Kelompok V : Kelompok kontrol negatif (tidak dilakukan perlakuan) = 8 sampel
HASIL PENELITIAN
5.3 Uji Efektifitas Antibakteri Dengan Penghitungan Koloni Bakteri
Pada metode ini, dicobakan konsentrasi ekstrak batang kemuning yang dicampur dengan bakteri kemudian diinkubasi selama 3 jam dan 6 jam setelah dilakukan peletakan dan perataan pada media, kemudian diinkubasi selama 24 jam dan dilakukan pengamatan. Dalam pengujian ini digunakan dua kelompok konsentrasi bakteri yaitu pada pengenceran bakteri 104 dan 108 dihitung dalam satuan CFU/mL. Setelah dilakukan perhitungan didapat data keseluruhan.
Tabel 2. Hasil perhitungan jumlah koloni bakteri Fusobacterium nucleatum pada pengenceran bakteri 104 dan 108 dalam inkubasi 3 jam dan 6 jam.
konsentrasi 10
4
108
3 jam 6 jam 3 jam 6 jam
1% 1381 1030 2630 912 1 1 0 0 2,5% 1078 824 2206 1566 1 1 0 0 5% 750 820 974 1207 58 100 0 0 7,5% 460 735 727 1808 109 140 0 0 20% 376 367 0 0 13 49 0 0 kontrol bakteri 1100 848 1140 1170 277 344 0 0
Setelah dilakukan pengamatan didapati data seperti pada tabel 2 yang merupakan data keseluruhan yang menunjukan bahwa pada setiap pengenceran bakteri 104 dan 108 dalam inkubasi 3 jam dan 6 jam bakteri dapat tumbuh baik. Pada pengenceran bakteri 104 dalam inkubasi 3jam terjadi penurunan jumlah bakteri yang terlihat dari jumlah koloni yang tumbuh, semakin tinggi konsentrasi yang digunakan maka semakin sedikit jumlah koloni yang tumbuh. Pada pengenceran bakteri 104 dalam inkubasi 6 jam terlihat pada sebagian data terjadi penurunan jumlah koloni bakteri, pada percobaan berikutnya terjadi penurunan dan kenaikan jumlah bakteri yang tumbuh sampai pada konsentrasi 20% bakteri tidak dapat tumbuh. Pada pengenceran bakteri 108 dalam inkubasi 3jam terlihat bahwa pada konsentrasi 1% dan 2,5% jumlah koloni bakteri hanya sedikit yang tumbuh dan bisa dikatakan bahwa bakteri tidak dapat tumbuh pada media, untuk konsentrasi 5% 7,5% 20% dan
kelompok kontrol terjadi kesalahan operator yang menyebabkan bakteri tetap tumbuh dalam media. Pada pengenceran bakteri 108 dalam inkubasi 6jam tidak terlihat bakteri yang tumbuh pada media.
Gambar 29. Jumlah koloni Bakteri pada petri media A.Kontrol Bakteri, B.ekstrak 20%, C.ekstrak 7,5%, D.ekstrak 5%, E.ekstrak 2,5%, F.ekstrak 1% pada pengenceran bakteri 104 dalam inkubasi 3 jam.
B C F E D A B I II I II I II I II I II I II
Gambar 28. Jumlah koloni Bakteri pada petri media A.Kontrol Bakteri, B.ekstrak 20%, C.ekstrak 7,5%, D.ekstrak 5%, E.ekstrak 2,5%, F.ekstrak 1% pada pengenceran bakteri 104 dalam inkubasi 6 jam.
B C F E D A I II I II I II I II I II I II
Gambar 29. Jumlah koloni Bakteri pada petri media A.Kontrol Bakteri, B.ekstrak 20%, C.ekstrak 7,5%, D.ekstrak 5%, E.ekstrak 2,5%, F.ekstrak 1% pada pengenceran bakteri 108 dalam inkubasi 3 jam.
A B C F D E I II I II I II I II I II I II
Gambar 30. Jumlah koloni Bakteri pada petri media A.Kontrol Bakteri, B.ekstrak 20%, C.ekstrak 7,5%, D.ekstrak 5%, E.ekstrak 2,5%, F.ekstrak 1% pada pengenceran bakteri 108 dalam inkubasi 6 jam.
B C D I II E I II F I II I II I II I II A I II
Gambar 31. Diagram jumlah koloni bakteri pada percobaan ekstrak batang kemuning dengan konsentrasi 1% 2,5% 5% 7,5% dan 20% terhadap Fusobacterium nucleatum dengan pengenceran bakteri 104 dalam waktu inkubasi 3 jam dan 6 jam.
