari folikulogenesis mamalia, perkembangan oosit tergantung pada dan berbarengan dengan lapisan-lapisan sel-sel granulosa folikel (Diaz et al. 2007). Komunikasi efektif antara tipe-tipe sel folikel yang berbeda diperoleh melalui kontak gap junction homolog dan heterolog (Picton et al. 2007). Komunikasi antara sel-sel granulosa dan oosit sangat vital untuk mempertahankan pertumbuhan oosit sebab sumber utama nutrien untuk gamet adalah kompartemen somatik (Harris & Picton 2007).
Folikel primordial terdiri dari oosit kecil yang dikelilingi oleh lapisan sel tunggal sel-sel granulosa pipih terletak di membrana basalis. Ketika folikel mulai tumbuh, oosit akan membesar dan sel-sel somatik ekspansi membentuk sel-sel granulosa mural dan sel-sel cumulus dalam folikel de Graaf (Gougeon 1996). Membrana basalis memisahkan folikel dari sel-sel stroma termasuk prekursor lapisan sel-sel theca. Ukuran yang kecil, kurangnya organel-organel sitoplasma dan ketiadaan spindle apparatus membedakan oosit-oosit primordial dari oosit tahap metafase II dan hal ini menguntungkan untuk penyimpanan suhu rendah (Gosden et al. 2002). Folikel-folikel primordial melimpah pada ovarium muda, menurun secara eksponensial seiring umur dan bervariasi sesuai bobot tubuh pada berbagai spesies (Gosden dan Telfer 1987).
Sebagian besar folikel-folikel primordial tidak berkembang lebih lanjut atau gagal mencapai ukuran ovulasi. Pada ovarium rodensia prapubertas kurang lebih setengah dari folikel berdegenerasi (atresia), proses tersebut tampak lebih jelas pada folikel antral. Atresia folikel ini melibatkan apoptosis (Tilly 1999). Kemungkinan apoptosis dimulai pada sel-sel kecambah folikel-folikel primordial dan tidak tergantung level gonadotropin, sedangkan pada tahap preantral besar dan antral proses tersebut tergantung pada gonadotropin dan ketiadaan hormon menginisiasi apoptosis sel-sel granulosa sebelum oosit dipengaruhi (Gosden et al. 2002).
Selama pertumbuhan folikel, volume dan diameter oosit meningkat sebagai akibat akumulasi air, ion, karbohidrat dan lipid (Fair et al. 1997), sebagai contoh pada mencit kenaikan volume dari folikel primordial ke folikel praovulasi mencapai 150 kali (Pan et al. 2005). Perubahan morfologis dan kerangka waktu perkembangan folikel dan oosit sudah terkarakterisasi pada berbagai spesies (Peters et al. 1975, Gougeon 1996, McNatty et al. 1999), pada domba pembentukan antrum terjadi ketika diameter folikel sekitar 250 μm (Picton et al. 2008). Pada tahap ini sebagian besar pertumbuhan oosit sudah sempurna. Sebaliknya, perbedaan-perbedaan spesifik spesies telah diketahui dalam sejumlah parameter: i) keseluruhan waktu folikulogenesis dan oogenesis; ii) ukuran folikel ovulatoris dan oosit matang; iii) perbedaan kondisi alami, konsentrasi dan pengaruh growth factor yang memperantarai produksi folikel dan oosit in vivo
(Picton et al. 2008). Perbedaan-perbedaan ini sangat relevan ketika mengembangkan sistem yang mendukung pertumbuhan dan maturasi folikel dan oosit.
