HASIL PENELITIAN
5.2 Uji Efektivitas Antibakteri
Pengujian efektivitas antibakteri bahan coba dilakukan dengan penentuan KHM yang dilanjutkan dengan penentuan KBM. Pada penentuan KHM yang dilihat adalah tabung tiap konsentrasi bahan coba (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,125%, 3,125%, dan seterusnya) pada tabung perlakuan yang mulai tampak jernih bila dibandingkan dengan kontrol Mc Farland. Penentuan konsentrasi berdasarkan standar RSKI UNAIR dengan metode dilusi. Pada hasil pengamatan diperoleh nilai KHM pada konsentrasi 12,5% (Gambar 12), karena pada konsentrasi dibawah 12,5% mulai tampak adanya kekeruhan jika dibandingkan dengan kontrolpositif (Mc. Farland)setelah diinkubasi 24 jam(Gambar 13 dan 14). Selanjutnya dilakukan penghitungan jumlah koloni bakteri menggunakan metode Pour Plate yang bertujuan untuk membuktikan bahwa tingkat kekeruhan pada setiap konsentrasi menunjukkan kemampuan bahan coba membunuh bakteri sebesar 99,9%-100%, yang disebut KBM. Pada penelitian ini, diperoleh bahwa ekstrak umbi lobak (Raphanus sativus L.) memiliki efek antibakteri terhadap Fusobacterium nucleatum dengan nilai KBM adalah 25%.(Tabel2)
Tabel 2. Hasil uji efek antibakteri ekstrak etanol umbi lobak (Raphanus sativus L.) terhadap Fusobacterium nucleatum pada konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%.
Bahan Uji Replikasi (CFU/ml)* Konsentrasi Kontrol positif (bakteri) (CFU/ml) Kontrol negatif (bahan uji) (CFU/ml) 100% 50% 25% 12,5% Ekstrak etanol umbi lobak (Raphanus sativus L.) 1 0 0 0 7×106 2,1×108 0 2 0 0 0 5×106 2,1×108 0 3 0 0 0 5×106 2,8×108 0 4 0 0 0 3×106 3,2×108 0 X 0 0 0 5×106 2,55×108 0
Keterangan : 0 CFU/ml = steril, tidak dijumpai pertumbuhan bakteri Setiap CFU/ml telah dikali 10 (faktor pengali)
Tabel 2, menunjukkan hasil pengujian efek antibakteri (penghitungan jumlah koloni yang terbentuk) terhadap Fusobacterium nucleatum pada bahan coba dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%. Pada media yang diberi ekstrak etanol umbi lobak (Raphanus sativus L.) dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, kontrol negatif menunjukkan hasil 0 CFU/ml atau steril dan menunjukkan hasil yang sama disetiap replikasi yang berarti bahwa setelah penanaman pada media TSA dan diinkubasi selama 24 jam dalam suhu 37°C tidak dijumpai pertumbuhan bakteri Fusobacterium nucleatum atau semua bakteri mati (Gambar 15, 17, 18 dan 19). Sedangkan pada media kontrol positif dijumpai pertumbuhan bakteri dengan jumlah rata – rata dari semua replikasi adalah 2,55×108 CFU/ml dan media yang diberi ekstrak etanol umbi lobak (Raphanus sativus L.) dengan konsentrasi 12,5% dijumpai adanya pertumbuhan bakteri dengan jumlah rata – ratadari semua replikasi adalah 5×106CFU/ml.(Gambar 16 dan 20)
Gambar 12. Hasil uji KHM pada konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, dan kontrol positif setelah dinkubasi 24 jam pada suhu 37°C
