BAB IV METODE PENELITIAN
4.7 Prosedur Penelitian
4.7.4 Uji Aktivitas Anti Hepatitis C secara in-vitro
kloroform : metanol (9: 1) pada fase normal sedangkan asetonotril : metanol : air (1:2:2) pada reversed phase.
4.7.4 Uji Aktivitas Anti Hepatitis C secara in-vitro
4.7.4.1 Penyiapan sel (Menanam sel pada 48-well plate)
Semua langkah dilakukan di Biological Safety Cabinet (BSL2). Sel Huh 7it ditanam dalam complete medium DMEM yang terdiri dari : medium DMEM sebanyak 500 ml yang ditambah 10 % FBS 50 ml, 1xNEAA 5ml,0.15mg/ml kanamysin sebanyak 1,5 ml. Langkah kerja yang dilakukan untuk penanaman sel 48-well plate sebagai berikut :
a. Sel 90% confluent dalam (Petri disk) dikeluarkan dari inkubator CO2 37oC.
b. Medium lama dituang dari (Petri disk) pada tempat pembuangan.
c. DBPS steril dipipet 10 ml dan dimasukkan ke dalam cawan (Petri disk) dengan cara digoyang-goyangkan untuk mencuci sel dan secara hati-hati PBS dituang ke tempat pembuangan. d. Larutan Trypsin-EDTA ditambahkan 1 ml ke dalam disk dan
digoncangkan secara perlahan hingga seluruh bagian dasar terkena laruatan Trypsin-EDTA.
e. Disk ditempatkan pada inkubator 37oC selama 4 menit sampai sel-sel hepatosit terlepas dari disk.
f. Segera ditambahkan 6 ml medium ke dalam disk (untuk mencuci EDTA dan mengambil sel).
g. Disuspensikan dengan menggunakan mikropipet kemudian disentrifuse 1200 rpm selama 4 menit.
h. Supernatan dibuang pada tempat pembuangan, pellet sel disuspensikan dalam 10 ml medium kultur DMEM (disuspensikan berulang-ulang hingga homogen).
i. Lakukan perhitungan kepadatan sel Huh7it, diambil kurang lebih 10µl dan letakkan pada block digital hemositometer. Amati dibawah mikroskop dengan perbesaran 100x.
Perhitungan sel Huh7it sebagai berikut : Jumlah sel = 393 sel/4
= 98,25 x 104 ml
Apabila ingin kepadatan sel 5,4 x 104 ml (pada 48-well plate) maka tiap well akan diisi sebanyak 55 µl suspensi sel Huh7it. 5,4 x 104 ml / 98,25 x 104 ml = 0,0549 ml = 55 µl
Menghitung volume medium dan suspensi sel yang akan ditambahkan dalam 48-well plate :
Sel suspensi 55x60 = 3300 µl Volume total 200 X 60 = 12000 µl
Maka medium yang perlu ditambahkan adalah 8700 µl j. Dipipet complete DMEM dan Sel Huh7it sebanyak volume
sel yang dikehendaki ke dalam tube 50 ml sesuai perbandingan yang dikehendaki.
k. Sel di seeding di 48 well-plate menggunakan 8-multichannel
pipette, jumlah per well 200µl.
l. Diinkubasi selama 24 jam pada inkubator CO2 37oC.
4.7.4.2 Uji anti-HCV
4.7.4.2.1 Penyiapan Sampel Tanaman
Hasil fraksinasi ekstrak etanol 80% herba S.dulcis dimasukkan ke dalam tube 2 ml kemudian ditambahkan 10x DMSO (Dojindo, Japan) ke dalam tube untuk memperoleh 100.000 ppm. Ekstrak dilarutkan dengan vortex mixer dan sonikator. Ekstrak sampel di dalam tube disimpan pada -30oC sampai sampel digunakan untuk uji toksisitas dan tes anti HCV.
4.7.4.2.2 Persiapan sampel ekstrak 2x konsentrasi
a. Sampel yang telah larut dalam DMSO (dipersiapkan pada langkah 2) diambil dari pendingin -30oC dan dicairkan pada suhu ruang.
b. Setelah mencair, larutan persediaan (larutan stok) dihomogenkan dengan vortex.
c. Dibuat pengenceran pada 2x lebih tinggi dari konsentrasi yang digunakan di uji anti HCV (200;50;25;12,5;6,25;3,125 µg/ml) menggunakan tipe-U 96 well plate.
Catatan :Setiap sampel yang berbeda selalu menggunakan tip yang berbeda (tip harus diganti).