Dalam kultur folikel in vitro diperlukan optimasi pH, suhu dan oksigen untuk memaksimalkan potensi oosit-oosit yang dihasilkan (Ye et al. 2007). Sebagai contoh, meskipun jaringan ovarium marmut dipaparkan ke level oksigen plasma sekitar 5% in vivo, folikel mencit yang ditumbuhkan in vitro dalam 5% oksigen menghasilkan lebih banyak oosit matang dengan kelainan kromosom dan banyak yang mati secara prematur dibandingkan folikel yang dikultur dalam 20% oksigen (Hu et al. 2001). Hal serupa terjadi pada domba, folikel-folikel domba yang ditumbuhkan dalam 5% oksigen menurunkan pembentukan antrum dan meningkatkan konsumsi laktat dan glukosa dibandingkan dengan 20% oksigen (Jin et al. 2007). Suhu medium yang digunakan untuk transportasi dan penanganan sebelum pemanenan harus dioptimalkan untuk meminimalkan apoptosis (Schmidt et al. 2003, Lucci et al. 2004)
Sejumlah sistem kultur yang berbeda telah dicoba untuk menumbuhkan folikel dari spesies-spesies yang memiliki perbedaan spesifik spesies. Pada semua protokol kultur folikel in vitro, penting untuk mengoptimalisasi: i) suplai nutrien, elektrolit, antioksidan, asam-asam amino, substrat energi, vitamin, dan growth factor; ii) penghilangan produk-produk sisa seperti ammonia yang dapat terakumulasi karena produk sisa metabolisme ini dapat menekan pertumbuhan folikel (Kerr et al. 2006). Berbagai medium dasar telah dipakai untuk kultur folikel dari spesies yang berbeda diantaranya minimum essential medium (MEM) (Cortvrindt et al. 1996, Kerr et al. 2006), Waymouth medium (Muruvi et al. 2005) dan Mc Coy’s medium (Telfer et al. 2008). Medium-medium basal tersebut perlu dilengkapi bahan-bahan tambahan yaitu antibiotik/antimikotik; sediaan komersial insulin, transferrin, dan selenium (Wright et al. 1999).
Pertimbangan penting dalam menyusun medium kultur folikel in vitro adalah tipe dan konsentrasi substrat energi dalam medium basal. Penelitian menunjukkan bahwa glukosa adalah sumber energi yang umum bagi hampir semua tipe sel hewan, tetapi kemudian diketahui bahwa oosit matang pada banyak spesies mamalia termasuk mencit (Harris et al. 2008), sapi (Gandolfi et al. 1998),
dan manusia (Roberts et al. 2002) lebih cenderung memetabolisme piruvat dan punya sedikit kapasitas untuk metabolisme glukosa. Oosit mencit diketahui berkemampuan tinggi untuk mengkonsumsi piruvat dan oksigen pada semua tahap perkembangan folikel (Harris et al. 2008) sedangkan konsumsi glukosa berada di bawah level yang dapat dideteksi (Harris et al. 2007).
Kultur Folikel Preantral
Penelitian-penelitian yang dilakukan untuk mengkultur folikel dengan berbagai metode lebih intensif dilakukan pada rodentia sebagai model dan telah dicapai beberapa keberhasilan (Picton et al. 2008). Kemajuan dalam kultur folikel rodensia sulit direplikasikan pada ruminansia dan manusia. Salah satu alasan utama kurangnya kemajuan adalah kesulitan teknis yang lebih besar untuk mengisolasi folikel sebab jaringan cortex lebih padat dan fibrous (Telfer 1996) dan isolasi folikel seringkali membutuhkan protokol berbasis enzim yang agresif (Demeestere et al. 2002).
Keberhasilan kultur folikel preantral terkendala oleh kompleksitas sinyal-sinyal, interaksi sel-sel dan sel-stroma yang diperlukan untuk menduklung pertumbuhan folikel-folikel tahap awal (Demeestere et al. 2005). Dalam dekade terakhir kemajuan dicapai pada teknik kultur dua dimensi untuk mernumbuhkan folikel preantral in vitro (Von Wolff et al. 2009, Cortvrindt et al. 1996, Liu et al. 2001). Folikel-folikel yang dikultur dalam sistem dua dimensi harus melekat ke pemukaan kultur datar dimana sel-sel somatik bermigrasi dari oosit merubah struktur tiga dimensi asal merusak interaksi sel-sel somatik-gamet yang penting untuk pertumbuhan oosit normal (West et al. 2007). Walaupun demikian, pada mencit seluruh tipe sel folikel tetap kontak dan respon terhadap stimulasi gonadotropin dipertahankan (Picton et al. 2008).
Granulosa-oosit complex tumbuh optimal pada kepadatan sedang (~200/well) pada membran collagen yang memungkinkan folikel-folikel melekat dengan penyebaran terbatas. Dengan menggunakan defined medium mengandung albumin, ITS, dan hypoxantine (untuk mencegah meiosis prematur) oocytes dari folikel-folikel preantral anak mencit matang untuk IVF setelah inkubasi selama 10 hari (Eppig et al. 1992). Folikel-folikel utuh juga dapat ditumbuhkan pada
membran berpori (Nayudu dan Osborn 1992) atau dalam microdrop medium dibawah mineral oil dengan 75% folikel menghasilkan oosit tahap metafase 2 (Demeestere et al. 2002). Penambahan hCG dalam medium menghasilkan 80% folikel yang ovulasi in vitro (Rose et al. 1999).
