BAB III METODE PENELITIAN
3.5. Uji Efek Imunomodulator
Uji efek imunomodulator meliputi penyiapan hewan percobaan, penyiapan kontrol, bahan uji, larutan penyangga dan antigen, uji respon hipersensitivitas tipe lambat, dan uji titer antibodi.
3.5.1Penyiapan Hewan Percobaan
Hewan yang digunakan adalah mencit jantan dengan berat 20-35 g dibagi 5 kelompok, 1 kelompok untuk kontrol negatif, 1 kelompok untuk kontrol positif,
Sebelum digunakan sebagai hewan percobaan, semua mencit dipelihara terlebih dahulu selama kurang lebih satu minggu dalam kandang yang baik pada suhu ruangan untuk penyesuaian lingkungan, pengontrolan kesehatan dan berat badan. Mencit diberi makan pelet hewan dan minum air keran. (Shukla et.al.,
2009).
3.5.2Penyiapan Kontrol, Bahan Uji, Larutan Penyangga dan Antigen
Penyiapan kontrol, bahan uji, larutan penyangga dan antigen meliputi penyiapan CMC 1%, penyiapan suspensi siklofosfamida 0,5%, penyiapan suspensi ekstrak umbi keladi tikus 2%, penyiapan larutan penyangga phosphate
buffered saline, dan penyiapan sel darah merah domba.
3.5.2.1Penyiapan CMC 1%
Pembuatan suspensi CMC 1% (b/v) dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 250 mg CMC ditaburkan ke dalam lumpang yang berisi air suling panas sebanyak 8 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh masa yang transparan, digerus hingga berbentuk gel dan diencerkan dengan sedikit air, kemudian dituang ke dalam labu tentukur 25 ml, ditambah air suling sampai batas tanda.
3.5.2.2Penyiapan Suspensi Siklofosfamida (SS) 0,5%
Pembuatan suspensi siklofosfamida0,5% (b/v) dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 250 mg CMC ditaburkan ke dalam lumpang yang berisi air suling panas sebanyak 8 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh masa yang transparan, digerus hingga berbentuk gel. Ditambahkan sebanyak 125 mg siklofosafamida ke dalam lumpang, kemudian digerus sampai homogen. Dituang ke dalam labu tentukur 25 ml, ditambah air suling sampai batas tanda.
3.5.2.3Penyiapan Suspensi Ekstrak Umbi Keladi Tikus (SEUKT) 2%
Pembuatan suspensi ekstrak umbi keladi tikus 2% (b/v) dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 250 mg CMC ditaburkan ke dalam lumpang yang berisi air suling panas sebanyak 8 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh masa yang transparan, digerus hingga berbentuk gel. Ditambahkan sebanyak 500 mg ekstrak umbi keladi tikus ke dalam lumpang, kemudian digerus sampai homogen. Dituang ke dalam labu tentukur 25 ml, ditambah air suling sampai batas tanda.
3.5.2.4Penyiapan Phosphate Buffered Saline (PBS)
Pembuatan PBS dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 8 gram NaCl, 0,2 gram KCl, 1,44 gram Na2HPO4, 0,24 gram KH2PO4, dilarutkan dalam 800 ml aqua bidestilasi, kemudian dicek pH dengan indikator pH hingga pH ±7 dan dapat disesuaikan dengan penambahan HCl atau NaOH, tambahkan aqua bidestilasi hingga 1 L (DeAngelis, 2007).
3.5.2.5Penyiapan Sel Darah Merah Domba (SDMD)
Penyiapan dan pembuatan SDMD didasarkan pada penelitian yang dilakukan oleh Puri, et.al., (1993). Darah segar dikumpulkan dari domba yang disembelih.
Darah dipisahkan dari plasmanya dengan pemusingan 1900 rpm menggunakan alat sentrifugasi pada suhu 4oC selama 10 menit. Kemudian supernatan dibuang. Endapan dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali. Setelah pencucian selesai, PBS dibuang, maka diperoleh SDMD 100%. Ke dalam SDMD 100% ditambahkan PBS dengan volume yang sama, hingga diperoleh SDMD 50%. Kemudian diambil 0,2 ml SDMD 50%, tambahkan PBS hingga 10 ml, sehingga diperoleh SDMD 1%.
