METODE PENELITIAN
3.3.9 Uji Aktivitas Hepatoprotektif
Pengujian aktivitas hepatoprotektif peroral meliputi penyiapan hewan percobaan, suspensi CMC 1% (kontrol), suspensi ekstrak daun afrika, parasetamol, dan uji efek hepatoprotektif.
3.3.9.1 Penyiapan Hewan Percobaan
Hewan yang digunakan adalah tikus dengan berat 180 ± 10 g dibagi 5 kelompok, setiap kelompok terdiri dari 6 ekor tikus.
Sebelum digunakan sebagai hewan percobaan, semua tikus dipelihara terlebih dahulu selama kurang lebih satu minggu untuk penyesuaian lingkungan, mengontrol kesehatan dan berat badan serta menyeragamkan makanannya.
3.3.9.2 Penyiapan Suspensi CMC 1%
Pembuatan suspensi CMC 1% (b/v) dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 250 mg CMC ditaburkan ke dalam lumpang yang berisi air suling panas sebanyak 8 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh masa yang transparan, digerus hingga berbentuk gel dan diencerkan dengan sedikit air, kemudian dituang ke dalam labu tentukur 25 ml, ditambah air suling sampai batas tanda.
3.3.9.3 Penyiapan Suspensi Ekstrak Etanol Daun Afrika (EEDA)
Pembuatan suspensi EEDA dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 250 mg CMC ditaburkan ke dalam lumpang yang berisi air suling panas sebanyak 8 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh masa yang transparan, digerus hingga berbentuk gel. Ditambahkan sebanyak 1 g ekstrak
etanol daun afrika ke dalam lumpang, kemudian digerus sampai homogen. Dituang ke dalam labu tentukur 25 ml, ditambah air suling sampai batas tanda.
3.3.9.4 Penyiapan Suspensi Parasetamol
Pembuatan suspensi parasetamol dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 250 mg CMC ditaburkan ke dalam lumpang yang berisi air suling panas sebanyak 8 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh masa yang transparan, digerus hingga berbentuk gel. Ditambahkan sebanyak 2 g parasetamol ke dalam lumpang, kemudian digerus sampai homogen. Dituang ke dalam labu tentukur 25 ml, ditambah air suling sampai batas tanda.
3.3.9.5 Percobaan Hewan Uji
Hewan percobaan dikelompokkan menjadi 5 kelompok, masing-masing terdiri dari 6 ekor hewan percobaan. Kelompok tersebut adalah:
- Kelompok I : Kontrol normal, hewan percobaan diberikan makanan standar selama 8 hari berturut-turut dan tidak diinduksi dengan parasetamol satu kali sehari.
- Kelompok II : Kontrol negatif, hewan percobaan diberikan makanan standar selama 7 hari berturut-turut kemudian pada hari ke-8 diberikan parasetamol dosis tunggal 2000 mg/kgbb (satu kali dioral) satu kali sehari tanpa diberikan ekstrak uji.
- Kelompok III : Kelompok perlakuan, hewan uji diberikan makanan standart dengan EEDA dosis 25 mg/kgbb selama 7 hari berturut-turut kemudian pada hari ke-8 diberikan parasetamol dosis tunggal 2000 mg/kgbb satu kali sehari (satu kali di oral).
- Kelompok IV : Kelompok perlakuan, hewan uji diberikan makanan standart dengan EEDA dosis 50 mg/kgbb selama 7 hari berturut-turut kemudian pada hari ke-8 diberikan parasetamol dosis tunggal 2000 mg/kgbb satu kali sehar (satu kali di oral).
- Kelompok V : Kelompok perlakuan, hewan uji diberikan makanan standart dengan EEDA dosis 125 mg/kgbb selama 7 hari berturut-turut kemudian pada hari ke-8 diberikan parasetamol dosis tunggal 2000 mg/kgbb satu kali sehari (satu kali di oral).
3.3.9.6 Pengambilan Organ Hati Hewan Uji
Pengambilan organ hati pada tikus dilakukan pada hari ke-9 atau 24 jam setelah pemberian parasetamol. Organ hati yang telah diambil, difiksasi dengan larutan buffer netral formalin 10% untuk dibuat preparat histopatologi. Kondisi organ dalam larutan buffer netral formalin 10% terendam seluruhnya dan waktu perendamannya tidak kurang dari 48 jam.
