METODE PENELITIAN
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.5 Uji Termal dengan TGA
Stabilitas termal dapat diuji dengan Thermogravimetric (TG) dan Differential
Thermogravimetric (DTG). Kurva TG/DTG diperoleh dalam atmosfir nitrogen,
menggunakan TGA (Pyris 1 TGA PERKIN ELMER), dengan laju pemanasan 10oC/menit, dari temperatur kamar sampai 700oC (Fernandes, 2011)
3.4.6 Kultur Sel
Pada studi ini digunakan epidermis dari preputium manusia. Sebelum mulai bekerja dengan sel-sel, dipastikan bahwa sejumlah medium, buffer dan enzim yang dibutuhkan telah dipra-hangat setidaknya sampai suhu kamar. Selalu menggunakan instrumen steril, teknik aseptik, dan bekerja di sebuah aliran laminar untuk mempertahankan sterilitas.
a. Persiapan bahan dan alat.
Larutan:
1. Hank’s Balanced Salt Solution atau larutan sejenis disimpan pada suhu 4oC atau - 20o
2. PBS (1-10x) bebas Ca dan Mg, dapat ditambahkan glukosa 0,01% (v/v). C.
3. Trypan blue, dilarutkan dalam PBS hingga mencapai larutan 0,1% (w/v), dilewatkan pada filter sterilisasi 0,22 µm.
4. EDTA dilarutkan dalam PBS hingga mencapai konsentrasi 0,02% (0,53 mM). 5. Trypsin dilarutkan dalam HBSS atau PBS sampai konsentrasi 0,1% penggunaan
pada suhu 37oC, penyimpanan dalam suhu 4oC semalam lalu aliquot 40 mL dan disimpan pada suhu -20o
6. Trypsin EDTA: campuran antara 0,05% trypsin + 0,53 mM EDTA melalui filter sterilisasi.
C.
7. α MEM disimpan pada suhu 4o
8. FBS aliquot 50 mL dan disimpan pada suhu -20 C.
o
C (Mycoplasma-free % low/negative endotoxin), bila perlu dapat diinaktivasi dengan inkubasi pada 56oC selama 30 menit sambil diaduk lalu harus didinginkan pada 4o
9. Larutan stok 100x penisillin-strptomicin dialiquot 5 mL dan disimpan pada -20 C semalam, baru dialiquot.
o
10.Larutan stok 200 mM pada konsentrasi 0,29 mg/mL L-Glutamin di aliquot dan disimpan pada 20
C.
o
11.Insulin 50 mg/ml dilarutkan dalam 0,05M HCl disimpan dalam 10 mL aliquot C, segera digunakan dalam 1 minggu.
pada 4o
12.EGF 10 µg/ml dilarutkan dalam ddH C.
2
O.
Komposisi Complete medium (CM) 50mL untuk sel fibroblast :
1. 25 mL α Modified Essential Medium (α MEM) 1x dalam ddH2O. 2. 0,5 mL FBS
3. 0,5 mL Amphotericyn
4. 0,5 mL Penicillin Streptomicyn 5. 0,5 mL FGF 10 ug/ml dalam ddH2O 6. + PBS sampai 50 mL
(untuk 50 mL CM = 25 mL α MEM : (20% PSAG+5mL FBS)= 1:1)
Komposisi Complete medium (CM) 50 mL untuk sel keratinosit:
1. 25 mL Epilife 2. 0,5 mL FBS
3. 0,5 mL Amphotericyn
4. 0,5 mL Penicillin Streptomicyn 5. 0,5 mL EGF 10 ug/ml dalam ddH2O 6. + PBS sampai 50 mL
Precoating:
1. 100 µg/mL kolagen tipe IV/100 µg/mL fibronectin dalam PBS sebanyak 3-5 mL pada cawan kultur 100 mm, diinkubasi 1 jam pada 37oC atau inkubasi semalam pada suhu 4o
2. Lalu dicuci 3 kali dengan PBS. Diinkubasi dengan BSA 0,5 mg/mL pada 37 C.
o
3. Lalu dicuci 2 kali dengan PBS dan ditambahkan 2 mL CM dan dihangatkan pada 37
C selama 1 jam.
o
C.
Sterilisasi pra-aktivasi laboratorium:
1. Biological safety cabinet dinyalakan dan dibiarkan selama 15 menit.
2. Semua permukaan tempat kerja di dalam safety cabinet di dekontaminasi dengan ethanol 70%.
3. Semua perlengkapan yang dipakai di dekontaminasi dengan cara yang sama dan diletakkan dekat atau dalam cabinet.
4. Larutan yang perlu dihangatkan menggunakan waterbath sebelum penggunaan. 5. Pekerja laboratorium mengenakan perangkat protektif personal.