Sistem kultur in vitro tiga dimensi yang menyerupai arsitektur internal ovarium tampaknya optimal untuk mendukung pertumbuhan folikel dan maturasi oosit. Beberapa tahun terakhir, telah dibuktikan kemungkinan untuk memelihara integritas tiga dimensi dari folikel ruminansia (Newton et al. 1999, Gutierrez et al. 2000, Thomas et al. 2007) dan folikel manusia (Picton et al. 1999, Telfer et al. 2008). Filosofi sistem ini adalah mengkultur sel granulosa dalam formasi dan bentuk yang menyerupai morfologi (Chang et al. 1977) dan fenotipe steroidogenik sel-sel granulosa in vivo (Picton et al. 1999) dibandingkan karakter fibroblastik karena perlekatan dengan permukaan cawan kultur. Sistem yang spesifik spesies ini mempertahankan integritas folikel dan folikel tetap dalam ultrastruktur normalnya (Jin et al. 2004). Dengan menggunakan sistem ini, pertumbuhan folikel dapat dimanipulasi dengan ada atau tidaknya lapisan sel theca seperti halnya komponen membrana basalis dalam medium kultur. Sel-sel theca mempunyai efek biokimia terhadap pertumbuhan dan perkembangan oosit in vitro yang dimediasi oleh sel-sel granulosa (Richard & Sirard 1996).
Sistem kultur folikel tiga dimensi dengan menggunakan alginat mendukung pertumbuhan dan maturasi folikel-folikel sekunder (Kreeger et al. 2006, Xu et al. 2009). Sistem ini menghasilkan oosit yang kompeten dan dapat difertilisasi serta menghasilkan keturunan yang normal (Xu et al. 2006a). Konsentrasi matrix hidrogel alginat dapat dimodifikasi untuk mendukung pertumbuhan folikel sekunder awal (Xu et al. 2006b).
Pembentukan antrum mencapai 50% dari folikel-folikel sekunder domba dengan ukuran awal 180-220 µm setelah 12-14 hari kultur dan pertumbuhan didukung sampai diameter 1,2 mm setelah 30 hari baik jaringan segar maupun hasil kriopreservasi (Newton et al. 1999). Potensi kultur folikel tiga dimensi telah dicoba pada spesies lain yaitu babi (Wu et al. 2001), sapi (Gutierez et al. 2000, McCaffery 2000, Thomas et al. 2007) dan juga manusia (Picton et al. 1999, Telfer et al. 2008).
Isolasi mekanik dan kultur in vitro juga telah dicoba pada folikel manusia (Abir et al. 1997) walaupun tingkat atresia setelah kultur tinggi. Telfer et al. (2008) mengisolasi folikel preantral manusia secara mekanik dari jaringan cortex setelah jaringan dikultur selama 6 hari. Folikel dikultur lanjut secara individual, pembentukan antrum terjadi dengan cepat yaitu dalam dua hari.
Regulator Perkembangan Folikel
Folikulogenesis merupakan proses perkembangan yang kompleks yang diatur oleh berbagai faktor endokrin, parakrin, dan autokrin (Thomas et al. 2003, Demeestere et al. 2005, Gambar 1.), juga koneksi sel-sel dan sel-matriks intraovarian (Irving-Rodgers & Rodgers 2005). Interaksi antarsel yang krusial bagi pertumbuhan diantaranya antara sel-sel theca dan sel-sel granulosa. Sel-sel theca diketahui memproduksi transforming growth factors (TGFs) α dan β, hepatocyte growth factor (HGF), dan keratinocyte growth factor (KGF) untuk mengatur pertumbuhan dan fungsi sel-sel granulosa (Nilsson et al. 2001, Demeestere et al. 2005). Sebaliknya sel-sel granulosa memproduksi kit ligand yang mengatur pertumbuhan sel-sel theca dan menstimulasi produksi TGFs, HGF, dan KGF (Parrot et al. 1998, Nilsson et al. 2001).
