Transformasi genetik Oryza sativa L. kultivar Kasalath dan Nipponbare dilakukan menggunakan eksplan yang berupa kalus skutella yang diperoleh dari biji padi (mature seeds). Kalus ini diperoleh dari skutella yang ditumbuhkan pada media induksi kalus yaitu 2N6 yang mengandung zat pengatur tumbuh (ZPT) 2.4 D dengan konsentrasi 2.0 mg/L. 2,4 D merupakan salah satu zat pengatur tumbuh yang digunakan secara luas untuk menginduksi kalus (Tokiet al. 2006; Hiei dan Komari 2008; Wanichanan et al. 2010). Kalus mulai terbentuk pada hari ketiga untuk kultivar Kasalath dan Nipponbare, hal ini sesuai dengan yang dilakukan oleh Toki et al. (2006), penggunaan 2,4 D konsentrasi 2.0 mg/L pada proses induksi kalus dari biji padi Kasalath, menunjukkan diferensiasi sel (kalus) mulai terbentuk pada hari ketiga. Kalus yang dapat ditransformasi minimal berumur 3 - 4 minggu, dengan penampakan fisik kalus berbentuk butiran globular berwarna kuning muda cerah dengan ukuran > 3 mm (Gambar 8).
Gambar 8 Tahapan induksi kalus dari biji Oryza sativa L. kultivar Kasalath pada media 2N6 yang diperkaya dengan zat pengatur tumbuh (ZPT) 2.4 D, A. biji Oryza sativa L. (gabah), B. biji padi Kasalath. ditanam dalam media 2N6. C. kalus berumur ± 2 minggu dengan ukuran 3 mm, D. kalus berumur 1 bulan dengan ukuran > 3 mm.
Penggunaan eksplan yang berupa kalus dari biji (mature seed) pada transformasi genetik Oryza sativa L. dengan perantara A. tumefaciens, memiliki beberapa kelebihan yaitu lebih mudah dilakukan karena dapat diproduksi dalam jumlah yang banyak dan selalu tersedia setiap waktu di laboratorium (Hiei dan Komari 2008).
Kalus-kalus yang akan ditransformasi sebelumnya disubkultur pada media baru selama tiga hari dalam kondisi terang, yang bertujuan menyegarkan kalus sehingga kualitas kalus tetap bagus untuk proses transformasi. Kualitas kalus merupakan salah satu faktor yang menentukan keberhasilan transformasi dan regenerasi tanaman (Kyozuka dan Shimamoto 1991).
Transformasi genetik Oryza sativa L. kultivar Kasalath dan Nipponbare dilakukan dengan perantara bakteri A. tumefaciens LB4404 yang mengandung plasmid pIG6-SMt2 yang membawa gen MaMt2. Penggunaan bakteri A. tumefaciens sebagai perantara dalam transformasi genetik dilakukan berdasarkan kemampuan bakteri ini dalam mentransfer T-DNAnya. Selain itu, bakteri A. tumefaciens memiliki efisiensi transformasi yang tinggi. Bakteri A. tumefaciens
dapat mengintegrasikan sejumlah kecil dari copy T-DNA ke dalam kromosom, dapat mentransfer segmen DNA yang relatif besar dan sedikit mengalami perubahan selama proses transformasi (Hie dan Komari 2008).
Kokultivasi dilakukan dengan perendaman eksplan di dalam suspensi A. tumefaciens yang diperkaya dengan senyawa asetosiringon selama 2-5 menit, yang selanjutnya eksplan dikeringkan dan ditanam pada media kokultivasi padat selama 3 hari dalam kondisi gelap dengan suhu 28οC. Teknik perendaman merupakan teknik yang umum digunakan untuk infeksi dalam proses transformasi genetik (Hong et al. 2007; Li et al. 2007; Hiei dan Komari 2008; Sharma et al.
2009).
Penambahan asetosiringon pada media kokultivasi padat maupun cair berfungsi untuk menginduksi A. tumefaciens agar dapat menginfeksi kalus dan mentransfer T-DNA A. tumefaciens ke kromosom tanaman padi. Senyawa ini meningkatkan ekspresi gen vir sehingga dapat meningkatkan frekuensi transformasi. Gen virA dari A. tumefaciens aktif menginfeksi pada kondisi pH asam, adanya senyawa fenolik seperti asetosiringon serta golongan monosakarida yang memiliki efek sinergi dengan senyawa fenolik (Ankenbauer et al. 1990; Winans 1992).
