BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.2. Pembahasan
4.2.1. Uji Ekotoksikologi
Penggunaan embrio ikan genus Oryzias sebagai sentinel organism telah dilakukan oleh beberapa peneliti mulai dari untuk mendeteksi logam toksik seperti metilmerkuri (Dial, 1978); Ismail & Yusof, 2011; Dong et al., 2016), kadmium (Michibata, 1981; Barjhoux et al., 2012), pestisida (Yusof et al., 2014) hingga radiasi ultra violet (Sayed & Mitani, 2016). Penggunaan embrio Oryzias untuk mendeteksi dampak pencemaran plastik juga sudah dilakukan oleh Chen et al.,
(2020). Peneliti ini menggunakan embrio Oryzias melastigma yang merupakan spesies yang hidup di air laut.
Penelitian uji ekotoksikologi embrio ikan Medaka Sulawesi, Oryzias celebensis belum pernah dilakukan. Dalam penelitian ini digunakan beberapa parameter yang bisa diukur dengan alat yang mudah diakses yang hampir setiap laboratorium memunyainya, yaitu mikroskop dan kamera untuk mengambil gambar parameter yang digunakan. Parameter itu adalah waktu inkubasi telur (embrio) atau waktu menetas, diameter embrio, dan diameter lensa mata embrio.
Dari Gambar 51. Diameter telur ikan Oryzias celebensis yang dipapar dengan stiren. dapat dilihat bahwa waktu penetasan embrio Oryzias celebensis lebih pendek atau cepat pada embrio yang dipapar dengan stiren. Semakin tinggi konsentrasi stiren semakin cepat proses penetasannya. Beberapa bahan pencemar seperti tributiltin (Qiu et al., 2019), carbamazepine (Qiang et al., 2016), metilmerkuri (Bridges et al., 2016), PCB (Polychlorinated Biphenyl) (Socha et al., 2012), kadmium (Ługowska, 2007) dan kuprum (Wang et al., 2020) telah dibuktikan mempercepat penetasan beberapa embrio ikan air tawar, termasuk ikan genus Oryzias.
Embrio ikan medaka Oryzias latipes yang dipapar dengan tributiltin masa inkubasinya lebih pendek dibandingkan dengan kontrol (Qiu et al., 2019).
Kupsco & Schlenk, (2016) memapar embrio Oryzias latipes dengan selenomethionine pada fase perkembang embrio yang berbeda. Embrio pada fase 9 dan 17 lebih cepat menetas dibandingkan dengan embrio pada fase 25, 29 dan 34. Pada embrio Oryzias melastigma, Wang et al., (2020) melaporkan bahwa pada pemaparan dengan kuprum konsentrasi tinggi terjadi pelambatan waktu penetasan dan sebaliknya pada pemaparan dengan konsentrasi rendah embrio menetas lebih cepat dibandingkan perlakuan kontrol. Qiang et al., (2016) menemukan dalam penelitiannya bahwa carbamazepine memperpanjang ukuran panjang total larva yang menetas, meningkatkan pembentukan gelembung renang dan meningkatkan penyerapan laju kuning telur pada embrio ikan zebra. Kuning telur adalah sumber energi bagi embrio dalam bertumbuh dan penyerapannya menunjukkan energi yang dibutuhkan. Carbamazepine juga meningkatkan
gerakan-gerakan embrio sebelum menetas. Pada embrio ikan Pimephales promelas (fathead minnow) metilmerkuri menyebabkan hiperaktivitas dan memendekkan waktu inkubasi telur, sehingga telur lebih cepat menetas (Bridges et al., 2016). Pergerakan embrio yang distimulasi oleh bahan xenobiotik seperti stiren selain meningkatkan aktivitas pergerakan tubuh embrio juag meningkatkan gerakan organ tubuh seperti sirip. Sirip dada embrio Oryzias celebensis yang tipis menyerupai pisau, dimungkinkan semakin mempertipis korion yang membungkus embrio dengan gerakan kepakannya selama berada di selubung korion. Qiang et al., (2016) memapar embrio ikan zebra dengan carbamazepine 2 µg/. Konsentrasi ini meningkat 4,32 % gerakan embrio dibandingkan dengan perlakuan kontrol.