3.3.9.7 Pemeriksaan Histopatologi Organ Tikus
Pemeriksaan histopatologi organ tikus dengan pembuatan preparat histopatologi dengan pewarnaan Haematoxyllin-Eosin. Proses pembuatan preparat histopatologi dan pewarnaan Haematoxyllin-Eosin:
1. Penyiapan organ hati untuk dipotong
Jaringan yang akan dibuat sediaan histopatologi difiksasi dalam larutan Buffer Netral Formalin (BNF) 10% minimal 48 jam hingga mengeras (matang). Sampel organ yang terfiksasi dengan sempurna ditrimming setebal ± 0,5 cm. Potongan kemudian dimasukkan dalam tissue cassette untuk dimasukkan dalam automatic tissue processor.
2. Dehidrasi
Proses dehidrasi dimaksudkan untuk menarik air dari jaringan dan mencegah terjadinya pengerutan sampel yang akan diuji. Dehidrasi dilakukan dengan cara merendam sampel dalam larutan alkohol dengan konsentrasi bertingkat (70%, 80%, 90%, 95%, dan alkohol absolut). Proses perendaman masing-masing konsentrasi alkohol dilakukan selama 2 jam. Proses dehidrasi dilakukan dengan menggunakan mesin otomatis yaitu automatic tissue
processor.
3. Clearing
Proses clearing atau penjernihan dilakukan dengan 2 tahap dengan menggunakan xylol I dan xylol II. Penggunaan xylol dimaksudkan untuk melarutkan alkohol dan parafin.
4. Infiltrasi
Infiltrasi dan impregnasi adalah proses pengisian parafin kedalam pori-pori jaringan. Pengisian pori-pori ini dimaksudkan untuk mengeraskan jaringan agar mudah dipotong dengan pisau mikrotom. Parafin yang digunakan adalah parafin histoplast®.
5. Embedding atau Blocking
Embedding atau blocking adalah proses penanaman jaringan dalam blok
parafin. Parafin yang digunakan parafin histoplast. Proses embedding dilakukan dengan menggunakan alat tissue embedding console.
6. Sectioning
Sectioning adalah proses pemotongan jaringan dengan menggunakan
rotary microtom. Dimasukkan ke dalam waterbath, agar parafin mencair dari dalam organ yang telah dipotong, kemudian organ diambil menggunakan
object glass dan disimpan dalam inkubator dengan suhu 37oC selama 24 jam.
7. Pewarnaan Haematoxyllin-Eosin
Sebelum melakukan pewarnaan, preparat histopatologi dideparafinisasi dengan larutan xylol (I dan II) selama 2 menit. Kemudian dilakukan proses rehidrasi dengan cara mencelupkan sediaan ke dalam alkohol bertingkat (alkohol absolut, alkohol 95%, alkohol 90%, alkohol 80%). Perendaman dalam alkohol 95% dan 80% dilakukan selama 1 menit. Kemudian sediaan dicuci dengan air yang mengalir (air kran) selama 1 menit. Sediaan diwarnai dengan pewarna Mayer’s Haematoxyllin dengan tahapan sebagai berikut:
a. preparat direndam dalam larutan Mayer’s Haematoxyllin selama 8 menit b. dicuci dengan air mengalir (air kran) selama 30 detik
c. dicelupkan ke dalam larutan Lithium Carbonat selama 15-30 detik d. dicuci dengan air mengalir (air kran) selama 2 menit
e. direndam dalam larutan Eosin selama 2-3 menit
f. dicuci dengan air mengalir (air kran) selama 30-60 detik
g. preparat dicelupkan ke dalam larutan alkohol 95% dan alkohol absolut sebanyak 10 kali celupan, absolut I selama 2 menit, xylol I selama 1
menit dan xylol II selama 2 menit.
8. Setelah pewarnaan, sediaan ditetesi perekat Canada balsem (Entellan®) dan ditutup dengan cover glass.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