6. Sarung tangan untuk bekerja dalam cabinet harus disemprot untuk dekontaminasi. 7. Semua yang akan kontak dengan sel atau reagen yang digunakan dalam kultur atau
pasasi harus steril (autoclave atau filter sterilized).
b. Isolasi keratinosit/fibroblast dari jaringan kulit.
1. Sampel yang digunakan adalah preputium manusia yang diambil dari rumah sunatan. 2. Potongan sampel kulit direndam dalam medium transport (α MEM+ antibiotik +
gentamicyn), disimpan semalam pada 4o
3. Sampel kulit dimasukkan ke ruang steril, dibersihkan terlebih dahulu dengan betadine 2 x 2 menit dan alkohol 2 x 2 menit.
C sebelum dipergunakan, tidak lebih dari 24 jam.
4. Sampel kulit kemudian dibersihkan lagi pada laminar flow dengan HBSS 2x pencucian.
5. Disiapkan peralatan: 2 pinset (salah satu ujungnya bergigi), gunting, scapel (pisau bedah), cawan petri, dan petridish 35 mm.
6. Dipipet HBSS sebanyak 2 mL ke dalam cawan, sampel kulit diletakkan dengan posisi epidermis di atas dan dermis di bawah.
7. Dipisahkan kulit dari lemak-lemak dan pembuluh darah yang menempel perlahan- lahan dengan pinset yang ada giginya diujung dan penjepit, hingga tinggal lapisan dermis yang agak kebiru-biruan, (diusahakan tidak sampai sobek).
8. Sampel kulit dibalik, lapisan epidermis di atas, dipotong-potong memanjang, dengan ukuran 0,5 x 2 cm.
9. Potongan kulit dimasukkan ke dalam dish 35 mm, tiap cawan berisi 4-5 potong, dituang larutan dispase I (enzim untuk melepaskan bagian dermis dari epidermis) 2 mL, yang telah diencerkan denagan PBS 2 mL, dibiarkan mengambang, bagian epidermis jangan terendam. Disimpan dalam freezer semalaman 4o
10. Disimpan di dalam inkubator 37
C, 18-20 jam.
o
11. Disiapkan alat dan bahan seperti conical tube 15 mL, HBSS, trypsin 0,25%, cawan petri, dan pipet tips 1000 µL.
12. Dipipet 3 mL HBSS, dituang ke dalam tube 15 mL + 2 mL trypsin.
13. Dipisahkan kulit dari lapisan dermis dan epidermis, dimasukkan ke dalam tube 15 mL dan dimasukkan ke dalam inkubator selama 30 menit.
14. Setiap 5 menit dikocok-kocok sel sebanyak 10x hingga merata.
15. Larutan dalam inkubator tadi diinaktivasi dengan medium (α MEM, PSAG 20%, FBS sebanyak 5 mL), 1:1, dimasukkan ke dalam tube 50 mL.
16. Kemudian larutan ditriturasi (homogenkan/dipipet naik turun) dan saring dengan filter 70 µm pada tube 50 mL, lalu dibilas dengan HBSS sebanyak 5 mL.
17. Larutan dipipet dan dipindahkan ke tube 15 mL, disentrifuse 1500 rpm selama 20 menit.
18. Setelah itu larutan supernatan dibuang, endapan difliking (dijentik-jentik), ditambahkan HBSS sebanyak 6 mL.
19. Larutan disentrifuse kembali dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit,
20. Suspensi sel ditriturasi (dicampur) dengan pipet 10 mL, dan sel siap dihitung dengan hemocytometer.
21. Cara perhitungan sel:
80 μLPBS + 10 μL trypan blue + 10 μL sel
……….. (3.1)
22. Sebelum sel dimasukkan ke dalam dish, terlebih dahulu dish dilapisi dengan kolagen, dengan cara kolagen dimasukkan ke dalam dish, didiamkan selama 1 jam dalam inkubator.
23. Setelah itu, sel yang telah ditambahkan epilife dimasukkan ke dalam dish. 24. Kemudian dimasukkan ke dalam inkubator pada suhu 37oC, 5% CO2.
c. Pergantian medium
1. Medium sel diperiksa di bawah mikroskop, dilihat terdapat perubahan atau tidak. 2. Sel yang melekat di dasar dish kultur adalah sel yang hidup, sel yang berbentuk
bulat-bulat, terang dan melayang adalah sel yang mati. 3. Disiapkan larutan PBS dan epilife (atau α MEM).