Gerakan operkulum embrio Oryzias latipes telah diteliti oleh Ishida (1944) menjadi sebab produksi enzim untuk penetasan.
Yamagami, (1981) mendeskripsikan peran enzim penetasan sebagai berikut: enzim aktif yang disekresikan dari kelenjar penetasan embrio menyerang korion (selubung telur) dari dalam dan melarutkan sebagian besar darinya.
Langkah choriolytic ini adalah yang paling penting dari semua langkah proses penetasan. Selang waktu yang relatif singkat (30 menit atau kurang pada 30 ° C) dari sekresi enzim melalui pelarutan sebagian besar bagian lapisan dalam torsi di Medaka. Fakta ini menunjukkan bahwa jumlah enzim yang disekresikan oleh embrio lebih dari cukup untuk mencerna korion tunggal.
Enzim ini disekresikan oleh sel-sel sekretori di epitel mulut dan rongga faring dan juga di permukaan operkulum embrio (Ishida, 1944). Lapisan tipis terluar yang tidak larut secara mekanis oleh enzim akan dirobek oleh ekor embrio (Suga, 1963). Dari sini tampak bahwa gerakan embrio mempercepat proses penetasannya.
Dari rentetan data dan penjelasan di atas, dapat disimpulkan bahwa percepatan penetasan yang distimulasi oleh stiren menjadikan embrio yang terpapar mempercepat laju metabolismenya sehingga mengonsumsi kuning telur lebih cepat. Selanjutnya energi dari kuning telur itu digunakan untuk mempercepat pertumbuhan dan gerakannya di dalam selubung korion. Selubung korion yang diganggu oleh gerakan sirip dada dan ekor serta gerakan aktif dari
badan embrio diduga menyebabkan embrio yang terpapar dengan stiren lebih cepat menetas dibandingkan dengan perlakuan kontrol. Oleh karena itu, dapat dikatakan bahwa terjadi pengaruh yang sinergi dan kontinum zat stiren terhadap percepatan penetasan, dari percepatan laju metabolisme, penggunaan energi pada kuning telur yang menghasilkan gerakan embrio yang menipiskan korion secara fisik dan kimiawi hingga menghasilkan proses penetasan yang lebih cepat dibandingkan dengan embrio kontrol.
Dengan demikian waktu penetasan embrio dapat dijadikan sebagai end-point atau biomarker dalam mendeterminasi toksisitas stiren pada konsentrasi yang rendah.
Analisis di atas perlu ditindaklanjuti dengan beberapa penelitian seperti 1.
pengaruh stiren terhadap ukuran atau volume kuning telur embrio ikan Oryzias celebesnsis, 2. Apakah ada perbedaan antara gerakan embrio yang dipapar dengan stiren dengan yang tidak dipapar dengan stiren, apakah stiren bisa mendilusi korion embrio ikan Oryzias celebensis, dengan menstimulasi kelenjar penetasan untuk memproduski enzim korionase 4. Apakah stiren dapat mengubah permeabilitas korion embrio Oryzias celebensis. Jika empat pertanyaan ini dapat dijawab oleh beberapa rangkaian penelitian, maka kegamangan apakah percepatan waktu penetasan embrio Oryzias celebensis dapat digunakan sebagai biomarker dapat diminimalisir.
Selanjutnya bila kita lihat Gambar 51 dan Gambar 57, diameter embrio Oryzias celebensis yang dipapar dengan stiren ukurannya berfluktuasi.