Gambar 14. Hasil uji KHM yang menunjukkan adanya kekeruhan pada konsentrasi (a) 6,25%, (b) 3,125%, (c) 1,56%, (d) 0,78%, (e) 0,39% yang dibandingkan dengan (f) kontrol positif
a b c d e f
Gambar 13. Hasil uji KHM yang menunjukkan tidak adanya kekeruhan pada konsentrasi (a)12,5% sebelum 24 jam, (b)12,5% setelah 24 jam a b
a b
c d
Gambar 15. Hasil uji bahan coba kontrol negatif (a) replikasi I, (b) replikasi II, (c) replikasi III, (d) replikasi IV yang menunjukkan hasil tidak adanya pertumbuhan bakteri (steril)
a b
c d
Gambar 16. Hasil uji bahan coba kontrol positif (a) replikasi I sebesar 2,1×108 CFU/ml, (b) replikasi II sebesar 2,1×108 CFU/ml, (c) replikasi III sebesar 2,8×108 CFU/ml, (d) replikasi IV sebesar 3,2×108 CFU/ml
Gambar 17. Hasil uji bahan coba konsentrasi 100% (a) replikasi I, (b) replikasi II, (c) replikasi III, (d) replikasi IV yang menunjukkan hasil tidak adanya pertumbuhan bakteri (steril)
a b
Gambar 18. Hasil uji bahan coba konsentrasi 50% (a) replikasi I, (b) replikasi II, (c) replikasi III, (d) replikasi IV yang menunjukkan hasil tidak adanya pertumbuhan bakteri (steril)
a b
Gambar 19. Hasil uji bahan coba konsentrasi 25% a) replikasi I, (b) replikasi II, (c) replikasi III, (d) replikasi IV yang menunjukkan hasil tidak adanya pertumbuhan bakteri (steril)
a b
Data hasil penelitian ini tidak dapat dilakukan uji statistik ANOVA dan LSD karena berdasarkan uji normalitas terdapat 4 kelompok data yang nilainya tidak normal yaitu konsentrasi 100%, 50%, 25%, dan kontrol negatif. Hal ini dikarenakan hasil yang diperoleh dari jumlah bakteri adalah 0 CFU/ml (steril). Sehingga pada penelitian ini digunakan uji non-parametrik yaitu Uji Kruskal-Wallis dan Uji Mann-Whitney.
Gambar 20. Hasil uji bahan coba konsentrasi 12,5% yang menunjukkan hasil adanya pertumbuhan bakteri pada (a) replikasi I sebesar 7×106 CFU/ml, (b) replikasi II sebesar 5×106 CFU/ml, (c) replikasi III sebesar 5×106 CFU/ml, (d) replikasi IV sebesar 3×106 CFU/ml
a b
Tabel 3. Hasil uji non-parametrik Kruskal-Wallis
No. Konsentrasi n Median ±Interquartile range p value
1. 100% 4 0 0,000 2. 50% 4 0 0,000 3. 25% 4 0 0,000 4. 12,5% 4 5 ± 3 0,000 5. Kontrol + 4 245 ± 100 0,000 6. Kontrol - 4 0 0,000
Tabel 4. Hasil uji non-parametrik Mann-Whitney
No. Konsentrasi Konsentrasi p value
1. 100% 50% 1,000 25% 1,000 12,5% 0,013 Kontrol + 0,013 Kontrol - 1,000 2. 50% 25% 1,000 12,5% 0,013 Kontrol + 0,013 Kontrol - 1,000 3. 25% 12,5% 0,013 Kontrol + 0,013 Kontrol - 1,000 4. 12,5% Kontrol + 0,019 Kontrol - 0,013 5. Kontrol + Kontrol - 0,013
Dari hasil uji statistik Kruskal-Wallis diperoleh nilai p-value = 0,000 (p<0,05) yang menyatakan bahwa ekstrak etanol umbi lobak (Raphanus sativus L.) memiliki efek antibakteri yang signifikan terhadap Fusobacterium nucleatum. Dari hasil pengujian yang memiliki nilai median dan interquartile range adalah konsentrasi 12,5% dengan nilai median sebesar 5 dan interquartile range sebesar 3, serta nilai median dari kontrol positif sebesar 245 dan interquartile range sebesar 100 (Tabel3). Pada uji statistik Mann-Whitney menunjukkan adanya perbedaan signifikan antara
