BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.6 Uji kombinasi EEABA-Doxorubicin terhadap MCF-7
Uji kombinasi dilakukan dengan perlakuan kombinasi EEABA-doxorubicin terhadap sel MCF-7. Seri konsentrasiEEABA-EEABA-doxorubicin secara berturut-turut adalah 17; 34; 51; 68 µg/ml (ekstrak dengan 1/8; 1/4; 3/8; 1/2 IC50) dan 25, 50, 100, 200 nM (doxorubicin dengan 1/16; 1/8; 3/8; 1/2 IC50). Kombinasi
doxorubicin dengan ekstrak uji memberikan indeks kombinasi seperti yang tercantum pada Tabel 4.3. Hasil menunjukkan perlakuan kombinasi ekstrak EEABA-doxorubicin memberikan efek sinergis terhadap sel MCF-7.Pada pengamatan morfologi sel MCF-7 dapat diamati morfologi sel yang mati akibat perlakuan tunggal ekstrak dan doxorubicin serta kombinasi keduanya.
Tabel 4.3 Nilai indeks kombinasi (CI) doxorubicin dengan EEABA EEAB A (µg/ml) Doxorubicin (nM) 25 50 100 200 17 0,30* 0.47 1.15 2.16 34 0.39 0.51 0.82 1.36 51 0.50 0.40 0.63 0.89 68 0.51 0.43 0.57 0.79
Ket. * CI Optimal. Indeks Kombinasi perlakuan kombinasi EEABA dengan doxorubicin terhadap sel MCF-7. Dihitung menggunakan persamaan Notarbartolo (sesuai metodologi).
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kombinasi EEABA-doxorubicin mampu memberikan efek sinergis (CI<1) pada sel MCF-7 secara dependent dose
terhadap konsentrasi EEABA. Efek sinergisme yang didapatkan dari hasil uji kombinasi dimungkinkan adanya kemampuan kombinasi tersebut untuk mencegah resistensi obat akibat pompa efflux Pgp yang terjadi pada sel kanker payudara MCF-7.Resistensi sel kanker biasanya dikaitkan dengan tingginya ekspresi Pgp dan kelainan pada EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor).Ekspresi berlebih Pgp diregulasi oleh faktor transkripsi NF-κB. Proses aktivasi NF-κB membutuhkan IKK (Inhibitor κB kinase) untuk memfosoforilasi inhibitor κB (IκB) sehingga NF-κB lepas dan mentraskripsi gen target (Gilmore, 2006).
Aktivasi faktor transkripsi ini secara berlebihan akan memicu ekspresi protein lain seperti Pgp. EGFR telah diketahui dapat mengaktivasi inhibitor kappa
B kinase (IKK) (Sethi,et al., 2007). EGFR dan IKK, keduanya merupakan protein kinase dan termasuk dalam dalam jalur MAP kinase dalam transduksi sinyal yang berpengaruh pada ekspresi Pgp. Pencegahan resistensi obat dapat dilakukan dengan penekanan terhadap aktivasi Pgp dan ekspresinya, sehingga kombinasi antara EEABA dengan doxorubicin mampu bekerja secara efektif pada sel target. Berdasarkan hasil penelitian terdahulu terhadap buah andaliman, ekstrak buah andaliman mampu menghambat TNF (mediator tumor) sehingga menyebabkan TNF menurun sehingga aktivitas NF-kB menurun yang berefek mampu menghambat exspresi Pgp (Yanti, et al., 201; Deng, 2001).
Pada akhirnya, berbagai penelitian termasuk penelitian ini semakin memperkuat dugaan bahwa efek sinergisme EEABAdiperantarai oleh mekanisme penghambatan aktivitas Pgp sehingga agen kemoterapi doxorubicin dapat bekerja lebih efisien pada sel kanker payudara MCF-7 dengan ekspresi berlebih Pgp. Penelusuran mekanisme molekuler secara jelas perlu dilakukan, sehingga didapatkan target spesifik dalam terapi kanker payudara ini.
4.7 Uji Apoptosis
Pengamatan apoptosis dilakukan dengan metode flowcytometry. Metode ini merupakan metode untuk menghitung sel hidup, sel nekrosis dan apoptosis secara cepat. Pada uji ini digunakan suatu protein yaitu Annexin V yang dapat berikatan secara spesifik pada fosfatidilserin yang terdapat pada membran plasma sel selama proses apoptosis. DNA pada sel yang rusak baik nekrosis maupun apoptosis akan diwarnai oleh propidium iodida yang menghasilkan fluoresensi oranye hingga merah. Saat melewati sinar laser, sel akan tereksitasi dan
menghamburkan cahayanya menghasilkan cahaya fluoresensi (Brussaard, et al., 2000; Demo, et al., 1999).