Sedangkan diameter embrio kontrol dan yang dipapar dengan seri konsentrasi kadmium diameternya secara statistik tidak ada perbedaan yang nyata selama masa inkubasi. Wang et al., (2020) memapar embrio Oryzias melastigma dengan kuprum yang berakibat pada peningkatan ukuran diameter embrio. Pada pemaparan konsentrasi rendah 0,01-0,04 mg/l, diameter embrio tidak berbeda nyata dengan perlakuan kontrol, sedangkan pada perlakuan 0,08-1,28 mg/l terjadi pembesaran diameter embrio. Hal ini menunjukkan bahwa permeabilitas korion embrio dipengaruhi oleh bahan pencemar yang denganya dapat memengarui sirkulasi larutan-larutan biokimiawi di dalam embrio. Fluktuasi diameter embrio
ini dapat diduga merupakan reaksi dari embrio untuk mengendalikan larutan biokimiawi di dalam embrio sehingga bahan-bahan kimia berbahaya dapat dikendalikan. Sebagai upaya dalam mengendalikan bahan pencemar yang ada di sekitarnya, embrio berusaha mengeluarkan bahan-bahan kimia berbahaya dengan meningkatkan permeabilitasnya. Oleh karena itu fluaktuasi diameter embrio yang terpapar dengan bahan kimia seperti stiren lebih merupakan upaya pertahanan dari embrio terhadap bahan kimia berbahaya yang ada di sekitarnya.
Kadmium dalam penelitian ini digunakan sebagai kontrol posistif untuk mengetahui apakah percobaan yang dilakukan sudah memenuhi prosedur dalam pengertian apakah ada kerusakan embrio ketika dipapar dengan dengan kadmium sebagai mana yang sudah dilakukan oleh beberapa peneliti terhadap embrio (Ismail & Yusof, 2011; Barjhoux et al., 2012; Barjhoux et al., 2016). Pemaparan dengan kadmium dengan konsentrasi 0,5 mg/l mengahsilkan kematian pada embrio waktu 24 jam sebagaimana yang terjadi pada embrio yang dipapar dengan stiren dengan konsentrasi 1 mg/l. Pada pemaparan dengan kadmium dengan konsetrasi 0,2 dan 0,1 mg/l masing-masing mengalami kematian setelah 72 jam (tiga hari) dan 144 ( enam hari) jam setelah pemaparan.
Pertanyaannya adalah mengapa belum terjadi kematian pada awal perkembangan embrio yang dipapar dengan kadmium terutama yang dipapar dengan kadmium konsentrasi rendah 0,1 mg/l. Jawabannya adalah konsentrasi kadmium di dalam embrio belum dalam konsentrasi yang mematikan pada masa awal perkembangan embrio. Kedua, semakin tua umur embrio, korion semakin menipis karena embrio memproduksi enzim korionase dan enzim-enzim lainnya yang dapat mencerna lapisan korion. Penipisan lapisan korion semakin mempertinggi daya serap embrio terhadap kadmium sehingga konsentrasi kadmium semakin banyak yang pada akhirnya akan merusak atau mematikan embrio.
End-point lain yang digunakan dalam penelitian ini adalah diameter lensa mata embrio. Sistem visual semakin dikenal sebagai target sensitif xenobiotik di ekosistem perairan. Berbagai polutan lingkungan dengan sifat fisikokimia yang berbeda dapat mengganggu perkembangan retina dan fungsi ikan teleos, termasuk
polutan seperti dioksin, penghambat api, pestisida, asam perfluoroalkyl, asam retinoat, dan logam (Lianguo, 2020). Dalam penelitian ini, hasilnya menunjukan bahwa pada lensa mata embrio yang berumur empat hari dari fertilisasi atau tiga hari dalam periode pemaparan menunjukkan adanya respon dengan pola yang tidak dependent pada seri konsetrasi, tetapi lebih cenderung pada pola J-Shape hormetic like effect.
Hormesis adalah fenomena respons dosis untuk mencari penjelasan mekanistik, fisiologis, dan evolusioner (Calabrese, 2005; Calabrese et al., 2016).
Istilah hormesis (yang berarti menggairahkan) dikemukakan pada tahun 1943 oleh Southam & Ehrlich (1943) dalam studi yang berhubungan dengan efek ekstrak cedar merah pada metabolisme jamur. Pada dekade awal abad ke-20 konsep hormesis disebut sebagai Hukum Arndt-Schulz atau disebut Aturan Hueppe.