4.7.4.2.3 Persiapan 2x seri pengenceran
Final konsentrasi : (100 ; 50 ; 25 ; 12,5 ; 6,25 ; 3,125 µg/ml) Konsentrasi preparasi : (200 ; 50 ; 25 ; 12,5 ; 6,25; 3,125 µg/ml) Stok sampel 100.000 ppm m1.v1 = m2.v2 100.00 x Z = 200 x 1300 Z = 2,6 µl
a. Masing-masing stok ekstrak sampel diambil sebanyak 2,6 µl dan ditambah medium DMEM 1300 µl pada tube 2 ml. Kemudian sampel di vortex sehingga akan didapatkan konsentrasi yang baru 200 µg/ml.
b. Serial dilution preparation (2x konsentrasi) : Konsentrasi awal µg/ml Pengenceran Konsentrasi (µg/ml) 200 150µl dari stok 200 µg/ml 200 200 75µl ekstrak + 75µl DMEM 100 100 75µl ekstrak + 75µl DMEM 50 50 75µl ekstrak + 75µl DMEM 25 25 60µl ekstrak + 60µl DMEM 12,5 12,5 40µl ekstrak + 40µl DMEM 6,25 6,25 40µl ekstrak + 40µl DMEM 3,125
4.7.4.2.4 Penyiapan Larutan Virus
Perhitungan larutan virus yang dibutuhkan : M.O.I = 0,1 , MOI = jumlah virus/jumlah sel = 0,1
Jumlah sel = 5,2 x 104 sel/well (jumlah sel pada 24 jam setelah
seeding sel)
FFU = 0,1 x 5,2 x 104
= 5,3 x 103 ffu
Konsentrasi stok virus = 1,5 x 107 ffu/ml
0,35 x 80 = 28 µl virus 54,65 x 80 = 4372 µl DMEM
28 µl stok virus diencerkan dengan 4372 µl DMEM
a. Tube stok (persediaan) virus dari -80oC diambil dan dicairkan secara cepat dan diletakkan dalam kotak yang berisi es. b. Tube tersebut divortex .
c. Virus diencerkan dengan ekstrak sebagaimana berikut (Tabel 4.2).
d. Dari larutan konsentrasi akhir dimasukkan dalam 48-well
plate tipe-U sebagaimana berikut (Tabel 4.2).
Konsentrasi awal Volume ekstrak Volume virus Konsentrasi akhir 200 55 µl 55 µl 100 100 55 µl 55 µl 50 50 55 µl 55 µl 25 25 55 µl 55 µl 12,5 12,5 55 µl 55 µl 6,25 6,25 55 µl 55 µl 3,125
Tabel 4. 2 Pengenceran Virus dengan Ekstrak 4.7.4.2.5 Pencampuran Virus dan Sampel
Sebanyak 55 µl dari sampel ekstrak 2x (pada langkah 3) dicampurkan dengan 55 µl larutan virus (pada langkah 4) ke dalam
96-well plate tipe U dengan menggunakan 8-multichannel pipette
sehingga diperoleh konsentrasi (100 µg/ml; 50 µg/ml ;25 µg/ml; 12,5 µg/ml; 6,25 µg/ml; 3,125 µg/ml). Pencampuran dilakukan dalam kotak berisi es.
4.7.4.2.6 Penambahan Campuran Virus dan Sampel Ekstrak ke dalam Sel Huh7it
a. 48-well plate dikeluarkan dari inkubator CO2 37oC.
b. Medium kultur yang terdapat pada setiap well dibuang dan diganti dengan 110µl campuran dari virus dan sampel ekstrak. c. Pemindahan dilakukan dari dosis kecil ke besar.
d. 48-well plate diinkubasi selama 2 jam pada inkubator CO2
37oC.
4.7.4.2.7Pencucian wells
a. 48-well plate yang telah diinkubasi selama 2 jam, dikeluarkan
dari inkubator CO2.
b. Inokulum virus dibuang dan sel yang terinfeksi dicuci sebanyak 2 kali masing-masing dengan 200 µl DMEM. c. Setelah pencucian wells sebanyak 2 kali, DMEM yang
mengandung sampel ekstrak pada konsentrasi 100 µg/ml; 50 µg/ml; 25 µg/ml; 12,5 µg/ml; 6,25 µg/ml; 3,125 µg/ml sebanyak masing-masing 400 µl dimasukkan ke dalam well d. Inkubasi pada inkubator 37oC selama 48 jam.
