3 METODE PENELITIAN 28
3.3 Metode Penelitian 29
3.3.8 Uji khasiat dan efek toksikopatologis bubuk lintah laut kering pada
Hewan percobaan diberikan kolesterol dosis tinggi sehingga diharapkan terjadi hiperkolesterolemia. Bersamaan dengan itu hewan percobaan juga diberikan bubuk lintah laut kering untuk melihat peran atau potensinya dalam menekan atau menurunkan kolesterol. Selanjutnya juga dilihat kemampuannya dalam mencegah atau menekan terbentuknya lesi aterosklerosis dengan mengamati pembuluh darah jantung, sel hati dan ginjal kelinci yang mengalami perubahan.
Pada tahap penelitian ini digunakan kelinci 16 ekor masing-masing ditempatkan dalam satu kandang. Kelinci yang digunakan adalah jenis New Zealand White jantan berumur 4-5 bulan yang diperoleh dari Balai Penelitian Ternak Ciawi Bogor.
(
) (
)
(
−)
×10000 − − − EBB EB ESB ES EBB EBUji pada hewan percobaan
Pada tahap ini semua kelinci diberi ransum standar dan minum ad libitum selama 2 minggu. Sebelumnya berat kelinci ditimbang untuk mendapatkan gambaran awal berat badan kelinci. Selama periode adaptasi setiap kelinci diamati satu persatu kebiasaan makan, kondisi kesehatan, dan faktor lainnya yang dapat mempengaruhi keadaan kelinci sehingga dapat dikendalikan pada pengujian selanjutnya. Ransum kelinci yang diberikan adalah ransum standar jenis Rb 12 yang diproduksi oleh Balai Penelitian Ternak Ciawi Bogor. Komposisi ransum standar disajikan pada Tabel 5.
Tabel 5 Komposisi ransum standar Rb-12 dalam 100kg
No Bahan Jumlah (kg) 1 Tepung ikan 2 2 Bungkil kedelai 18 3 Bungkil kelapa 7 4 Jagung 20,5 5 Dedak 12,7
6 Pollard (dedak gandum) 10,5
7 Rumput gajah kering/daun tebu 22
8 Minyak sayur 3
9 Molase 2
10 Top mix (vitamin dan mineral) 0,3
11 Garam dapur 0,3
12 Kapur (kalsium karbonat) 0,5
13 Tepung tulang (dikalsium fosfat) 0,5
14 Susu skim 0,5
15 Natrium dikalsium fosfat 0,2
Untuk mencegah terjadinya stres pada kelinci karena transportasi, maka kelinci yang baru datang dipuasakan selama sehari, hanya diberi air gula 5%. Kemudian diberi pakan standar 2 kali sehari sebanyak 50 gram dan sisanya ditimbang. Setelah diperoleh jumlah pakan optimal selama seminggu, untuk seterusnya pemberian pakan dilakukan satu kali sehari sebanyak 100 gram demikian juga dengan pembersihan kandang.
Awal masa adaptasi semua kelinci diberi obat antikoksidia (sulfamix) dengan cara pemberian sesuai label yaitu 3-2-3 (3 hari berturut-turut diberi sesuai label, 2 hari istirahat dan 3 hari berikutnya diberi lagi). Pada dua hari istirahat antikoksi diberi obat cacing (Albendazol) dengan dosis sesuai label pada kemasan.
Kandang kelinci dan peralatan lainnya, kandang yang ditempati masing- masing kelinci berukuran 50x50x45 cm3 yang dilengkapi dengan tempat air minum dan ransum serta penampungan feses dan urin. Alat bantu lainnya seperti tempat kelinci pada waktu pengambilan darah dan penimbangan, timbangan kelinci, perlengkapan pengambilan darah serta wadah penyimpanannya.
Pada akhir masa adaptasi masing-masing kelinci ditimbang untuk mengetahui beratnya dan diambil darahnya dari telinga. Sebelum pengambilan darah, kelinci dipuasakan selama 12 jam. Kelinci dijadikan 4 kelompok yang masing-masing terdiri dari 4 ekor. Proses percobaan menggunakan hewan (kelinci) dapat dilihat pada Gambar 5.
Pemberian dosis tepung lintah laut berpedoman pada hasil uji aktivitas antioksidan yang telah dilakukan secara in vitro. Hasil diperoleh melalui konversi sehingga diperoleh dosis yang sesuai. Pada akhir pengujian, kelinci dimatikan dengan cara disembelih, menggunakan pisau tajam. Setelah darah dikeluarkan, kelinci dibedah dan dipisahkan hati, jantung dan ginjal, lalu difiksasi dalam formalin 10% selama 24 jam.
Setelah difiksasi hati, pembuluh darah jantung dan ginjal diiris kurang lebih 3 mm dan dilakukan proses dehidrasi menggunakan alkohol dengan konsentrasi bertingkat (70, 80, 90, dan 95%) selama 8 jam, dilanjutkan dengan alkohol absolut I, II, III masing-masing selama 2 jam. Selanjutnya potongan organ dijernihkan menggunakan xylol I dan II masing-masing 2 jam. Tahap selanjutnya potongan organ diinfiltrasi dengan parafin. Proses ini dilakuakan secara otomatis dengan mesin tissue processor dan tissueembedding console. Setelah jaringan mengeras, blok jaringan dipotong menggunakan mikrotom dengan ketebalan 4-5 mikron dan dilekatkan pada gelas objek.