Penelitian menunjukkan bahwa oosit mensekresikan faktor-faktor yang menginisiasi pertumbuhan folikel primordial dan mengatur aksi gonadotropin follicle stimulating hormone (FSH) dan luteinizing hormone (LH) terhadap pertumbuhan folikel preantral dan antral (Knight & Glister 2006, Mc Natty et al. 2007). Banyak yang diduga sebagai regulator folikulogenesis in vivo telah teridentifikasi. Tyrosine kinase receptor Kit dan dua isoform ligand yang berbeda (kit ligand, KL) terdeteksi di oosit dan sel-sel granulosa, faktor ini mendorong pertumbuhan oosit dan mempertahankan meiotic arrest sebagai respon terhadap level reseptor FSH (FSHR). Konsentrasi FSH yang rendah mendorong pertumbuhan oosit dengan menurunkan rasio KL-1/KL-2, sedangkan jika konsentrasi FSH tinggi perkembangan folikel meningkat tetapi pertumbuhan oosit terganggu (Thomas & Vanderhyden 2007). Regulator lain meliputi epidermal growth factor (EGF, Qu et al. 2000) dan reseptornya; activin (Telfer et al. 2008); basic fibroblastic growth factor (bFGF, Shikone et al. 1992), anggota-anggota
insulin-like growth factor (IGF) dan protein-protein pengikatnya (Thomas et al. 2007), anggota-anggota TGFβ (Knight & Glister 2006).
Gambar 1. Faktor - faktor yang terlibat dalam pengontrolan perkembangan folikel : efek
negatif(anak panah merah), efek positif (anak panah kuning). GDF, growth
differentiation factor-9; KGF, keratinocyte growth factor; GH, growth hormone; IGF-I,
insulin growth factor-I; KL, kit ligand; LIF, leukemia inhibitory factor; EGF, epidermal
growth factor; BMP-15, bone morphogenic protein-15; HGF, hepatocyte growth factor;
MIS, mullerian-inhibiting substance; FSH, follicle-stimulating hormone; LH,
luteinizing hormone; R-LH dan R-FSH, receptors for LH dan FSH; Testo, testosterone;
GCs, granulosa cells. (Demesteere et al. 2005).
Beberapa anggota TGFβ (Transforming Growth Factor) superfamily mempunyai peran penting selama perkembangan folikel. TGF-TGF ini diproduksi baik oleh oosit maupun sel-sel somatik di sekelilingnya (sel-sel theca dan granulosa). Pro-protein convertase adalah anggota dari tujuh protein yang dikenal yang memproses ligan-ligan TGF serta produk yang disekresikan lainnya ke bentuk aktifnya (Diaz et al. 2007)
TGF-β superfamily mencakup faktor-faktor seperti activin, inhibin, growth differentiation factor (GDF-9), bone morphogenic protein (BMP), anti-mullerian hormone (AMH) yang mempengaruhi perkembangan folikel. GDF-9 dan BMP-15 diekspresikan oleh oosit primer dan folikel antral dan memainkan peranan penting dalam rekruitmen folikel awal. GDF-9 dan BMP-15 dapat menstimulasi proliferasi sel-sel granulos dalam folikel-folikel preantral melalui mekanisme
yang tergantung FSH (Shimasaki et al. 2004), dan mendorong biosintesis kolesterol dalam sel-sel cumulus (Su et al. 2008). Activin A telah dibuktikan dapat meningkatkan proliferasi sel-sel granulosa dalam kultur folikel in vitro tikus (Li et al. 1995), meningkatkan perkembangan folikel primordial manusia untuk membentuk folikel antral dengan oosit yang utuh (Telfer et al. 2008).
Faktor lain yang diketahui dapat mendorong perkembangan folikel preantral adalah EGF. Konsentrasi fisiologis EGF pada kultur folikel mencit adalah 1 ng/ml, pada konsentrasi ini EGF meningkatkan jumlah folikel yang mencapai tahap antral (Demeestere et al. 2005). Perlakuan EGF pada sel-sel granulosa dan folikel-folikel menghambat onset spontan cleavage DNA apoptosis selama kultur sebesar 40-60% melalui jalur tirosin kinase. EGF juga berperan dalam memediasi aksi LH dalam proses ovulasi (Park et al. 2004, Ashkenazi et al. 2005). Dole et al. (2008) menemukan bahwa suatu faktor yang disebut glial-derived neurotrophic factor (GDNF) mendorong perkembangan folikel primordial dan memediasi interaksi sel-sel autokrin dan parakrin yang diperlukan selama folikulogenesis.