Overlay laruatan ekstrak dari 200µg/ml stok ekstrak : Konsentrasi awal
µg/ml Pengenceran Konsentrasi akhir (µg/ml) 200 600µl ekstrak + 600µl DMEM 100 200 300µl ekstrak + 900µl DMEM 50 100 280µl ekstrak + 840µl DMEM 25 50 280µl ekstrak + 840µl DMEM 12,5
25 230µl ekstrak + 690µl DMEM 6,25 12,5 230µl ekstrak + 690µl DMEM 3,125
4.7.4.3 Pemanenan Supernatan Kultur Pada 48 jam Setelah Infeksi: Untuk supernatan kultur :
a. Supernatan kultur dipanen sebanyak 400 µl pada setiap
well dan dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml.
b. Tube disentrifuse pada 12.000 rpm selama 4 menit, 4oC (untuk memisahkan supernatan virus dan debris virus). c. Supernatan diambil jangan sampai medium habis dan
dipindahkan ke tube yang baru (pemindahan dilakukan pada kotak berisi es untuk menjaga titernya).
d. Disimpan pada suhu -80oC sampai nanti dilakukan titrasi virus.
4.7.4.4 Penyiapan Sel untuk Titrasi Virus dan Uji Toksisitas
Pada 20-24 jam sebelum inokulasi virus, sel Huh 7it di
seeding ke dalam 96-well plate (2,3x104sel/well) dan diinkubasi
dalam inkubator CO2 37oC.
Langkah-langkah penyiapan sel sebagai berikut :
a. Sel 90% confluent (Petri disk) dikeluarkan dari inkubator CO2 37oC.
b. Medium lama dituang dari (Petri disk) ke dalam tempat pembuangan.
c. DBPS steril dipipet 10 ml dan dimasukkan ke dalam (disk) untuk mencuci sel dan secara hati-hati PBS dituang ke tempat pembuangan.
d. Larutan Trypsin-EDTA ditambahkan 1-2 ml ke dalam disk dan digoncangkan secara perlahan hingga seluruh bagian dasar terkena larutan Trypsin-EDTA.
e. Disk ditempatkan pada inkubator CO2 37oC.selama 4 menit sampai sel-sel hepatosit terlepas dari disk.
f. Segera ditambahkan 6 ml medium ke dalam disk (untuk mencuci EDTA dan mengambil sel).
g. Disuspensikan dengan menggunakan mikropipet kemudian sentrifuse 1200 rpm selama 4 menit.
h. Supernatan dipindahkan ke dalam tempat pembuangan, pellet sel disuspensikan dalam 10 ml medium kultur (DMEM) (disuspensikan berulang-ulang hingga homogen).
i. Diambil 10 µl dan diletakkan di hemositometer untuk menghitung sel Huh7it dengan melihatnya dibawah mikroskop. Sel akan terlihat jelas pada perbesaran 100x. Perhitungan sel Huh7it sebagai berikut :
Jumlah sel = 483 sel/4= 98,25 x 104 ml
Apabila ingin kepadatan sel 2,4 x 104 ml (pada 96-well plate) maka tiap well akan diisi sebanyak 19,8µl suspensi sel Huh7it.
2,4 x 104 ml / 120,75 x 104 ml = 0,0198 ml = 19,8 µl
Menghitung volume medium dan suspensi sel yang akan ditambahkan dalam 96-well plate (2 plate untuk cek titer virus dan uji toksisitas) :
Sel suspensi 19,8x300 = 5940µl
Kadar yang diinginkan 100 x 300 = 30.000 µl
Maka medium yang perlu ditambahkan adalah 24060 µl j. DMEM sebanyak yang telah dihitung melalui perhitungan
seperti di atas dimasukkan ke dalam tube 50 ml dan ditambahkan dengan suspensi sel sebanyak yang dibutuhkan . Kemudian Tube divortex.
k. Dimasukkan ke dalam 96-well plate sebanyak 100 µl/well dengan menggunakan 8-multichannel pipette .
l. 96-well plate diinkubasi dalam inkubator CO2 37oC selama 24
jam.
4.7.4.5 Check titer virus
a. Tube supernatan kultur dikeluarkan dari -80oC dan dicairkan pada suhu ruang.
b. Setelah mencair, supernatan divortex sebentar (1-2 detik) dan diletakkan di kotak yang berisi es.
c. Supernatan kultur diencerkan dengan DMEM (15x pengenceran) yakni dipipet sebanyak 8 µl supernatan kultur dan ditambahkan dengan 112 µl DMEM masukkan pada setiap well.
d. Inkubasi selama 4 jam.
e. Setelah diinkubasi selama 4 jam, supernatant residu dibuang dan segera ditambahkan dengan complete DMEM sebanyak 400 µl/well.
4.7.4.6 Fiksasi dan Pewarnaan (Staining) Sel yang Terinfeksi Virus Pembuatan larutan yang dibutuhkan untuk fiksasi dan staining (pewarnaan) :
a. PBS 1x
- Dipipet 40 ml PBS 10x dan dimasukkan ke dalam botol. - Ditambahkan dengan 360 ml aquadest dan dikocok sampai
homogen. b. Formalin 3,7 %
- Dipipet 10 ml formaldehida 37 % dan dimasukkan ke dalam botol.