4. Diambil cairan yang ada pada omnitray menggunakan pipet lalu dibuang.
nya.
6. Untuk sel keratinosit, digunakan medium epilife sebanyak 5 mL.
7. Digoyangkan perlahan-lahan, disimpan lagi ke dalam inkubator 37oC, 5% CO2
8. Medium diganti setiap 2-3 hari sekali.
.
d. Pasasi sel (panen sel)
1. Panen sel baru bisa dilakukan bila sel yang attach (melekat) di dasar dish sudah mencapai konfluen 70-80%.
2. Hasil inkubasi dikeluarkan dari inkubator, medium dibuang, sel dicuci dengan larutan PBS/HBSS 500 µL/1 mL.
3. Larutan trypsin EDTA 0,1% ditambahkan 500 µL/1mL, diikubasi selama 10-15 menit.
4. Diamati pelepasan sel dari permukaan dish di bawah mikroskop.
5. Inaktivasi kerja enzyme dengan medium (α MEM+20% FBS) 500µL/1 mL. Diamati pelepasan sel, jika masih ada yang menempel atau melekat ditriturasi lagi.
6. Medium sel dipindahkan ke dalam tube 15 mL, disentrifuse dengan kecepatan 1500 rpm selama 7 menit.
7. Setelah itu supernatan dibuang, dilakukan fliking dengan jari pada bagian bawah tube.
8. Ditambahkan medium epilife 500 µL.
9. Sel dihitung dengan sel counter.
10.Sel siap untuk ditransportasi atau ditransplantasi.
e. Perhitungan sel dengan alat hemacytometer
1. Suspensi sel digoyangkan perlahan agar merata, masukkan 200 μL suspensi sel dalam tube berisi 600 µL PBS lalu ditambahkan 200µL 0,1% trypan blue dan dikocok dengan membalikkan tube 3-5 kali.
2. Dibersihkan hemocytometer dan coverslip dengan tissue abrasive. 3. Disisipkan cover slip.
4. Dengan coverslip terpasang ditambahkan sejumlah kecil suspensi sel pada setiap ruangan dengan pipet pasteur, menggunakan daya kapilaritas, diusahakan tidak berlebihan di bawah mikroskop cahaya.
5. Digunakan mikroskop dengan perbesaran 10x-40x
6. Sel dihitung yang bright clear (viable) dan kebiruan (non viable) pada seluruh ruangan (1mm2
7. Dihitung jumlah sel viable dan non viable dengan rumus berikut:
) minimal, selesai dalam 5 menit setelah pencampuran trypan blue.
80 μLPBS + 10 μL trypan blue + 10 μL sel
……… (3.2)
A = rerata jumlah sel viable B = rerata jumlah sel non-viable C = 5, faktor dilusi
104
AxCxD = Konsentrasi sel viable (per mL) = faktor koreksi.
BxCxD = Konsentrasi sel non viable
Total jumlah sel viable = (sel viable) x vol
Total jumlah sel = jumlah sel viable + jumlah sel non viable Persentase viabilitas = (jumlah sel viable x 100)/total jumlah sel.
Isolasi keratinosit menghasilkan jumlah sel berkisar 106, kepadatan sel yang ditanam biasanya 20.000 sel/cm2.
f. Kultur sel fibroblast manusia pada scaffold kitosan/kolagen
1. Disiapkan dish 35mm, gunting, pinset, alkohol 70%, dan larutan PBS. 2. Scaffold dipotong dengan ukuran 2cmx2cm dengan gunting steril.
3. Dilakukan sterilisasi scaffold kitosan/kolagen dengan mencuci dalam alkohol 70%, diikuti dengan membilas dengan larutan PBS, diamkan hingga scaffold
terendam ke dasar dish. Larutan PBS dibuang, dan diratakan permukaan scaffold
di atas dish, diinkubasi semalaman.
4. Dipipet suspensi sel (50.000-10.000 sel diatas scaffold, 2 tetes), usahakan suspensi sel tidak turun dari permukaan scaffold, amati di bawah mikroskop dan foto. 5. Ditambahkan medium kultur 2 ml hingga scaffold terendam seluruhnya, inkubasi
dilanjutkan hingga hari ke-7.
perubahan bentuk sel difoto dan dicatat.