Uji Efek Imunomodulator

BAB III METODE PENELITIAN

3.7 Uji Efek Imunomodulator

Uji efek imunomodulator meliputi penyiapan hewan percobaan, penyiapan kontrol, bahan uji, larutan penyangga dan antigen, uji respon hipersensitivitas tipe lambat, dan uji titer antibodi. Penyiapan kontrol, bahan uji, larutan penyangga dan antigen meliputi penyiapan CMC 1%, penyiapan suspensi siklofosfamida 0,5%, penyiapan suspensi ekstrak daun bangun-bangun, penyiapan phosphate buffered saline, dan penyiapan sel darah merah domba.

3.7.1 Penyiapan hewan percobaan

Jumlah hewan coba pada penelitian ini menggunakan rumus Federer, yaitu:

Pada rumus tersebut, t adalah jumlah perlakuan dan n adalah banyaknya sampel setiap kelompok perlakuan. Dengan rumus ini didapat jumlah sampel

Hewan yang digunakan adalah mencit jantan dengan berat 20 - 30 g dibagi 5 kelompok yang terdiri dari 1 kelompok kontrol negatif (CMC 1%), 1 kelompok pembanding (siklofosfamid), dan 3 kelompok uji (variasi dari ekstrak).

Sebelum digunakan sebagai hewan percobaan, semua mencit dipelihara terlebih dahulu selama kurang lebih satu minggu untuk penyesuaian lingkungan, mengontrol kesehatan dan berat badan serta menyeragamkan makanannya (Sabina, et al., 2009). Gambar hewan dapat dilihat pada Lampiran 7, halaman 66.

3.7.2 Penyiapan CMC 1%

Pembuatan suspensi CMC 1% (b/v) dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 250 mg CMC ditaburkan ke dalam lumpang yang berisi air suling panas sebanyak 5 ml didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh massa yang transparan, digerus hingga berbentuk gel dan diencerkan dengan sedikit air, kemudian dituang ke dalam labu tentukur 25 ml, ditambah air suling sampai batas tanda.

3.7.3 Penyiapan Suspensi Siklofosfamid 0,5% (SS)

Pembuatan suspensi siklofosfamid 0,5% (b/v) dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 250 mg CMC ditaburkan ke dalam lumpang yang berisi air suling panas sebanyak 5 ml, didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh masa yang transparan, digerus hingga berbentuk gel. Ditambahkan sebanyak 125 mg siklofosfamid ke dalam lumpang, kemudian digerus sampai homogen. Dituang ke dalam labu tentukur 25 ml, ditambah air suling sampai

3.7.4 Penyiapan Suspensi Ekstrak Etanol Daun Bangun-bangun (EEDBB)

Pembuatan suspensi ekstrak daun bangun-bangun dibuat tiga sediaan sesuai dengan perlakuan yang akan dilakukan. Untuk dosis 250 mg/kg BB dibuat dengan cara sebagai berikut: sebanyak 100 mg CMC ditaburkan ke dalam lumpang yang berisi air suling panas sebanyak 2 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh masa yang transparan, digerus hingga berbentuk gel. Ditambahkan sebanyak 250 mg ekstrak daun bangun-bangun ke dalam lumpang, kemudian digerus sampai homogen. Dituang ke dalam labu tentukur 10 ml, ditambah air suling sampai batas tanda. Begitu juga untuk pembuatan dosis 500 mg/kg BB dan750 mg/kg BB dilakukan hal yang sama.

3.7.5 Penyiapan Phosphate Buffered Saline (PBS)

Pembuatan PBS dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄, 0,24 g KH₂PO_4, dilarutkan dalam 800 ml aqua bidestilasi, kemudian dicek pH dengan indikator pH hingga pH ± 7 dan dapat disesuaikan dengan penambahan HCl atau NaOH, tambahkan aqua bidestilasi hingga 1 L (Rahmi, 2011).

3.7.6 Penyiapan Sel Darah Merah Domba (SDMD)

Pembuatan SDMD didasarkan pada penelitian yang dilakukan oleh Puri, et al., (1993). Darah segar dikumpulkan dari domba (domba yang digunakan adalah domba yang dipelihara di Jurusan Peternakan Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara). Darah dipisahkan dari plasmanya dengan pemusingan 1900 rpm menggunakan alat sentrifugasi pada suhu 4^oC

SDMD 100%, ke dalam SDMD 100% ditambahkan PBS dengan volume yang sama, hingga diperoleh SDMD 50%. Kemudian diambil 0,2 ml SDMD 50%, tambahkan PBS hingga 10 ml, sehingga diperoleh SDMD 1%.

