T1 = Bibit manggis umur 3 minggu T2 = Bibit manggis umur 6 minggu T3 = Bibit manggis umur 9 minggu
Kombinasi perlakuan 11 x 3 = 33 dengan 8 ulangan sehingga terdapat 264 satuan percobaan. Data hasil pengamatan dianalisis dengan menggunakan sidik ragam (uji F). Apabila dalam sidik ragam tersebut terdapat pengaruh perlakuan, analisis dilanjutkan dengan uji Duncan’s Multiple Range Test
(α=0.05).
d). Inokulasi A. rhizogenes pada Bibit Manggis
Bibit manggis umur 9, 6, dan 3 minggu telah disiapkan sebelumnya, dipilih yang seragam dan sehat. Ujung akar dipotong sepanjang 1 cm dengan pisau steril, lalu direndam dalam berbagai suspensi A. rhizogenes sesuai perlakuan konsentrasi A. rhizogenes dan di vakum selama 30 menit. Bibit dipindahkan ke kertas merang steril yang telah dibasahi dengan larutan hogland steril dan disimpan selama 2 hari pada suhu 28oC, dalam kondisi gelap kemudian dipindahkan ke kotak pembibitan (Gambar 7), pemeliharaan bibit dilakukan seperti percobaan B.
g). Pengamatan
Peubah-peubah yang diamati pada percobaan ini adalah ;
(1). Pertambahan tinggi tanaman, diukur mulai dari permukaan tanah sampai titik tumbuh.
(2). Jumlah daun, dihitung daun yang telah membuka sempurna, berwarna hijau atau masih merah.
(3). Diameter batang, diukur pada ketinggian 1 cm di atas permukaan tanah. Peubah 1, 2, dan 3 diamati 1 bulan sekali dimulai sejak bibit berumur 1 bulan setelah inokulasi sampai umur 15 bulan.
(4). Pengamatan perakaran dilakukan pengukuran panjang akar tampak yang dilakukan 1 bulan sekali dimulai sejak akar telah tampak pada bagian depan dan belakang wadah pembibitan sampai umur 15 bulan. Pada akhir penelitian, yaitu 15 Bulan Setelah Inokulasi (BSI) dilakukan pengamatan terhadap;
(5). Bobot kering tajuk,
(6). Panjang akar primer, jumlah akar sekunder, dan jumlah akar tersier, (7). Anatomi akar bibit manggis
Anatomi akar bibit manggis hasil inokulasi beberapa strain A. rhizogenes dilakukan dengan menggunakan metode Nakamura (1995). Tahap 1 dilakukan dengan pengambilan akar tanaman manggis dan dipotong sepanjang 5 mm. Tahap 2, akar difiksasi selama 24 jam dalam larutan FAA (5 ml formaldehid, 5 ml asam asetat glasial dan 90 ml ethanol 70%), kemudian dilanjutkan perlakuan Tahap 3–7, yaitu perlakuan dehidrasi dengan waktu perendaman untuk masing-masing tahap selama 1 jam. Potongan akar manggis direndam dalam larutan Tahap 3 ( 40 ml Butanol, 30 ml etanol pekat dan 30 ml akuades); Tahap 4 (55 ml Butanol, 25 ml etanol pekat dan 20 ml akuades); Tahap 5 (70 ml Butanol, 20 ml etanol pekat dan 10 ml akuades); Tahap 6 (85 ml n-Butanol dan 15 ml etanol pekat) dan ; Tahap 7 (100 ml n-n-Butanol). Tahap 7 diulang 2 kali setelah itu ditambahkan parafin cair ke dalam botol yang kemudian botol ditutup dan disimpan dalam suhu ruang selama 12 jam.
Setelah perlakuan dehidrasi selesai dilanjutkan dengan perlakuan infiltrasi, yaitu dengan membuka tutup botol yang berisi spesimen akar manggis dan botol dimasukkan dalam oven parafin suhu 58oC selama 1 hari. Kemudian parafin cair yang terdapat dalam botol dituang dan diganti dengan parafin cair baru. Botol selanjutnya dimasukkan ke dalam oven parafin suhu 56 oC selama 3 hari.
Perlakuan Embedding. Tempat blok dioleskan dengan gliserin pekat secara merata, kemudian parafin cair dituangkan ke dalam tempat blok dan spesimen berupa akar manggis diatur posisinya dimana posisi spesimen tidak sampai tenggelam harus berada di tengah parafin). Setelah diatur posisinya, permukaan spesimen ditiup agar sedikit mengeras. Tempat blok berisi parafin dan spesimen akar manggis diletakkan di telapak tangan dan dicelup ke dalam air, dibiarkan selama 3 menit, setelah itu permukaan disiram perlahan dengan air dan biarkan tenggelam dalam wadah berisi air. Parafin dan spesimen akar manggis dengan sendirinya akan lepas dari tempat blok kemudian diambil dan dikeringkan dengan tisu diberi label dan selanjutnya direndam selama 1
bulan dalam larutan Gifford (20 ml asam asetat glasial, 80 ml etanol 60% dan 5 ml gliserin).
