Uji aktivitas selulolitik

III. BAHAN DAN METODE

3.3 Metode

3.3.2 Uji aktivitas selulolitik

3.3.2.1 Uji aktivitas selulolitik secara kualitatif

Uji kualitatif aktivitas enzim endoglukanase dilakukan sesuai dengan metode Onsori et al. (2004) yang dimodifikasi dengan mengukur zona bening yang terbentuk pada media agar CMC (CMC 1% (b/v), ekstrak yeast 0.05% (b/v), MgSO4 0.05% (b/v), NaNO3 0.2% (b/v) dan KH2PO4 0.1% (b/v), KCl 0.05% (b/v), agar 1.5% (b/v)). Sebagai standar digunakan isolat Trichoderma reesei yang merupakan standar aktivitas enzim selulase. Secara garis besar metode yang digunakan adalah sebagai berikut. Koloni dengan diameter sepuluh mm dari masing-masing isolat hasil peremajaan diinokulasikan ke dalam media agar CMC. Kultur kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama satu hari. Untuk mengetahui aktivitas selulolitik cendawan, biakan berumur 1 hari diwarnai dengan pewarna

Koleksi isolat TAHAP I

Skrining enzim endoglukanase

TAHAP II Isolasi gen penyandi enzim endoglukanase

Isolat potensial terpilih Uji kualitatif aktivitas enzim endoglukanase

Uji kuantitatif aktivitas enzim endoglukanase

Desain primer

Isolasi gen penyandi enzim endoglukanase

Sekuensing dan karakterisasi DNA

congo red 1 % (b/v) selama 0.5-1 jam, diikuti destaining dengan larutan NaCl 1

M selama 15 menit. Adanya aktivitas enzim endoglukanase ditandai dengan terbentuknya zona bening. Untuk masing-masing isolat digunakan tiga ulangan. Diameter koloni dan zona bening yang terbentuk diukur. Nisbah selulolitik dihitung menggunakan rumus sebagai berikut:

koloni diameter koloni diameter -zona diameter (R) selulotik Nisbah =

3.3.2.2 Uji aktivitas enzim endoglukanase secara kuantitatif

Sebanyak 2 x 10⁶ spora/ml A. niger dan Trichoderma yang diproduksi pada media

agar CMC diinokulasikan ke dalam 50 ml media CMC cair dalam erlenmeyer 250 ml (Narashima et al. 2006). Untuk masing-masing isolat digunakan tiga ulangan.

Kultur diinkubasi dalam inkubator beragitasi selama 7 hari pada kecepatan 150 rpm. Kultur di panen pada umur 7 hari setelah inokulasi. Pemisahan enzim kasar dari biomassa cendawan dilakukan dengan cara menyaring filtrat kasar cendawan dengan kertas saring. Filtrat yang dihasilkan digunakan sebagai ekstrak kasar enzim. Aktivitas enzim endoglukanase diukur berdasarkan produk gula yang dihasilkan dengan metode DNS (asam dinitrosalisilat) (Ghose 1987). Sebanyak 0.5 ml filtrat (ekstrak kasar enzim) dicampur dengan 0.5 ml CMC 1% (b/v) dalam bufer sitrat 50 mM pH 4,8 dan diinkubasikan selama 30 menit pada suhu 50^oC. Reagen DNS sebanyak 3 ml ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Setelah itu tabung reaksi dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit, kemudian didinginkan pada suhu kamar dan dihitung nilai rapat optis (O.D) pada λ540 nm terhadap blanko. Blanko dibuat dengan mengganti sampel dengan bufer sitrat 50 mM pH 4.8. Hasil pengukuran kemudian dimasukkan ke dalam persamaan kurva standar glukosa yang telah dibuat untuk mengukur kadar glukosa (Lampiran 1). Unit aktivitas enzim endoglukanase dihitung dengan rumus dibawah ini. Satu unit aktivitas enzim endoglukanase didefinisikan sebagai kemampuan enzim dalam menghasilkan 1µmol glukosa per menit.

n pengencera faktor x waktu (ml) enzim V x glukosa BM (ppm) glukosa i konsentras Unit = x