setiap konsentrasi 100% yang dibandingkan dengan konsentrasi 12,5% serta kontrol positif, konsentrasi 50% yang dibandingkan dengan konsentrasi 12,5% serta kontrol positif, konsentrasi 25% yang dibandingkan dengan konsentrasi 12,5% serta kontrol positif, dan kontrol negatif yang dibandingkan dengan konsentrasi 12,5% serta kontrol positif menunjukkan nilai p<0,05. Hasil uji yang membandingkan konsentrasi antara 100% dengan 50%, 25%, dan kontrol negatif, menunjukkan nilai p>0,05 yang berarti tidak ada perbedaan signifikan. Perbandingan konsentrasi antara 50% dengan 25% dan kontrol negatif,menunjukkan nilai p>0,05 yang berarti tidak ada perbedaan signifikan.Perbandingan konsentrasi antara 25% dengan kontrol negatif, menunjukkan nilai p>0,05 yang berarti tidak ada perbedaan signifikan. (Tabel4)
BAB 6 PEMBAHASAN
Penelitian eksperimental laboratorium ini dimulai dengan melakukan identifikasi terhadap umbi lobak yang akan digunakan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI). Dari hasil identifikasi diperoleh bahwa umbi lobak merupakan salah satu jenis Raphanus sativus L. dengan suku Brassicaceae,setelah mendapatkan hasil identifikasi maka dilanjutkan dengan pembuatan ekstrak umbi lobak dengan menggunakan 300 gram simplisia umbi lobak yang dilarutkan dengan pelarut etanol 70% hingga diperoleh ekstrak kental 250 gram, yang diperkirakan cukup sebagai bahan coba dalam pengujian aktivitas antibakteri terhadap Fusobacterium nucleatum.
Ekstraksi umbi lobak (Raphanus sativus L.) dilakukan dengan menggunakan pelarut etanol 70%. Penggunaan etanol dapat melarutkan seluruh bahan aktif yang terkandung dalam suatu bahan alami yang bersifat polar, semipolar maupun non polar. Selain itu, pelarut etanol diketahui lebih aman (tidak bersifat toksik) dibandingkan dengan metanol.69
Umbi lobak (Raphanus sativus L.) yang dipakai adalah umbi lobak yang masih segar, bertujuan untuk menghindari rusaknya kandungan zat akibat proses enzimatis. Umbi lobak yang diperlukan sebanyak 5 kg dan diperoleh simplisia 300 gram yang disesuaikan dengan kebutuhan bahan uji ekstrak dan dilarutkan dengan etanol 70%. Umbi lobak (Raphanus sativus L.) bersifat tidak toksik dan biokompatibel karena dapat dikonsumsi, serta memiliki sifat antibakteri, antiinfeksi, antitumor. Berdasarkan hal tersebut maka peneliti memutuskan untuk menggunakan bagian umbi untuk diujicoba.32
Dalam hal ini, senyawa aktif umbi lobak (Raphanus sativus L.) yang berkhasiat sebagai antibakteri adalah tannin, saponin, coumarin, flavonoid, alkaloid, dananthraquinone.30,33-35Tannin mampu memiliki aktivitas antibakteri pada inaktivasi sifat adhesi bakteri, enzim, selubung envelope bakteri, dan protein transpor bakteri.Saponin mempunyai beberapa aktivitas antibakteri melalui penggabungan