- Ditambahkan dengan PBS 1x sebanyak 90 ml dan dikocok. c. Triton 0,5 %
- Dipipet 50 µl TritonX-100 dan dimasukkan ke dalam botol. - Ditambahkan dengan 9950 µl PBS 1x dan dikocok sampai
homogen.
d. Larutan untuk Antiserum pasien HCV (Ab1) dan HRP-Goat anti
human Ig antibody (Ab2)
Volume total larutan untuk Anti serum pasien HCV (Ab1) dan
Goat anti human Ig antibody (Ab2) :
100 x 120 µl = 12.000 µl
BSA 1% dibuat dari BSA 10% yakni 1/10 x 12.000 = 1200 µl (BSA 10%)
Block ACE 2% dibuat dari Block ACE 4% yakni 2/4 x 12.000 µl = 6000 µl (Block ACE 4%)
Total volume = 1200 µl + 6000 µl = 7200 µl
Tahap pembuatan :
- Dipipet 1,2 ml BSA 10% dan dimasukkan ke dalam tube 50 ml.
- Ditambahkan dengan 6 ml block ACE dan 4,8 ml PBS 1x. - Tube divortex sekitar 1-2 menit.
e. Larutan tersebut dibagi ke dalam 2 tube 15 ml masing-masing 6 ml sehingga diperoleh larutan untuk Antiserum pasien HCV (Ab1) dan HRP-Goat anti human Ig antibody (Ab2).
Perhitungan Anti serum pasien HCV (Ab1) Perbandingan 1:200 maka yang dibutuhkan : 1/200 x 6000 µl = 30 µl
Tahapan pembuatan larutan Anti serum pasien HCV (Ab1) : - Dipipet 30 µl Anti serum HCV (Ab1).
- Dimasukkan ke dalam tube yang berisi larutan untuk Anti serum HCV (Ab1).
- Tube divortex selama 1 menit.
Perhitungan HRP-Goat anti human Ig antibody (Ab2) Perbandingan 1:200 maka yang dibutuhkan :
1/200 x 6000 µl = 30 µl
Tahapan pembuatan larutan HRP-Goat anti human Ig
antibody (Ab2):
- Dipipet 30 µl HRP-Goat anti human Ig antibody (Ab2). - Dimasukkan ke dalam tube yang berisi larutan untuk
HRP-Goat anti human Ig antibody (Ab2). - Tube divortex selama 1 menit.
4.7.4.6.1 Fiksasi
- 96-well plate dikeluarkan dari inkubator CO2 37oC.
- Sel yang terinfeksi difiksasi dengan 10% HCOOH/PBS (200 µl/well) pada temperatur ruang selama 2 menit.
- Larutan dituang ke dalam tempat pembuangan.
- Ditambahkan 200µl 10% HCOOH/PBS di tiap well dan ditunggu selama 3 menit kemudian dituang ke dalam tempat pembuangan. - Well dibilas dengan 200 µl PBS sebanyak 3 kali, masing-masing
diinkubasi selama 5 menit. 4.7.4.6.2 Pewarnaan (Staining)
- Sel yang terinfeksi dibilas 200 µl PBS1x sebanyak 3 kali.
- Ditambahkan dengan Triton 0,5% (100 µl/well) dan didiamkan selama 10 menit.
- Well dibilas dengan 200 µl PBS1x sebanyak 3 kali.
- Dipipet 50 µl larutan Antiserum pasen HCV (Ab1) dan dimasukkan ke dalam tiap well pada 96-well plate.
- 96-well plate diinkubasi selama 1 jam.
- Setelah 1 jam, dilakukan pembilasan (pencucian) dengan 200 µl PBS1x sebanyak 3 kali dan diinkubasi selama 5 menit.
- Larutan HRP-Goat anti human Ig antibody (Ab2) dipipet 50 µl dan dimasukkan ke dalam tiap well pada 96-well plate.
- Diinkubasi selama 1 jam.
- Membilas well 3x dengan PBS 200 µl per @ 5 menit.
- Menambahkan DAB Metal Concentrate (100µl/well) dan diinkubasi pada suhu kamar 10-15 menit sampai menghasilkan warna coklat.
- Sel yang terinfeksi oleh virus akan terlihat berwarna coklat pada dasar well apabila dilihat dibawah mikroskop.
4.7.4.7 Analisis Data
Pada penelitian ini akan didapatkan data % sel yang terinfeksi.Selanjutnya dihitung persen hambatan (inhibisi) dari masing-masing dosis. IC50 ditentukan menggunakan analisa Probit Log dengan SPSS .
Perhitungan menggunakan rumus : % sel yang terinfeksi =
% Hambatan = 100% - % sel yang terinfeksi