Pengukuran kadar protein total dilakukan dengan metode Lowry (Ghose, 1987). Sebanyak 0.5 ml ekstrak kasar enzim dimasukkan kedalam tabung reaksi dan setelah itu ditambahkan 5 ml reagen C. Reagen C dibuat dengan mencampur 100 ml reagen A (Na2CO3 2% (b/v) dalam NaOH 0.1N) dan 2 ml reagen B (CuSO4.5H2O 0.5% (b/v) dalam K Tartarat 1% (b/v)). Tabung kemudian divorteks dan didiamkan pada suhu kamar selama 10 menit. Setelah itu, ke dalam tabung dimasukkan 0.5 ml Reagen D (reagen folin Ciocalteau yang telah diencerkan dengan air sampai 1N). Tabung kemudian divorteks dan didiamkan pada suhu kamar selama 30 menit. Nilai rapat optis (O.D) setiap isi tabung dibaca dengan menggunakan spektrofotometer pada λ750 nm terhadap blanko. Hasil pengukuran kemudian dimasukkan ke dalam persamaan kurva standar bovine serum albumin (BSA) yang telah dibuat untuk mengukur kadar protein (Lampiran

1). Selanjutnya aktivitas spesifik enzim dapat ditentukan berdasarkan unit/ml aktivitas enzim dan kadar protein yang didapat dengan rumus sebagai berikut.

(mg/ml) protein kadar (unit/ml) unit aktivitas (unit/mg) spesifik aktivitas =

3.3.3 Isolasi gen penyandi endoglukanase A. niger IPB1 3.3.3.1 Isolasi RNA total

Isolasi asam ribonukleat (RNA) total A. niger IPB1 dilakukan pada biakan

yang berumur 3 hari. Miselium dari biakan A. niger IPB1 yang ditumbuhkan pada

media cair dipanen. Sebanyak 1 g miselium digerus dengan bantuan nitrogen cair dalam mortal sampai terbentuk bubuk halus, kemudian diekstrak dengan 800 µl reagen TRIzol (Invitrogen). Inkubasi dilakukan selama 5 menit pada suhu ruang,

selanjutnya ditambahkan 200 µl kloroform, dibolak-balik selama 30 detik. Campuran diinkubasi selama 3 menit pada suhu ruang, selanjutnya disentrifugasi pada 9000 rpm (Jouan BR4i) selama 15 menit pada suhu 6^oC. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke dalam tabung baru dan ditambahkan 500 µl isopropil alkohol, kemudian diinkubasikan selama 10 menit pada suhu ruang dan disentrifugasi pada 9000 rpm (Jouan BR4i) selama 10 menit pada suhu 6^oC. Supernatan dibuang dan endapannya dicuci dengan etanol 75% (v/v) dan

disentrifugasi pada 5700 rpm (Jouan BR4i) selama 5 menit pada suhu 6^oC. Endapan yang didapat dikeringkan dengan vakum selama 6 menit dan dilarutkan dalam 20 µl ddH2O yang mengandung diethylpyrocarbonate (DEPC) 0.1% (v/v).

Kuantifikasi dilakukan dengan melarutkan 1 µl suspensi RNA total dalam 700 µl air DEPC 0.1% (v/v), selanjutnya dibaca nilai rapat optisnya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm (Sambrook et al. 1989).

Keutuhan RNA dianalisis secara kualitatif menggunakan elektroforesis, dengan memigrasikan RNA pada gel agarosa di dalam bufer morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) 1% (v/v) (4,2 g/l 3-morpholinopropanesulfonic acid (C7H15NO4), 0.41 g/l Na-Asetat, 0.37 g/l Na2EDTA.H2O) pada tegangan 100 volt selama 35 menit. Visualisasi RNA dilakukan di atas UV transiluminator GelDoc (Labquip).

3.3.3.2 Sintesis cDNA total

Sintesis cDNA total dilakukan melalui proses transkripsi balik. Sebanyak 500 ng RNA total dicampur dengan 4 µl 5x reverse transcriptase (RT) bufer, 1

unit Enzim reverse transcriptase (Invitrogen), 10 pmol primer oligo d(T), 2 µl dithiothreitol (DTT) (0.1 M), 2 µl dNTPmix 2 mM dan ddH2O DEPC 0.1% steril (konsentrasi final) dalam volume 20 µl. Reaksi transkripsi balik dilakukan pada suhu 30^oC selama 10 menit, diikuti oleh suhu 42^oC selama 60 menit dan 95^oC selama 5 menit.