Pada diagram diatas terlihat bahwa bakteri yang tumbuh pada media dalam inkubasi 3jam yaitu warna merah dan biru, untuk inkubasi 6jam dengan warna hijau dan ungu. Terlihat penurunan jumlah pertumbuhan bakteri dalam inkubasi bakteri 3jam. Hal tersebut menunjukan bahwa bakteri mengalami penurunan jumlah dalam pertumbuhannya, namun tidak membunuh bakteri. Pada inkubasi 6 jam terdapat bakteri yang tumbuh melebihi kontrol tanpa perlakuan, namun terjadi penurunan jumlah koloni bakteri yang tumbuh hingga pada konsentrasi 20% tidak terdapat bakteri yang tumbuh akibat adanya pengaruh konsentrasi ekstrak bahan dan lama inkubasi yang dilakukan.
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 1% 2,50% 5% 7,50% 20% kontrol bakteri 10.4 10.4 104 A 104 B 104 A 104 B 3 jam 6 jam
Gambar 32. Diagram jumlah koloni bakteri pada percobaan ekstrak batang kemuning dengan konsentrasi 1% 2,5% 5% 7,5% dan 20% terhadap Fusobacterium nucleatum dengan pengenceran bakteri 108 dalam waktu inkubasi 3 jam dan 6 jam.
Pada diagram diatas untuk bakteri yang tumbuh pada media dalam inkubasi 3jam yaitu warna merah dan biru, untuk inkubasi 6jam dengan warna hijau dan ungu. Pada konsentrasi 5% dan 7,5% dan terjadi kesalahan operator yang menyebabkan bakteri tetap tumbuh pada media.Terlihat pada inkubasi 3jam konsentrasi 1% dan 2,5% terdapat sedikit bakteri yang tumbuh dan bisa dikatakan bahwa bakteri tidak dapat tumbuh pada media. Hal tersebut menunjukan bahwa bakteri tidak dapat dapat tumbuh pada petri media. Pada inkubasi 6 jam tidak terdapat bakteri yang pada media, hal ini menunjukan bahwa ada pengaruh inkubasi bakteri dan pengenceran bakteri dalam memperngaruhi pertumbuhan F.nucleatum.
0 50 100 150 200 250 300 350 400 1% 2,50% 5% 7,50% 20% kontrol bakteri 10.8 10.8 104 A 104 B 104 A 104 B 6 jam 3 jam
BAB 6
PEMBAHASAN
Penelitian eksperimental laboratorium secara in vitro mengenai ekstrak batang kemuning (Murraya paniculata (L) Jack) terhadap Fussobacterium nucleatum adalah untuk membuktikan bahwa konsentrasi ekstrak batang kemuning memiliki efek antibakteri dalam menghambat pertumbuhan Fusobacterium nucleatum. dalam eksperimen ini, telah dilakukan prosedur ekstraksi batang kemuning dengan menggunakan pelarut etanol 80%, karena senyawa aktif yang terdapat pada batang kemuning dapat terlarut dengan etanol, 80% dimaksudkan untuk konsentrasi pelarut yang sedang agar pelarut tidak mudah menguap dan tidak susah untuk mengeringkan pelarutnya (terlalu encer). Disamping itu, diketahui bahwa pelarut etanol adalah lebih aman dari metanol. Batang kemuning yang dipakai adalah batang dari tanaman hidup yang segar yang tumbuh bebas yang dijadikan hiasan kemudian diambil batang nya dan dikeringan kedalam lemari pengering untuk menghindari kontaminasi. Batang kemuning yang dipergunakan sebanyak 500 gram karena diperkirakan akan menghasilkan ekstrak kental yang cukup untuk dilakukan pengujian efek antibakteri terhadap Fusobacterium nucleatum.
Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah dengan cara maserasi, dengan tujuan untuk memberi kesempatan simplisia berdifusi ke dalam pelarut. Kemudian dilakukan perkolasi hingga diperoleh maserat cair, kemudian dilakukan penguapan dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator untuk memisahkan antara ekstrak dengan etanol dan juga menghindari terjadinya kerusakan kandungan kimia dari bahan yang diekstraksi.6, 15
Pada tahap awal, pengujian efek antibakteri suatu bahan dilakukan secara in vitro. Terdapat dua tahap pada pengerjaan yaitu mencari zona hambat bakteri dengan menggunakan cakram dan dayar bunuh bakteri dengan menghitung koloni bakteri. Konsentrasi yang digunakan untuk ekstrak batang kemuning ialah 1% 2,5% 5% 7,5%
dan 20% dilakukan penambahan konsentrasi 20% dimaksudkan untuk melihat efek antibakteri dengan konsentrasi makro dan dapat mempermudah pengenceran ekstrak bahan kedalam bentuk konsentrasi lainnya, telah dilakukan peneliti sebelumnya Steven dan Trimurni (2007) menggunakan konsentrasi yang sama yaitu 1% 2,5% 5% 7,5% dan hasil dari penelitian tersebut ialah pada masing-masing konsentrasi memiliki zona bening dan zona hambat paling besar terletak pada konsentrasi 7,5% yang menunjukan bahwa terhambatnya pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans. Peneliti menggunakan metode pengamatan zona bening pada cakram untuk menentukan kadar hambat bakteri. Penggunaan metode ini dilakukan pada peneliti sebelumnya supaya lebih mudah dalam melihat zona hambat bakteri. Untuk kadar bunuh bakteri digunakan metode perhitungan jumlah koloni bakteri (dilusi) karena bahan coba dapat berkontak langsung dengan bakteri, sehingga hasil yang diperoleh lebih akurat. Ekstrak bahan dilakukan pencampuran dengan DMSO 10%, hal tersebut dilakukan karena sifat fisis dari DMSO itu sendiri yang dapat membawa zat atau kandungan kimia yang ada pada ekstrak bahan. Kemudian DMSO memiliki sifat tegangan permukaan yang tinggi yang menyebabkan bakteri tumbuh menjauhi cakram yang sudah diteteskan ekstrak bahan, DMSO juga memiliki sifat cepat menguap sehingga bakteri dapat tumbuh kembali mendekati cakram.15
Peneliti mengkultur Fusobacterium nucleatum dengan menggunakan media Brain Heart Infusion (BHI) karena Fusobacterium nucleatum dapat tumbuh dengan baik dalam media BHI.21 Penelitian sebelumnya menggunakan media MHA untuk mengkultur bakteri, tetapi disebabkan bakteri yang berbeda, maka peneliti menggunakan media BHI.
Peneliti juga menggunakan dua konsentrasi bakteri pada perhitungan jumlah koloni bakteri yaitu 104 dan 108 untuk melihat apakah beda konsentrasi bakteri dapat mempengaruhi jumlah pertumbuhan bakteri. Peneliti juga menggunakan interval waktu inkubasi untuk mengetahui perbedaan jumlah bakteri yang ada pada waktu inkubasi yang berbeda yaitu selama 3 jam dan 6 jam, seperti yang sudah dikemukakan oleh peneliti sebelumnya (Thilages dan Trimurni 2012) dengan pemberian waktu untuk bakteri tumbuh dan berinteraksi dengan ekstrak bahan selama
3 jam dan 6 jam. Interval waktu ini adalah sesuai dengan kurva pertumbuhan bakteri dimana bakteri akan berada dalam fase pertumbuhan yang optimal.31
Gambar 31. Kurva pertumbuhan Fusobacterium nucleatum 31
Efek Antibakteri Dengan Metode Cakram
Pada penelitian ini, pertumbuhan bakteri masih terdapat pada semua konsentrasi bahan yang diuji cobakan, hal ini ditunjukan dengan tidak terbentuknya zona bening disekitar cakram dan media. Pada konsentrasi 1% tidak terdapat zona bening disekitar cakram yang sudah ditetesi ekstrak batang kemuning, begitu juga pada konentrasi 2,5% 5% 7,5% bahkan pada konsentrasi 20% tidak terdapat zona bening disekitar cakram . Suatu ekstrak bahan dikatakan memiliki daya hambat apabila konsentrasi ekstrak yang dicobakan terdapat zona bening yang terbentuk antara cakram yang sudah ditetesi ekstrak pada petri media yang sudah disuspensikan Fusobacterium nucleatum, pada percobaan tersebut tidak ditemukan. Hal ini berbeda dengan penelitian yang dilakukan oleh Steven sebelumnya, ini dikarenakan konsentrasi bahan coba yang masih terlalu kecil, bakteri yang tahan terhadap bahan coba dan pertumbuhan bakteri yang cepat. Sehingga ketika diuji tidak terlihat zona
bening disekitar cakram yang sudah diteteskan ekstrak bahan yang mengakibatkan tidak didapatkannya zona hambat bakteri dengan metode ini.