Pewarnaan Hematosiklin Eosin (HE) dilakukan untuk melihat morfologi jaringan pembuluh darah aorta, hati, dan ginjal. Pewarnaan diawali dengan deparafinasi dan dehidrasi. Pewarnaan dengan HE selama 30 menit dan Eosin selama 2 menit. Setelah diwarnai sediaan dikeringkan terlebih dahulu sebelum ditetesi perekat Permount® dan kemudian ditutup dengan gelas penutup. Preparat siap untuk diamati menggunakan mikroskop cahaya.
Gambar 5 Proses pengujian pada hewan percobaan Kontrol negatif Ransum Kontrol positif Ransum Kolestrol 0,2% Obat Simvastatin 0,625 mg Ransum Kolestrol 0,2% Lintah laut Dosis 4% Ransum Kolestrol 0,2%
Kelinci Uji Kelinci Uji Kelinci Uji Kelinci Uji 3 Ekor 3 Ekor 3 Ekor 3 ekor
- 2 0 4 8 12
Minggu ke-
Adaptasi Periode Pengujian Euthanasi dan
pengambilan sampel organ
Pengamatan:
• Histopatologi hati, ginjal • Lesi Aterosklerosis • SGOT dan SGPT darah
Pengamatan peubah pada
• Berat badan • Konsumsi Ransum • Total Kolestrol • Trigliserida • Kolestrol HDL • Kolestrol LDL
Lintah laut kering
Ekstraksi bertingkat
Pengujian aktivitas antioksidan dan rendemen
Gambar 6 Diagram alir penelitian utama
Pengamatan histopatologi dititikberatkan pada perubahan struktur dinding pembuluh darah yang ditandai dengan adanya endapan sel lemak sampai terbentuknya plak aterosklerosis. Ketebalan dan luas plak/lesi yang terbentuk diamati dan diberikan skor/nilai 3 untuk yang tebal sekali, 2 agak tebal, 1 tipis dan 0 normal. Pemberian diet aterogenik yang berisi kolesterol sebesar 0,2% dari berat ransum total yang dikonsumsi (0,2 g kolesterol/100 g ransum) dimaksudkan supaya kelompok kontrol positif mengalami aterosklerosis yang ditandai oleh tingginya kadar kolesterol total dan LDL serum serta terbentuknya lesi/plak pada aorta kelinci. Penetapan pemberian dosis 0,2% berdasarkan penelitian Azima (2004), pada dosis 0,1% telah mampu meningkatkan kadar kolesterol selama 12 minggu. Adapun masing-masing kelompok kelinci diperlakukan sebagai berikut:
(1) Kontrol negatif hanya diberikan ransum standar Uji in vivo pada kelinci Kontrol negatif = ransum Rb 12
Kontrol positif = ransum Rb 12+kolesterol 0,2%
Obat = Rb 12+kolesterol 0,2%+ simvastatin 0,625 mg/ekor/hari
Discodoris = Rb 12 +kolesterol 0,2%+Discodoris 4%
Periode Pengujian
-2 0 4 8 dan 12 minggu Pengamatan
Berat badan, sisa pakan, profil lipid darah: kolesterol total, trigliserida, HDL, LDL, SGOT dan SGPT
(2) Kontrol positif diberikan ransum standar dan kolesterol 0,2%
(3) Perlakuan obat (Simvastatin) 0,625 mg, ransum standar, kolesterol 0,2% (4) Perlakuan tepung lintah laut 4% , ransum standar, kolesterol 0,2%
Pemberian ransum kelinci sesuai dengan perlakuan selama 12 minggu. Penimbangan sisa pakan dilakukan setiap hari dan berat badan kelinci setiap 7 hari. Pembuatan pakan dilakukan sekali dalam sebulan dan dikeringkan dioven. Teknik pemberian pakan untuk semua kelinci diperlakukan sama yaitu ditimbang 100 gram perekor perhari, kecuali untuk perlakuan lintah laut ditambah 4%. Sisanya setiap hari ditimbang. Sebelum diberikan pakan untuk penambahan kolesterol dan obat diberikan terlebih dahulu dengan cara dicekok menggunakan syringe. Pemberian air minum dilakukan secara ad libitum.
Selama pengujian dilakukan pengamatan terhadap peubah berat badan, konsumsi ransum, total kolesterol, trigliserida, HDL dan LDL pada minggu ke 0, 4, 8, dan 12. Pada minggu ke 12 juga dilihat kadar SGOT dan SGPT.
Pengambilan contoh darah dilakukan setiap 4 minggu. Darah diambil pada pembuluh darah vena telinga kelinci sebanyak 3 ml. Darah didiamkan selama 30 menit pada suhu ruang, kemudian disentrifus untuk memisahkan serumnya pada kecepatan 2.700 rpm selama 10 menit dan profil lipidnya ditentukan.
Profil lipid serum ditentukan dengan metode enzim cholesterol oxsidase-p- aminophenozone (CHOD-PAP) untuk kolesterol total, metode pengendapan untuk HDL dan LDL, dan metode glycerol phosphate oxidase-p-phenozone (GPO-PAP) untuk trigliserida.
SGOT dan SGPT hanya dianalisis pada minggu ke 12 percobaan dengan metode kit AMP Medizintechnik Hamdles GmbH, hal ini dilakukan untuk melihat pengaruh pemberian obat simvastatin dan Discodoris sp terhadap enzim-enzim tersebut dan kerja hati.
Kelainan pada organ hati dihitung dari jumlah sel yang mengalami kerusakan pada 5 lapangan pandang kemudian dipersentasekan (normal, degenerasi hidropis, degenerasi lemak dan sel yang mati). Pembentukan plak pada pembuluh darah jantung diamati ketebalannya dan dibandingkan dengan kontrol negatif. Endapan protein yang terdapat pada glomerulus ginjal dihitung dan diuji secara statistik.