Evaluasi terhadap keberhasilan sintesis cDNA total dilakukan dengan mengamplifikasi gen penyandi aktin dengan menggunakan primer spesifik gen aktin dan cDNA total sebagai cetakannya. Komposisi reaksi PCR (polymerase chain reaction) ialah 0.75 µl cDNA total, 1x bufer Taq, 0.25 unit Taq DNA

polimerase, 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 15 pmol dari masing-masing primer

ActF dan ActR2, dimethyl sulfoxide DMSO 4% (v/v) (konsentrasi final) dan

ddH2O dengan volume reaksi 15 µl. Reaksi PCR dilakukan dengan kondisi pra-PCR 95^oC selama 5 menit diikuti dengan 30 siklus amplifikasi yang terdiri dari denaturasi 94^oC selama 30 detik, annealing 57^oC selama 30 detik, dan polimerisasi 72^oC selama 2 menit dan pasca-PCR 72^oC selama 5 menit dan pendinginan 15^oC selama 5 menit

3.3.3.3 Isolasi fragmen cDNA eglA

Fragmen cDNA eglA diisolasi dengan PCR menggunakan primer spesifik

gen endoglukanase yang telah didesain. Komposisi PCR ialah 1 µl cDNA total, 1x bufer Taq, 0.25 unit Taq DNA polimerase, 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 20 pmol dari masing-masing primer forward dan reverse, DMSO 4% (v/v)

(konsentrasi final) dan ddH₂O dengan volume reaksi 20 µl. PCR dilakukan dengan kondisi pra-PCR 95^oC selama 5 menit diikuti dengan 30 siklus amplifikasi yang terdiri dari denaturasi 94^oC selama 30 detik, annealing 57^oC selama 30 detik, dan polimerisasi 72^oC selama 2 menit dan pasca-PCR 72^oC selama 5 menit dan pendinginan 15^oC selama 5 menit.

3.3.3.4 Pengklonan fragmen cDNA eglA

Fragmen cDNA eglA yang telah diisolasi disisipkan ke dalam vektor

pengklonan pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI, USA) (Lampiran 2) dan

diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α. Hasil PCR diligasikan dengan

pGEM-T Easy mengikuti petunjuk produsen (Promega) yaitu dengan mencampur

7.5 ng hasil PCR, 10 ng pGEM-T Easy, 0.3 Weiss Unit T4 DNA ligase dan 1x

bufer ligasi dengan volume reaksi 10 µl, kemudian diinkubasi pada suhu 4^oC selama semalam. Hasil ligasi diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α

menggunakan metode Suharsono (2002). Metode ini dilakukan dalam dua tahap, yaitu pembuatan sel kompeten dan transformasi bakteri. Sel kompeten dibuat dengan membiakkan koloni tunggal E.coli DH5α dalam 2 ml media LB

(Luria-Bertani) cair (tripton 1% (b/v), ekstrak yeast 0.5% (b/v), NaCl 1% (b/v)) pada suhu 37^oC selama semalam dalam inkubator beragitasi (250 rpm). Sebanyak 100

µl biakan E.coli DH5α kemudian dibiakkan kembali dalam 10 ml media LB cair

sampai mencapai OD600=O.5 (densitas sel 4.10⁷ – 7.10⁷ sel/ml. Sebanyak 1.5 ml biakan bakteri diendapkan dengan senrifugasi pada kecepatan 5000 rpm, suhu 4^oC selama 10 menit. Endapan bakteri kemudian disuspensikan dalam 600 µl bufer transformasi (TB) (10 mM PIPES, 15 mM CaCl2.2H2O, 250 mM KCl, 55 mM MnCl2, pH 6,7) dan diinkubasikan dalam es selama 20 menit. Setelah disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm pada suhu 4^oC selama 10 menit, endapan bakteri diresuspensikan dengan 60 µl TB, ditambah 4.2 µl DMSO dan