Salah satu faktor penentuan keberhasilan transformasi genetik padi menggunakan eksplan kalus adalah mencegah terjadinya pertumbuhan berlebihan dari bakteri A. tumefaciens atau overgrowth. Pertumbuhan berlebih dari A. tumefaciens menyebabkan persentase kalus transforman menurun dratis, yang mana untuk mengatasi overgrowth bakteri A. tumefaciens pada kalus dilakukan pencucian kalus dengan antibiotik cepotaxime. Antibiotik cepotaxime berfungsi untuk membunuh bakteri A. tumefaciens, namun penggunaan cepotaxime dengan konsentrasi tinggi dan dalam durasi yang lama bersifat toksik pada kalus padi. Kalus menjadi mencoklat dan pada akhirnya mengalami kematian setelah dicuci dengan cepotaxime, pada penelitian ini selain antibiotik cepotaxime juga digunakan antibiotik carbecillin yang memiliki fungsi yang sama yaitu membunuh bakteriA. tumefaciens(Hie dan Komari 2008).
Penggunaan antibiotik cepotaxime dan carbecillin untuk membunuh bakteri
A. tumefaciens pada saat pencucian kalus setelah tahapan ko-kultivasi maupun pada media seleksi menurunkan persentase kalus yang ditransformasi. Untuk mencegah terjadinya overgrowth bakteri A. tumefaciens, nilai OD600 dari kultur
bakteri A. tumefaciens yang digunakan harus kecil yaitu 0.01 dan perendaman kalus dilakukan selama 2-5 menit. Teknik ini terbukti mencegah terjadinya
overgrowthdari bakteriA. tumefaciens, sehingga tidak diperlukan pencucian kalus setelah ko-kultivasi.
Tahap seleksi pada proses penelitian ini, dilakukan sebanyak dua tahapan dengan penggunaan konsentrasi antibiotik higromisin secara bertingkat. Untuk seleksi tahap pertama, konsentrasi antibiotik higromisin yang digunakan adalah sebesar 20 mg/L selama dua puluh hari, dimana setiap sepuluh hari disubkultur di media baru yang mengandung antibiotik dengan konsentrasi yang sama. Kalus yang dapat bertahan dan berproliferasi memiliki warna kuning cerah atau pucat dan berbentuk seperti butiran pasir kering (Hiei dan Komari 2008). Pada seleksi kedua, konsentrasi higromisin dinaikkan menjadi 30 mg/L selama lima-sepuluh hari. Hal ini, sama dengan yang dilakukan oleh Lin dan Zhang (2005) menggunakan higromisin 30 mg/L untuk seleksi kalus transforman pada padi
indica. Kalus yang bertahan pada media seleksi ini jumlahnya lebih sedikit dibandingkan pada seleksi pertama. Penggunaan konsentrasi antibiotik higromisin yang bertingkat dilakukan untuk mendapatkan kalus-kalus transforman yang stabil (Anggraito 2012).
Menurut Kyozuka dan Shimamoto (1991), seleksi higromisin dengan konsentrasi 30 mg/L sebanyak dua kali yang terbagi atas seleksi pertama dan kedua menjamin bahwa tunas yang diperoleh adalah transforman. Penggunaan antibiotik higromisin B (Hm) sebagai penanda seleksi pada kalus-kalus transforman sangat efektif dan popular pada tanaman, terutama pada transformasi padi dibandingkan dengan penanda seleksi Kmr(nptII) (Kyozuka dan Shimamoto 1991; Hiei dan Komari 2008). Higromisin berfungsi juga sebagai gen reporter, dimana mekanisme higromisin adalah memblok translokasi dari asam amino menjadi peptida, yang diinaktifkan oleh phosphotransferase. Proses kokultivasi dan seleksi kalus transforman pada media higromisin dengan konsentrasi bertingkat 20 mg/L (Gambar 9b) dan 30 mg/L (Gambar 9c).
Gambar 9 Tahapan kokultivasi dan seleksi kalus transforman pada media seleksi higromisin dengan konsentrasi bertingkat yaitu 20 – 30 mg/L. A. kalus ditumbuhkan pada media kokultivasi 2N6 yang diperkaya asetosiringon B. kalus-kalus yang ditumbuhkan pada media seleksi higromisin dengan konsentrasi 20 mg/L. C. kalus-kalus yang dapat bertahan dan berproliferasi selanjutnya ditumbuhkan pada media seleksi higromisin dengan konsentrasi 30 mg/L.
Kalus-kalus transforman yang diperoleh selanjutnya diregenerasi pada media regenerasi tanpa higromisin, hal ini sesuai dengan Kyozuka dan Shimamoto
(1991), karena penambahan higromisin pada media regenerasi menyebabkan menurunnya kemampuan kalus untuk beregenerasi. Di media regenerasi dengan higromisin bintik-bintik atau bercak hijau yang muncul pada kalus mengalami perubahan warna menjadi coklat dan pembentukan tunas terhambat yang akhirnya kalus mengalami kematian. Tunas-tunas transgenik putatif tumbuh dari bercak- bercak hijau yang terdapat di kalus, setelah 3 - 4 minggu di media 2N6R. Tunas- tunas ini selanjutnya dipindahkan pada media pengakaran (2N6F) tanpa higromisin sampai terbentuk akar dan selanjutnya siap diaklimatisasi (Gambar 10). Faktor penentu keberhasilan regenerasi kalus transforman adalah subkultur terjadwal setiap minggu dan penggunaan media yang segar, hal ini sesuai dengan Kyozuka dan Shimamoto (1991).