Membuat Sayatan. Sebelum disayat spesimen akar manggis terlebih dahulu ditempelkan pada holder, dengan cara ; holder bagian atasnya dilapisi dengan paraplast menggunakan spatula yang dipanaskan, kemudian spesimen akar manggis dengan cepat dilekatkan pada holder. Setelah itu spesimen dibentuk prisma dengan cara memanaskan spatula. Spesimen didiamkan selama 24 jam.
Spesimen yang telah dilekatkan pada holder disayat dengan mikrotom putar setebal 10 µm. Sayatan direkatkan pada gelas obyek yang telah diolesi dengan albumin-gliserin (1 : 1) dan ditetesi air. Gelas obyek berisi pita parafin dipanaskan pada hot plate dengan suhu 45oC selama 3-5 jam.
Perlakuan Pewarnaan. Dilakukan pewarnaan ganda safranin 2% dalam air dan fastgreen 0.5% dalam etanol 95%. Berturut turut gelas obyek direndam ke dalam larutan berikut : Xilol I (5 menit), xilol II (5 menit), etanol absolut (3 menit), etanol 95% (3 menit), etanol 70% (3 menit), etanol 50% (3 menit), etanol 30% (3 menit), akuades (3 menit), safranin 2% (3 hari), akuades (3 menit), etanol 30% (5 menit), etanol 50% (5 menit), etanol 70% (5 menit), etanol 95% (5 menit), fast green 0.5% (2 menit), Etanol I (5 menit) Etanol II (5 menit), xilol I (5 menit) dan xilol II (5 menit). Selanjutnya dilakukan penutupan, dimana bahan diberi media
canada balsam dan ditutup dengan gelas penutup. Kemudian pada sisi kiri gelas obyek diberi label.
Pengamatan dilakukan terhadap : rata-rata diameter pembuluh xilem (µm), jumlah total pembuluh xilem pada sayatan melintang, luas serapan permukaan sayatan melintang ([rata-rata diameter xilem / 2]2 x
π
x jumlah total pembuluh xilem pada sayatan melintang), total luasan sayatan melintang (
π r
2),
dan rasio (luas serapan permukaan sayatan melintang / total luasan sayatan melintang) (Leuschner & Hertel 2003) (Lampiran 1).(8). Pengamatan rambut akar bibit manggis
Pengamatan rambut akar dari akar sekunder bibit manggis
dilakukan berdasarkan pengamatan mikroskopik menggunakan
mikroskop inverted dan Scanning Electron Microscop (SEM).
Pengamatan rambut akar secara mikroskopik, dilakukan dengan pengamatan langsung sampel akar dibawah mikroskop inverted.
Pengamatan rambut akar dengan Scanning Electron Microscop
(SEM) dilakukan dengan cara : sampel berupa akar sekunder yang berukuran 0.5 cm dicuci di dalam larutan bufer sodium cacodilat selama 2 jam pada suhu 4oC, kemudian akar dicuci ulang dengan larutan bufer sodium cacodilat pada alat getar ultrasonic sonycation selama 5 menit pada suhu kamar. Selanjutnya sampel difiksasi dengan glutaral dehid
2.5% selama 2 jam pada suhu 4oC. Kemudian direndam dalam 2% tannic
acid pada suhu 4oC selama 2 hari. Selanjutnya cuci dengan larutan bufer sodium cacodilat sebanyak 4 kali masing-masing tahap berlansung 15 menit suhu 4oC. Kemudian cuci dengan akuades pada suhu 4oC sebanyak 2 kali. Proses dehidrasi dilakukan dengan seri etanol, yaitu pertama-tama sampel direndam dalam alkohol 50 % selama 5 menit suhu 4oC sebanyak 4 kali, alkohol 75% selama 20 menit suhu 4oC, alkohol 80% selama 20 menit suhu 4oC, alkohol 94% selama 20 menit suhu ruang dan dalam etanol absolut 10 menit suhu ruang sebanyak 2 kali. Selanjutnya rendam sampel dalam t-Butanol selama 10 menit pada suhu ruang, freezer drying (-20oC) sampai t-Butanol hilang. Kemudian sampel akar diletakkan pada speciment holder untuk dilapisi dengan logam emas dan siap untuk diamati dengan SEM (Lampiran 2).
(9). Uji konfirmasi T-DNA melalui teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) Konfirmasi adanya integrasi T-DNA, yaitu daerah TL dan TR-DNA dari A. rhizogenes terhadap sel tanaman manggis dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Sebagai kontrol positif digunakan DNA plasmid A. rhizogenes dan sebagai kontrol negatif digunakan DNA akar bibit manggis yang tidak diinokulasi, sedangkan DNA uji adalah DNA dari akar bibit manggis yang diinokulasikan dengan A. rhizogenes.