Maturasi Oosit dan Ovulasi
Pada mamalia, meiosis terjadi dalam waktu yang panjang. Oogonia mengalami meiosis tetapi terhenti pada tahap diploten profase pertama (Eppig et al 2004). Meiosis akan dimulai kembali akibat pengaruh LH dari kelenjar pituitari selama siklus estrus atau menstruasi beberapa saat sebelum ovulasi. Proses oosit menyelesaikan pembelahan meiosis pertama dan mengalami perubahan sitoplasma kemudia berlanjut ke metafase II dikenal dengan maturasi oosit (Mehlmann 2005).
Selama perkembanganan folikel, sel-sel somatik membelah dan membentuk beberapa lapisan, oosit membesar, dan antrum mulai terbentuk. Beberapa folikel direkrut untuk melanjutkan pertumbuhan, keberhasilan pertumbuhan tergantung pada FSH (Wu et al. 2007, Zeleznik 2004). Setelah terbentuknya antrum, sel-sel granulosa terbagi menjadi dua kompartemen yaitu sel-sel granulosa mural yang membentuk lapisan luar dan sel-sel cumulus yang mengelilingi oosit. Oosit tumbuh ke ukuran maksimumnya tetapi tetap bertahan di
profase I (Eppig et al. 2004). Meiotic arrest tersebut diatur oleh level cAMP dalam oosit (Conti et al. 2002, Eppig et al. 2004).
Reseptor-reseptor LH berada di sel-sel granulosa mural tetapi tidak ada di sel-sel cumulus atau oosit (Peng et al. 1991, Eppig et al. 1997) sehingga mekanisme stimulasi maturasi oosit oleh LH bersifat tidak langsung. Aksi LH terhadap sel-sel granulosa mural diterjemahkan ke dalam perubahan molekul-molekul sinyal di dalam oosit untuk menginisiasi pembelahan meiosis (Mehlmann 2005). Sebelum pertengahan siklus surge LH, oosit yang sedang tumbuh membutuhkan kemampuan untuk melakukan proses maturasi. Kemampuan tersebut diperoleh di sekitar waktu pembentukan antrum (Mehlmann et al. 2004) dan berkaitan dengan pencapaian level ambang protein-protein yang mempromosi maturasi seperti CDK1 (cyclin-dependant kinase) dan cyclin pada oosit (Kanatsu-Shinohara et al. 2000).
Mekanisme aksi LH pada sel-sel granulosa kemudian menggertak oosit memulai meiosis belum diketahui (Mehlmann 2005). Beberapa penelitian menunjukkan bagaimana sinyal LH ditransmisikan dari eksterior ke interior folikel. Sel-sel granulosa mural mengekspresikan RNA yang mengkode protein-protein epidermal growth factor (EGF)-like dalam 1–3 jam setelah stimulasi reseptor LH (Park et al. 2004, Ashkenazi et al. 2005). Protein-protein tersebut khususnya amphiregulin dan epiregulin, mendorong proses maturasi oosit baik yang masih ada dalam folikel maupun cumulus oocyte complex (COC) di luar folikel (Coticchio et al. 2004, Mehlmann 2005). Protein-protein tidak dapat mendorong maturasi pada oosit tanpa sel-sel cumulusnya (Mehlmann 2005). Park et al. (2004) melaporkan bahwa penghambatan secara farmakologis reseptor EGF pada folikel yang dikultur menghambat maturasi oosit yang diinduksi LH.
Maturasi oosit adalah fase akhir dari folikulogenesis in vitro. Optimasi medium kultur untuk maturasi sangat diperlukan (Filali et al. 2008) seperti halnya menguji peran zat-zat tambahan yang relevan secara fisiologis seperti human chorionic gonadotrophin (hCG, Ge et al 2008), umbiliocal cord blood (Zhang et al. 2007), dan FCS (van Wagtendonk-de Leeuw et al. 2000). Demeestere et al. (2005) melaporkan bahwa penambahan LH dan EGF pada akhir periode kultur in vitro folikel preantral meningkatkan perolehan oosit matang.
Bersaman dengan proses maturasi akhir dari oosit, inisiasi ovulasi juga berlangsung. Ovulasi in vivo terjadi karena kombinasi antara mekanisme yang meliputi: (a) mekanisme neuroendokrin dan endokrin, LH-RH, steroid, dan prostaglandin; (b) mekanisme neurobiokimia dan farmakologi; (c) mekanisme neuromuscular dan neurovascular, dan interaksi enzimatik (Hafez 1993). Ovulasi dimediasi oleh sinyal-sinyal intraovarian yang kompleks (Russel & Robker 2007, Gambar 2).