diinkubasikan dalam es selama 20 menit. Transformasi dilakukan dengan mencampur sel bakteri kompeten yang dihasilkan dengan 10 µl plasmid hasil ligasi dan diinkubasi dalam es selama 30 menit. Campuran kemudian diberikan kejutan panas dengan diinkubasi pada suhu 42^oC selama 1 menit dan setelah itu diinkubasikan kembali dalam es selama 5 menit. Campuran kemudian ditambah dengan 200 µl media YT (16 g/l tripton, 10 g/l ekstrak yeast, 5 g/l NaCl, pH 7,0) dan diinkubasikan pada suhu 37^oC selama 60 menit. Bakteri kemudian disebar dalam media agar LB yang mengandung 50 µg/ml ampisilin, 10 µl 100 mM isopropiltio-β-galaktosida (IPTG) dan 50 µl 2% (b/v) X-gal (5- bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) dan diinkubasi pada suhu 37^oC selama semalam.

3.3.3.5 Seleksi transforman rekombinan

E. coli DH5α yang mengandung vektor rekombinan diseleksi

menggunakan seleksi resistensi terhadap ampisilin dan seleksi biru putih. Koloni yang tumbuh berarti bakteri transforman, sebab E. coli DH5α baru memiliki gen amp (ketahanan terhadap ampisilin) setelah ditransformasi oleh pGEM-T Easy.

Ada dua jenis warna koloni yang tumbuh yaitu koloni biru dan putih. Koloni biru berarti bakteri transforman pGEM-T Easy non rekombinan, sehingga

gen lacZ masih utuh dan menghasilkan enzim β-galaktosidase untuk memotong

substrat X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna biru. Koloni putih berarti bakteri transforman yang mengandung pGEM-T Easy rekombinan, karena gen lacZ menjadi rusak karena tersisipi oleh fragmen DNA (insertional inactivation)

dan tidak akan menghasilkan enzim β-galaktosidase.

3.3.3.6 Analisis cDNA sisipan

Analisis cDNA sisipan dilakukan melalui PCR terhadap koloni putih yang dihasilkan dan pemotongan plasmid rekombinan dengan enzim restriksi EcoRI.

Koloni putih yang terbentuk digunakan sebagai cetakan untuk reaksi PCR dalam mendeteksi keberadaan gen endoglukanase. Koloni putih diambil dengan tusuk gigi steril kemudian disuspensikan ke dalam 7.42 µl ddH2O dan dipanaskan dalam

menit. Reaksi PCR dilakukan dengan campuran dan kondisi reaksi yang sama dengan isolasi cDNA eglA.

Koloni putih yang menghasilkan pita sesuai dengan ukuran fragmen cDNA sisipan setelah PCR terhadap koloni digunakan sebagai bahan untuk isolasi plasmid yang akan dianalisis lebih lanjut. Plasmid diisolasi dari E. coli DH5α

transforman rekombinan menggunakan prosedur Suharsono (2002). E. coli

ditumbuhkan dalam 2 ml media LB dan diinkubasi dalam inkubator beragitasi (250 rpm) pada suhu 37^oC semalam. Kultur bakteri di sentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 4^oC selama 10 menit. Pelet disuspensikan dengan 100 µl coldTEG buffer (50 mM glukosa, 25 mM Tris pH 8, 10 mM EDTA),

ditambahkan 200 µl NaOH/SDS buffer (1 N NaOH, 1% SDS), dibolak-balik perlahan dan diinkubasi dalam es selama 5 menit, selanjutnya ditambahkan 300 µl

icecalsal buffer (3 M NaOAc, 11.5% asam asetat glasial, ddH2O), dihomogenkan dan disimpan dalam es selama 3 menit. Larutan disentrifugasi 12000 rpm pada suhu 4^oC selama 10 menit. Supernatan disuspensikan dengan 1x volume PCI (fenol:kloroform:isoamil alkohol (25:24:1)), diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang dan selanjutnya disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan ditambah 2x volume etanol absolut, diinkubasi selama 2 jam di freezer dan

selanjutnya disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit. Pelet dikeringkan dan kemudian ditambahkan 30 µl ddH2O. RNA didegradasi dengan menambahkan 100 ppm RNAse dan diinkubasi pada suhu 37^oC selama 30 menit. Plasmid dielektroforesis di agarosa 1% (b/v) dalam bufer TAE 1x (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA) pada tegangan 100 volt selama 30 menit.