3.5.3Uji Respon Hipersensitivitas Tipe Lambat
Efek imunomodulator ekstrak umbi keladi tikus ditentukan dengan mengukur volume respon hipersensitivitas tipe lambat menggunakan uji pembengkakan telapak kaki hewan uji (foot paw swelling test) (Lakshmi, et.al., 2003;Ray, et.al.,
1996).
Sebanyak 25 ekor mencit dibagi menjadi 5 kelompok dengan pembagian sebagai berikut:
Kelompok I diberi suspensi CMC Na 1% (b/v) sebagai kontrol negatif
Kelompok II diberi Suspensi Ekstrak Umbi Keladi Tikus (SEUKT) dengan dosis 100 mg/kg BB
Kelompok III diberi SEUKT dengan dosis 200 mg/kg BB Kelompok IV diberi SEUKT dengan dosis 400 mg/kg BB
Kelompok V diberi Suspensi Siklofosfamida (SS) dengan dosis 50 mg/kg BB sebagai kontrol positif
Tiap kelompok diinjeksikan dengan 0,1 ml sel darah merah domba (SDMD) 1% dalam PBS secara intraperitoneal pada hari ke-0. Perlakuan dimulai dari hari ke-0 dan diberikan satu kali setiap hari selama 7 hari. Pada hari ke-7, sendi kaki mencit sebelah kanan diberi tanda batas pengukur an volume kaki mencit. Volume kaki mencit diukur sebagai volume awal (V0). Kemudian mencit diinjeksikan dengan 0,1 ml suspensi SDMD 1% dalam PBS secara intraplantar pada telapak kaki sebelah kanan.
Pada hari kedelapan (setelah 24 jam) diukur volume pembengkakan kaki mencit dengan platismometer air raksa. Pengukuran dilakukan dengan mencelupkan kaki mencit ke dalam tabung yang berisi air raksa sampai tanda
batas pengukuran. Perubahan volume air raksa terlihat pada kenaikan skala pada pletismometer sebagai volume waktu tertentu (Vt) kaki mencit. Volume pembengkakan kaki mencit ditentukan berdasarkan selisih antara volume waktu tertentu (Vt) dengan volume awal (V0). (Shivaprasad, et.al., 2006). Gambar
pembengkakan kaki mencit dapat dilihat pada Lampiran 9, halaman 61.
3.5.4Uji Titer Antibodi
Tiap kelompok diinjeksikan dengan 0,1 ml sel darah merah domba (SDMD) 1% dalam PBS secara intraperitoneal pada hari ke-0. Perlakuan dimulai dari hari ke-0 dan diberikan satu kali setiap hari selama 7 hari. Pada hari ke-7, sampel darah masing-masing mencit diambil melalui pembuluh darah vena di bagian ekor. Sampel darah dikumpulkan dalam tabung mikro (microtube), kemudian
dilakukan pemusingan 1900 rpm dengan alat sentrifugasi pada suhu 40C selama 10 menit dan diambil serumnya.
Nilai titer antibodi ditentukan dengan teknik hemaglutinasi. 25 µ l serum diteteskan ke dalam sumur microtitration plate 96 lubang, ditambahkan PBS dan
SDMD dengan volume yang sama, dan diencerkan dua kali lipat (1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256; 1:512; 1:1024; 1:2048; 1:4096) kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 1 jam dan diamati hemaglutinasi secara visual (Makare, et.al., 2001; Puri, et.al., 1993). Nilai titer antibodi ditentukan
berdasarkan pengenceran terakhir dimana antibodi masih terdeteksi melalui hemaglutinasi yang terlihat secara visual. Nilai titer antibodi tersebut selanjutnya ditransformasikan dengan [2log(titer)+1] (Hargono, 2000). Gambar hasil hemaglutinasi dapat dilihat pada Lampiran 9, halaman 62.