Gambar 10 Proses regenerasi dari kalus-kalus transforman pada media regenerasi (2N6R) dan pengakaran (2N6F) hingga terbentuk planlet dan siap untuk diaklimatisasi. A. terbentuknya bercak hijau pada kalus transforman setelah 1-2 minggu disubkultur pada media regenerasi (2N6R ). B. pembentukan tunas dari kalus transforman. C. plantlet cv Kasalath hasil transformasi pada media pengakaran (2N6F). D. plantlet cv Nipponbare hasil transformasi pada media pengakaran (2N6F). E. adaptasi planlet (aklimatisasi). F. padi cv Nipponbare hasil transformasi berumur 6 bulan.
Berdasarkan hasil seleksi kalus, efisiensi transformasi Oryza sativa L. kultivar Kasalath adalah sebesar 14.04%, sedangkan untuk Oryza sativa L. kultivar Nipponbare adalah sebesar 19.39% (Lampiran 10). Efisiensi transformasi padaOryza sativa L. kultivar Nipponbare lebih tinggi dibandingkan pada kultivar Kasalath, yang menunjukkan bahwa efisiensi transformasi sangat dipengaruhi oleh genotipe tanaman. Kalus Nipponbare lebih mudah untuk ditransformasi dan menghasilkan tunas yang lebih tinggi daripada kalus Kasalath (Hiei dan Komari 2008).
Umumnya transformasi genetik pada Oryza sativa L. kultivar japonica
relatif lebih mudah dibandingkan kultivar indica. Kalus dari kultivarindicasering menjadi coklat dan mengalami kematian (Rashid et al. 1996; Nandakumar et al.
2007; Karthikeyan et al.2011). Untuk kultivar padi yang rekalsitran, seperti padi
indica beberapa modifikasi komposisi medium perlu dilakukan atau memerlukan kondisi kultur tertentu (Kyozuka dan Shimamoto 1991). Selain itu, pertumbuhan
A. tumefaciensyang berlebihan pada kalus menyebabkan kematian, dan akhirnya ini mempengaruhi efisiensi transformasi. Oleh sebab itu seleksi dilakukan secara bertahap. Pada penelitian ini seleksi dilakukan dua tahap seperti yang dilakukan oleh Hiei dan Komari (2008). Data jumlah eksplan Oryza sativa L. pada proses transformasi dan seleksi, dapat dilihat pada Tabel 6.
Tabel 6 Perkembangan jumlah eksplan Oryza sativa L. selama proses transformasi dan seleksi
Galur tanaman Jumlah eksplan yang ditanam Seleksi I (2NBKC, 20 Mg/L) Kalus Seleksi II (nN6C, 30 Mg/L) Kalus
Hidup Mati Hidup Mati
Kasalath 235 100 135 33 67
Nipponbare 165 75 90 32 43
Transformasi genetik padaOryza sativa L. memiliki efisiensi transformasi yang bervariasi yaitu padi japonica sebesar 23% (Chan et al. 1993), 27% (Aldemita dan Hodges 1996), 3.8% - 38% (Nishizawa et al. 1999), sedangkan untuk padiindicasebesar 22% (Rashidet al.1996), 5.6 - 6.2% (Arockiasamy dan Ignacimuthu 2007), 2.0% - 7.6% (Nandakumar et al. 2007), dan 9.33% (Karthikeyan et al. 2011). Hasil ini menunjukkan bahwa padi indica bersifat rekalsitran dan sulit untuk ditransformasi (Zhang et al. 1998; Lin dan Zhang 2005). Efisiensi regenerasi dari kalus transforman Oryza sativa L. kultivar Kasalath adalah sebesar 14.04%, dan untuk kultivar Nipponbare sebesar 19.39% (Lampiran 11). Efisiensi regenerasiOryza sativaL. disajikan pada Tabel 7.
Kemampuan regenerasi dari kalus transforman sangat dipengaruhi oleh kondisi kultur kalus, komposisi media regenerasi seperti zat pengatur tumbuh (ZPT) yang digunakan, dan subkultur media secara rutin dan teratur hingga tunas terbentuk. Komposisi media regenerasi yang tepat menjadi faktor utama dalam regenerasi tanaman. Selain itu, kemampuan regenerasi juga dipengaruhi oleh genotipe tanaman, padi subspesies japonica relatif lebih mudah beregenerasi dibandingkan padi indica (Zhang et al. 1998; Lin dan Zhang 2005; Hiei dan Komari 2008).
Tabel 7 RegenerasiOryza sativaL. dari kalus transgenik
Galur tanaman Jumlah eksplan
Jumlah eksplan bertunas
Jumlah tunas % eksplan bertunas
Kasalath 33 2 2 6.06%
Nipponbare 32 9 9 28.1%