Kedua istilah ini secara bertahap memudar dari penggunaannya. Bentuk kurva dosis-respons ini bisa berupa U terbalik (genta) atau bentuk J tergantung pada end-point yang diukur. Dalam kasus end-point seperti pertumbuhan, umur, kesuburan, dan fungsi kognitif, respons akan dilihat sebagai respons kelompok dan respons kelompok perlakuan di bawah NOEL. Dalam model ambang, satu-satunya 'perbedaan' antara nilai kontrol dan respon dosis pada dan di bawah NOEL diasumsikan sebagai variasi acak. Sebaliknya, dalam model hormetik berbentuk U terbalik (genta) atau J, respons terkait pengobatan yang sederhana terjadi tepat di bawah NOEL, respons yang diklaim dapat direproduksi, sering kali signifikan secara statistik dan umumnya dijelaskan secara mekanisme toksikologi/molekuler tertentu.
Efek hormetik ini bukanlah hal yang asing di dunia biologi. Calabrese &
Blain (2005) dan Calabrese & Baldwin (2003) menyebutkan bahwa lebih dari 9.000 contoh efek hormetik oleh pestisida, obat-obatan, atau radiasi, dan semuanya tidak tergantung pada dosis untuk zat tertentu.
Dalam penelitian dengan menggunakan diuron, Ibrahim et al., (2020) mengobservasi efek hormetik dalam bentuk genta pada detak jantung embrio ikan Oryzias javanicus. Pada hari ketiga pemaparan terjadi peningkatan laju detak jantung pada embrio yang dipapar dengan diuron dengan konsentrasi yang lebih
tinggi dari kontrol (1,25 mg/l). Akan tetapi laju detak jantung embrio menurun ke tingkat normal atau kontrol pada embrio yang dipapar dengan diuron dengan konsentrasi yang lebih tinggi (2,5-10 mg/l). Pada hari ke tuju gambaran hormetik bentuk genta menjadi kabur dan pada hari ke 13 laju detak jantung kontrol hanya berbeda dengan konsentrasi tertinggi. Pola respon laju detak jantung dari hari ke tiga hingga 13, berbentuk pola hormetik bentuk genta menuju pola dose-respons, semakin tinggi konsentrasi diuron semakin lambat laju detak jantung embrio Oryzias javanicus.
Dalam penelitian sekarang ini end-point diameter lensa mata menunjukkan respon terhadap stiren dalam pola hormetik dalam bentuk J (
Gambar 60). Dalam pola ini diameter lensa mata menurun ketika dipapar dengan stiren paling rendah yaitu 0,01 µg/l pada hari ke tiga pemaparan. Diameter lensa meningkat setelah dipapar dengan stiren dengan konsentrasi lebih tinggi. Pola hormetik ini secara statistik menjadi kabur pada waktu pemaparan hari ke enam.
Akan tetapi bila dilihat secara deskriptif pola hormetik bentuk J masih tampak pada pemaparan hari ke enam (Gambar 61). Pola hormetik ini didukung oleh analisis regresi linear baik pada hari ke tiga maupun ke enam. Pada hari ke tiga koefisien regresinya adalah sedang dan pada hari ke enam lemah. Hal ini menunjukkan pola respon lebih bagus dianalisis dengan pendekatan konsep hormesis dibandingkan dengan dose-dependent.
Dari penjelasan itu dapat dipahami bahwa end-point yang digunakan yaitu waktu penetasan dan diameter lensa mata merupakan end-point yang cukup potensial untuk digunakan untuk mendeteksi toksisitas stiren. Akan tetapi dua end-point itu masih perlu diteliti lebih detil untuk menjabarkan secara empiris, mekanisme yang mendasarinya. Setelah itu perlu dilakukan penelitian interdispliner untuk menciptakan alat deteksi diameter lensa mata embrio Oryzias celebensis berbasis teknologi digital dan Internet of Thing (IoT).