Gambar 2. Sinyal-sinyal intraovarian yang memediasi ovulasi pada mencit. Gdf-9, growth and differentiation factor-9; BMP-15, bone morphogenetic protein-15; PGE2,
prostaglandin E2; EP2, PGE2 receptor. LH-R, luteinizing hormone receptor; FSH-R,
follicle-stimulating hormone receptor; ErbB, Egf receptor family; Alk5, activin receptor-like kinase-5; BMPRII, BMP receptor type-II; LGR8, Insl3 receptor; IL-1R,
interleukin-1 receptor. (Russell & Robker 2007)
LH surge dari hipotalamus menginisiasi sinyal-sinyal sekunder dari folikel yang terpusat pada COC. Di kompartemen theca. LH bekerja pada sel-sel theca atau leukosit untuk menginduksi sekresi Insl-3 dan IL-1. Di lapisan granulosa mural, Egf-L (ampiregulin, epiregulin dan betacellulin) diproduksi dan mentranduksi sinyal ovulasi ke sel-sel cumulus. FSH bekerja secara langsung pada reseptor-reseptor yang diekspresikan sel-sel mural dan sel-sel cumulus. IαI
memasuki cumulus complex dari sirkulasi. Di dalam COC, GDF-9 dan atau BMP-15 dari oosit mempengaruhi sel-sel cumulus secara parakrin melalui dimer reseptor Alk5/BMPRII. Prostaglandin E2 (PGE2) bekerja secara autokrin melalui reseptor PGE2 (EP2)(Russel & Robker 2007).
DAFTAR PUSTAKA
Abir R, Roizman P, Fisch B, Nitke S, Okon E, et al. 1999. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours. Hum Reprod 14: 1299–1301.
Allan CM, Wang Y, Jimenez M, Marshan B, Spaliviero J, et al. 2006. Follicle-stimulating hormone increase primordial follicle reserve in mature female hypogonadal mice. Endocrinology 188: 549-557.
Amorim CA, Van Langendonckt A, David A, Dolmans MM, Donnez J. 2009. Survival of human pre-antral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicular isolation and in vitro culture in a calcium alginate matrix. Hum Reprod 24(1): 92–99.
Ashkenazi H, Cao X, Motola S, Popliker M, Conti M, et al. 2005. Epidermal growth factor family members: endogenous mediators of the ovulatory response. Endocrinology 146: 77-84.
Attisano L, Carcamo J, Ventura F, Weis FM, Massague J, et al. 1993. Identification of human activin and TGF beta type I receptors that form heteromeric kinases complexes with type II receptors. Cell 75: 671-680.
Baird DT, Webb R, Campbell BK, Harkness LM, Gosden RG. 1999. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts
stored at -196oC. Endocrinology 140:462–471.
Bedaiwy MA, Hussein MR, Biscotti C, Falcone T. 2006. Cryopreservation of intact human ovary with its vascular pedicle. Hum Reprod 21 (12): 3258– 3269.
Candy CJ, Wood MJ, Whittingham DG. 1997. Effect of cryoprotectants on the survival of follicles in frozen mouse ovaries. J Reprod Fertil 110:11-19. Candy CJ, Wood MJ, Whittingham DG. 2000. Restoration of a normal
reproductive lifespan after grafting of cryopreserved mouse ovaries. Hum Reprod 15:1300-1304.
Carvalho FCA, Lucci CM, Silva JRV, Andrade ER, Bao SN, et al. 2001. Effect of Braun-Collins and Saline solutions at different temperatures and incubation
times on the quality of goat preantral follicles preserved in situ. Anim. Reprod Sci 66: 195–208.
Chang SCS, Anderson W, Lewis JC, Ryan RJ, Kang YH. 1977. The porcine ovarian follicle. II. Electron microscopic study of surface features of granulosa cells at different stages of development. Biol Reprod 16: 349– 357.
Chen SU, Chien CL, WuMY, Chen TH, Lai SM, et al. 2006. Novel direct cover vitrification for cryopreservation of ovarian tissues increases follicle viability and pregnancy capability in mice. Hum Reprod 21(11): 2794– 2800.
Conti M, Andersen CB, Richard F, Mehats C, Chun SY, et al. 2002. Role of