dengan membran sel untuk menimbulkan perubahan morfologi sel yang mengakibatkan sel lisis.Sifat antimikroba coumarin dengan mengubah konformasi dari asam nukleat dan menghambat replikasi DNA dari bakteri, yang menyebabkan modifikasi dalam pertumbuhan sel bakteri dan inhibitor enzim. Kemampuan flavonoid disebabkan oleh kemampuannya untuk bergabung dengan bagian ekstraseluler, protein yang larut, dinding sel bakteri, serta merusak membran sel bakteri.Mekanisme kerja antibakteri dari alkaloid adalah kemampuan alkaloid untuk berikatan dengan DNA sel, penghambatan enzim (esterase, RNA polimerase, DNA polimerase), penghambatan respirasi sel sehingga menggangu fungsi sel.Quinonejuga memiliki potensi yang tinggi pada efek antimikroba, dengan target yang terdapat pada sel mikroba yaitu adhesin yang terdapat pada permukaan, polipeptida dinding sel, dan enzim yang berikatan dengan membran. Dengan mekanisme diatas diduga ekstrak umbi lobak(Raphanus sativus L.) mampu membuat sel bakteri lisis dan mati.56-68
Pada penelitian ini pengujian aktivitas antibakteri ekstrak umbi lobak (Raphanus sativus L.) terhadap Fusobacterium nucleatum dilakukan dengan cara metode dilusi. Dengan metode dilusi bahan coba dapat berkontak langsung dengan mikroorganisme, sertadapat diketahui nilai KHM dan KBM dari bahan coba. Metode dilusi dilakukan dengan cara pengenceran berganda dari konsentrasi awal, sehingga konsentrasi yang didapatkan adalah setengah dari konsentrasi awal. Dalam penelitian ini konsentrasi yang dipakai adalah dimulai dari 100%, kemudian dilakukan pengenceran hingga di dapatkan konsentrasi minimal yang dapat menghambat dan membunuh bakteri.70Pada metode dilusi ini menggunakan media TSB dan TSA karena media tersebut memiliki kandungan yang sesuai untuk pertumbuhan
Fusobacterium nucleatum yaitutrypticase, peptone, dan ekstrak ragi.14Penghitungan jumlah koloni bakteri dilakukan dengan metode Pour Plate karena metode ini lebih memudahkan dalam menghitung jumlah koloni yang terbentuk.Penentuan konsentrasi disesuaikan berdasarkan standard konsentrasi pengujian antibakteri yang ada di Laboratorium Rumah Sakit Khusus Infeksi, UNAIR.
Berdasarkan hasil penelitian metode penentuan nilai KHM dan KBM dengan diawali pencarian nilai KHM ini menunjukkan bahwa dari semua konsentrasi bahan
coba yang diuji, diperoleh konsentrasi dibawah 12,5% mulai tampak kekeruhan yang setara jika dibandingkan dengan kontrol positif setelah diinkubasi 24 jam. Setiap konsentrasi tersebut dimulai dari 100% hingga 12,5% dilakukan penanaman pada TSA yang kemudian direplikasi sebanyak 4 sampel. Ekstrak etanol umbi lobak (Raphanus sativus L.) dari konsentrasi 100% hingga 25% tidak ditemui pertumbuhan bakteri (media steril) dengan jumlah koloni 0 CFU/ml(steril), sedangkan pada konsentrasi 12,5% terbentuk koloni dengan rata – rata 5×106CFU/ml. Berdasarkan hasil penelitian, maka hipotesis penelitian ini diterima yaitu ada efek antibakteri ekstrak etanol umbi lobak (Raphanus sativus L.) terhadap Fusobacterium nucleatum
ATCC 25586 dengan nilai KHM 12,5% dan nilai KBM 25%, dengan pengujian statistik yang menunjukkan hasil yang signifikan.