3.7.7 Uji Respon Hipersensitivitas Tipe Lambat

Efek imunomodulator ekstrak etanol daun bangun-bangun ditentukan menggunakan uji respon hipersensitivitas tipe lambat dengan cara mengukur volume pembengkakan telapak kaki hewan uji (foot paw swelling test) (Sabina, et al., 2009). Penentuan dosis dilakukan berdasarkan data orientasi yang sudah dilakukan sebelumnya.

Sebanyak 25 ekor mencit dibagi menjadi 5 kelompok dengan pembagian sebagai berikut:

Kelompok I : diberi suspensi CMC Na 1% (b/v) sebagai kontrol negatif Kelompok II : diberi ekstrak daun bangun-bangun dosis 250 mg/kg BB Kelompok III : diberi ekstrak daun bangun-bangun dosis 500 mg/kg BB Kelompok IV : diberi ekstrak daun bangun-bangun dosis 750 mg/kg BB Kelompok V : diberi suspensi siklofosfamid dengan dosis 50 mg/kg BB

sebagai pembanding (Neha dan Mishra, 2011; Arafa, et al., 2008).

Tiap kelompok hewan percobaan diinjeksikan dengan 0,1 ml SDMD 1% dalam PBS secara i.p (intraperitonium) sebagai antigen pada hari ke-0. Perlakuan dimulai dari hari ke-0 dan diberikan satu kali setiap hari selama 7 hari. Pada hari ke-7, sendi kaki mencit sebelah kanan diberi tanda batas

awal (V0). Kemudian mencit diinjeksikan dengan 0,1 ml suspensi SDMD 1% dalam PBS secara intraplantar pada telapak kaki sebelah kanan. Pada hari kedelapan (setelah 24 jam) diukur volume pembengkakan kaki mencit dengan pletismometer air raksa. Pengukuran dilakukan dengan mencelupkan kaki mencit ke dalam tabung yang berisi air raksa sampai tanda batas pengukuran. Perubahan volume air raksa terlihat pada kenaikan skala pletismometer sebagai volume waktu tertentu (Vt) kaki mencit. Volume pembengkakan kaki mencit ditentukan berdasarkan selisih antara volume waktu tertentu (V_t) dengan volume awal (V0). Gambar pembengkakan kaki mencit dapat dilihat pada Lampiran 8, halaman 67.

3.7.8 Uji Titer Antibodi

Tiap kelompok hewan percobaan diinjeksikan dengan 0,1 ml SDMD 1% dalam PBS sebagai antigen secara intraperitoneal pada hari ke-0. Perlakuan dimulai dari hari ke-0 dan diberikan satu kali sehari selama 7 hari. Pada hari ke-7, sampel darah masing-masing mencit diambil melalui pembuluh darah vena di bagian ekor. Caranya dengan modifikasi yaitu bagian ujung dari ekor mencit disayat dengan menggunakan silet kemudian darah yang keluar disedot dengan menggunakan spuit 1 ml, selanjutnya sampel darah dikumpulkan dalam tabung mikro (microtube), kemudian dilakukan pemusingan 1900 rpm dengan alat sentrifugasi pada suhu 4^oC selama 10 menit dan diambil serumnya. Nilai titer antibodi ditentukan dengan teknik hemaglutinasi. 25 µl serum diteteskan ke dalam sumur microtitration plate 96 lubang, ditambahkan PBS dan SDMD

pada suhu 37^oC selama 1 jam dan diamati hemaglutinasi secara visual (Makare, et al., 2001; Puri, et al., 1993). Nilai titer antibodi ditentukan berdasarkan pengenceran terakhir di mana antibodi masih terdeteksi melalui hemaglutinasi yang terlihat secara visual. Nilai titer antibodi tersebut selanjutnya ditransformasikan dengan [2log(titer)+1] (Hargono, 2000; Rahmi, 2011). Gambar hasil hemaglutinasi dapat dilihat Lampiran 9, halaman 68.