Efek Antibakteri Bahan Coba Dengan Metode Perhitungan Koloni Bakteri
Pada penelitian untuk melihat pertumbuhan bakteri, setelah dilakukan inkubasi 3 jam dan 6 jam kemudian dilakukan peletakan pada perti kemudian diinkubasi selama 24 jam dan dilakukan pengamatan, diperoleh hasilnya adalah bakteri tetap dapat tumbuh dan berkembang pada masing-masing konsentrasi ekstrak bahan. Dari hasil penelitian, pada pengenceran bakteri 104 dalam inkubasi 3jam terjadi penurunan jumlah bakteri yang terlihat dari jumlah koloni yang tumbuh, semakin tinggi konsentrasi yang digunakan maka semakin sedikit jumlah koloni yang tumbuh. Pada pengenceran bakteri 104 dalam inkubasi 6 jam terlihat pada sebagian data terjadi penurunan jumlah koloni bakteri, pada percobaan berikutnya terjadi penurunan dan kenaikan jumlah bakteri yang tumbuh sampai pada konsentrasi 20% bakteri tidak dapat tumbuh. Pada pengenceran bakteri 108 dalam inkubasi 3jam terlihat bahwa pada konsentrasi 1% dan 2,5% jumlah koloni bakteri hanya sedikit yang tumbuh dan bisa dikatakan bahwa bakteri tidak dapat tumbuh pada media.
Terdapat perbedaan hasil penelitian yang dilakukan dengan penelitian Steven dengan mencari zona hambat menggunakan cakram, dimana konsentrasi ekstrak bahan 1% 2,5% 5% 7,5% dan 20% yang dicobakan dengan cakram tidak memperlihatkan zona bening yang menunjukan bahwa konsentrasi yang dicobakan tidak dapat menghambat pertumbuhan bakteri.
Terdapat persamaan hasil penelitian yang dilakukan dengan penelitian Thilages dengan menghitung jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada media yang sudah diberikan ekstrak bahan dengan Fusobacterium nucleatum dengan pengenceran 104 dan 108 dalam inkubasi 3 jam dan 6 jam, namun berbeda nilai konsentrasi yang membuat bakteri tidak dapat tumbuh pada media.
Fusobacterium nucleatum memiliki keistimewaan pada lapisan selnya yang membedakan dengan bakteri lain yaitu karakteristik bakteri gram negatif. Lapisan selnya dilindungi oleh membran luar dan membran dalam yang dipisahkan oleh ruang periplasmik yang terdiri atas lapisan peptidoglikan. Lapsisan sel tersebut yang sulit untuk ditembus dari ektrak bahan coba. Pada umumnya membran dalam bakteri gram negatif mengandung phospolipid yang simetris dengan perbandingan yang seimbang antara phospolipid dan protein. Membran luar berfungsi sebagai penyaring molekul dan merupakan membran asimetris yang terdiri dari lapisan phospolipid, lipopolisakarida (LPS), lipoprotein dan protein. Dengan demikian sepertiga dari massa membran Fusobacterial adalah protein.20
Ekstrak batang kemuning memiliki beberapa senyawa aktif yaitu flavonoid, kumarin, saponin, triterpena atau steroida, alkaloid dan tanin. Trimurni (2000) meneliti dan menemukan bahwa senyawa alkaloid dan kumarin adalah kandungan yang paling tinggi yang terdapat pada batang kemuning dan lebih bersifat meredakan nyeri dari pada mengeliminasi bakteri. Kandungan senyawa lainnya memiliki mekanisme kerja sebagai antibakterial yang mampu berikatan dengan bakteri dan juga mengganggu pertumbuhan bakteri hingga pada kematian sel bakteri. Kandungan ekstrak batang kemuning yang merupakan minyak atsiri (bersifat minyak) sulit untuk dapat menembus membran bakteri pada saat bahan diujicobakan, khusus nya pada percobaan dengan pengenceran bakteri 104 dalam inkubasi 3 jam.
Dari hasil penelitian, penggunaan konsentrasi pada metode cakram tidak memperlihatkan zona bening pada media yang menunjukan konsentrasi tidak efektif, maka hipotesa yang pertama tidak dapat diterima. Pada percobaan dengan menghitung koloni bakteri, bakteri ditemukan mati pada konsentrasi ekstrak bahan 20% dengan pengenceran bakteri 104 dalam inkubasi 6 jam. Hal tersebut menunjukan bahwa ada pengaruh antibakteri ekstrak bahan yag dicobakan dengan pengenceran bakteri dan lama waktu inkubasi.
BAB 7