Di Indonesia telah banyak perkembangan tentang penelitian mengenai bahan alami sebagai obat herbal dan juga sebagai bahan alternatif medikamen saluran akar. Penelitian yang dilakukan oleh Amalia (2013) menunjukkan bahwa ekstrak etanol siwak (Salvadora persica L.) terhadap bakteri Fusobacterium nucleatum diperoleh nilai KBM 100% dan penelitian dari Vika (2014) mengenai ekstrak etanol daun Afrika (Vernonia amygdalina) yang dapat membunuh bakteri Fusobacterium nucleatum dengan nilai KBM 12,5%. Perbedaan efek antibakteri dari berbagai bahan alami dapat disebabkan oleh perbedaan kadar dan jenis kandungan zat aktif antibakteri dari masing – masing ekstrak bahan coba.28,29
Beberapa penelitian ekstrak umbi lobak (Raphanus sativus L.) juga telah dilakukan dengan pengujian pada bakteri lain. Penelitian dari Janjua et al. (2013) menunjukkan hasil KHM dari ekstrak etanol dari Raphanus sativusdengan konsentrasi 50 mg/ml dapat menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus (20 ± 0,6 mm), B. subtilis (21 ± 1,0 mm), M. luteus (22 ± 1,5 mm), E. aerogenes (19 ± 1,0 mm), S. typhi (3 ± 1,3 mm), E. coli (21 ± 1,1 mm), K. pneumoniae (17 ± 2,4 mm),
P. aureginosa (14 ± 0,8 mm), B. bronchiseptica (22 ± 0,7 mm).35Perbedaan kosentrasi hambat terhadap bakteri yang diujicoba tersebut dapat dikarenakan oleh perbedaan asal tanaman, kualitas ekstrak, dan bakteri yang digunakan. Pada penelitian ini, peneliti menggunakan umbi lobak (Raphanus sativus L.) yang berasal
dari Desa Gajah, Kecamatan Simpang Empat, Kabupaten Tanah Karo, Provinsi Sumatera Utara, Indonesia. Kualitas ekstrak yang digunakan dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor, salah satunya adalah faktor biologis dari tumbuhan yang digunakan seperti perbedaan daerah dan keadaan geografis tanah yang memberi pengaruh pada kadar kandungan senyawa aktif yang terdapat dalam umbi lobak (Raphanus sativus L.).69
Perbedaan jenis bakteri yang digunakan juga menjadi salah satu kemungkinan penyebab perbedaan hasil efek antibakteri ekstrak umbi lobak (Raphanus sativus L.) oleh karena perbedaan morfologi dari setiap jenis bakteri. Pada penelitian ini, peneliti menggunakan bakteri Fusobacterium nucleatum yang merupakan salah satu jenis bakteri gram negatif. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa umbi lobak (Raphanus sativus L.) memiliki efektivitas antibakteriyang lebih tinggi pada bakteri gram positif daripada bakteri gram negatif. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh bakteri gram negatif memiliki struktur dinding sel yang lebih kompleks daripada bakteri gram positif. Bakteri gram negatif memiliki membran tambahan di luar lapisan peptidoglikan yang dipisahkan oleh ruang periplasmik. Bakteri gram negatif memiliki membran luar yang terdiri dari lapisan fosfolipid, lipopolisakarida, lipoprotein, dan protein sehingga kemungkinan ekstrak umbi lobak kurang sensitif terhadap bakteri gram negatif.14
Penelitian ini membuktikan bahwa hipotesis diterima dengan bahan ekstrak etanol umbi lobak (Raphanus sativus L.) yang memiliki efektivitas antibakteri secara
in vitroterhadap Fusobacterium nucleatum dengan konsentrasi minimal yang menghambat pertumbuhan bakteri pada konsentrasi 12,5% dan konsentrasi minimal yang dapat membunuh bakteri yaitu 25%. Hal ini kemungkinan akan menunjukkan hasil yang berbeda jika diaplikasikan dalam saluran akar karena bakteri yang terdapat dalam saluran akar adalah polimikrobial dan bakteri Fusobacterium nucleatum juga bersifat sebagai salah satu bakteri yang di dalam saluran akar dapat memiliki kemampuan untuk membentuk dan mendukung suatu lapisan biofilm. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian in vivo sebagai penelitian lanjutan sehingga umbi lobak (Raphanus sativusL.) dapat digunakan sebagai bahan medikamen saluran akar.
BAB 7