Hasil pengujian apoptosis dengan metode flowcytometri terhadap sel MCF-7 setelah pemberian EEABA pada konsentrasi ½ IC50 yaitu 68 µg/mL, dan ½ IC50doxorubicin yaitu pada konsentrasi200 ppm, Ditampilkan pada Gambar 4.3, 4.4, 4.5, dan 4.6 berikut ini:
Gambar 4.3 Gambaran persentase kondisi sel MCF-7 kontrol
R2 R3
R4 Sample ID: KONTROL MCF
Patient ID: 0516.13 Gated Ev ents: 50000
Quad % Gated % Total UL 5.45 5.45 UR 6.77 6.77 LL 82.86 82.86 LR 4.92 4.92
Gambar 4.4 Gambaran persentase kondisi sel MCF-7 yang diberi Doxorubicin
Gambar 4.5 Gambaran persentase kondisi sel MCF-7 yang diberi EEABA
R2 R3
R4 Sample ID: 5
Patient ID: 0516.13 Gated Ev ents: 50000 Quad % Gated % Total
UL 68.15 68.15 UR 18.66 18.66 LL 7.12 7.12 LR 6.07 6.07
Gambar 4.6 Gambaran persentase kondisi sel MCF-7 yang diberi EEABA-Doxorubicin
Keterangan gambar:
Gambar kiri atas menunjukkan gambaran sel secara keseluruhan.
Gambar kanan atas sama dengan gambar kiri atas hanya diperjelas dengan warna yang masing-masing memiliki makna.
Gambar kiri bawah adalah gambaran sel setelah dikelompokkan dan dipersentase. R1 = sel hidup, R2 = sel yang mengalami apoptosis, R3 = sel yang mengalami nekrosis, R4 = sel yang mengalami nekrosis akhir (late nekrosis).
Pada sel MCF-7 yang diberi EEABA terlihat persentase sel yang mengalami apoptosis (1,05%), sedangkan yang diberi EEABA-doxorubicin terlihat penurunan jumlah sel yang mengalami apoptosis (0,15%),doxorubicin (6,07%), dan dibandingkan kontrol (4,92%).Terlihat doxorubicin lebih banyak meningkatkan jumlah sel yang mengalami apoptosis dibandingkan dengan EEABA maupun kombinasinya dengan doxorubicin. EEABA menunjukkan rendahnya sel yang mengalami apoptosis. Hal ini menunjukkan bahwa
doxorubicin tunggal lebih banyak menyebabkan sel yang mengalami apoptosis dibandingkan dengan EEABA tunggal.
Persentase sel yang mengalami nekrosis pada pemberian EEABA(35,73%), EEABA-doxorubicin (16,75%), doxorubicin (18,66%), sedangkan pada kontrol (sel 6,77%). Sel yang mengalami late necrosis pada pemberian EEABA (61,42%), EEABA-doxorubicin (82,35%), doxorubicin (68,15%) dan kontrol sel (5,45%). Hal ini menunjukkan bahwa mekanisme kematian sel dengan pemberian EEABA terjadi pada fase nekrosis.
Jumlah sel yang hidup pada kontrol (82,86%), pada perlakuan dengan EEABA (1,80%), perlakuan dengan EEABA-doxorubicin (0,75%), sedangkan dengan doxorubicin tunggal (7,12%). Pada perlakuan dengan EEABA, doxorubicin maupun kombinasinya, persentase jumlah sel hidup sangat sedikit. Hal ini mungkin disebabkan paparan terhadap sel terlalu lama (Darzynkiewicz, et al., 1992).
Apoptosis adalah suatu proses time dependent. Menurut penelitian Mooney (2002), sel MCF-7 yang diinduksikan dengan staurosporine, terjadi peningkatan ikatan annexin-V pada sel MCF-7 setelah 4 jam perlakuan dan meningkat seiring dengan peningkatan waktu. Dibandingkan dengan sel T47D yang menujukkan hasil setelah 14 jam. Rendahnya jumlah sel yang hidup dapat disebabkan karena terlalu lamanya paparan yang diberikan. Dimana sel MCF-7 sudah dapat di deteksi pada 4 jam, sehingga dengan paparan yang terlalu lama maka jumlah sel yang mati akan semakin banyak.
EEABA dan kombinasinya tidak menunjukan mekanisme secara apoptosis dengan metode annexin V. Prinsip dari pelabelan annexin V adalah pewarnaan pada phosphatidylserines (PS) yang terdapat pada membran luar sel. Sel apoptosis
awal mengekspresikan PS pada luar membran plasma. PS dapat terwarnai oleh label annexin V. Sel yang mengalami apoptosis akhir dan sel nekrosis akan kehilangan integritas membran selnya dan permeabel terhadap pewarnaan annexin V (Zimmermann, et al., 2011).
Mechanism of action dari EEABA kemungkinan berada pada fase late apoptosis, namun perlu dilakukan pengujian dengan metoda lain seperti metode
time-lapse microscopy, transmission electron microscopy danwestern blot sebab bisa diketahui mekanisme pada tingkat protein dan gen.