Isolasi DNA Plasmid A. rhizogenes. Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan menggunakan modifikasi metode Sambrook et al. (1989) yang dimodifikasi. Strain A. rhizogenes dikulturkan pada media YMB dan LB cair, diletakkan pada mesin pengocok dengan kecepatan 100 rpm selama 24 jam. Kultur dituang ke dalam tabung Eppendorf 1,5 ml dan disentrifuse dengan kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit sehingga membentuk pelet. Pelet yang terbentuk dilarutkan dengan bufer TELT (50 mM Tris-Cl pH 7.5, 82 mM EDTA, 2.5 M LiCl, 0.4% Triton X-100), kemudian ditambah 50 µl lisozim 10 mg/ml lalu dihomogenkan dan diinkubasi pada 37oC selama 1 jam. Setelah itu ditempatkan pada air mendidih selama 1-2 menit dan dimasukkan ke dalam air es beberapa saat. Selanjutnya ditambahkan 50 µl SDS 10% dan dibolak-balik sampai terjadi lisis dan terlihat berlendir. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit pada suhu ruang. Supernatan yang terbentuk dipindahkan pada tabung baru dan ditambahkan 2-3 volume etanol absolut dingin. Untuk memurnikan DNA ditambahkan 0.1 volume Na asetat 3 M dan disimpan pada suhu -20 oC selama 30 menit. Selanjutnya campuran disentrifus kembali dengan kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit sehingga membentuk pelet DNA. Pelet DNA dicuci dengan alkohol 70% lalu dikeringkan dengan vakum dan dilarutkan dengan akuabides steril, dan selanjutnya dapat digunakan untuk uji PCR.
Isolasi DNA Akar Bibit Manggis. Isolasi dilakukan dengan menggunakan metode CTAB yang dimodifikasi (Castillo et al. 1994). Akar manggis sebanyak 0.5 g dimasukkan ke dalam mortar, lalu ditambahkan nitrogen cair dan PVPP, kemudian digerus sampai halus. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf yang telah berisi 1 ml bufer CTAB 2% dan 5 µl merkaptoetanol. Campuran diinkubasikan pada suhu 60oC selama 30 menit dan dibiarkan mencapai suhu ruang. Selanjutnya untuk memurnikan DNA ditambahkan 700 µl kloroform : isoamilalkohol (24:1) dan dikocok, disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung baru dan diekstraksi kembali dengan penambahan 1 ml kloroform : isoamilalkohol (24 :1) dan dikocok, selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindah ke tabung baru dan ditambahkan 1 ml
isopropanol dingin lalu dibolak-balik perlahan sampai homogen dan disimpan pada suhu 4oC selama 30 menit, selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Cairan dibuang dan endapan dilarutkan dengan menambahkan 250 µl bufer TE lalu dihomogenkan, dan untuk menghilangkan RNA, ditambahkan 25 µl RNAse kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 2 jam. Selanjutnya ditambahkan 25 µl natrium asetat 3 M pH 5,2 dan 500 µl etanol absolut dingin, dikocok hingga homogen. Selanjutnya disimpan dalam freezer selama 30 menit, kemudian disentrifus kembali dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Endapan dicuci dengan etanol 70%, keringkan dan dilarutkan dengan bufer TE pH 8. DNA siap digunakan untuk uji PCR.
Analisis DNA dengan PCR. Hasil isolasi DNA plasmid A. rhizogenes dan DNA akar bibit manggis dianalisis dengan PCR menggunakan metode Aoki et al. (1997) yang dimodifikasi. Pereaksi PCR berupa bufer TrisHCl 1 mM + dNTP 0.2 mM mix yang telah berisi MgCl2
200 µM + primer TL 10 pmol + enzim Taq DNA Polymerase 1 unit. Volume reaksi untuk PCR adalah 25 µl dengan penambahan 50 ng DNA
dan H2O. Reaksi PCR dilakukan dengan menggunakan Thermolyne
Amplitron I dengan kondisi denaturasi 94oC selama 1 menit, annealing
55oC selama 1 menit dan polimerasi 72oC selama 2 menit sampai 35 siklus reaksi. Hasil PCR difraksinasi melalui gel elektroforesis dengan
konsentrasi 0.8% agaros dengan penambahan loading dye
bromphenolblue sebagai pemberat. Elektroforesis dilakukan dengan arus 36 mA, 100 volt selama 60 menit. Sebagai marker digunakan DNA 1 kb lader. Hasil elektroforesis dilihat dengan menggunakan UV laminar dan didokumentasi dengan menggunakan kamera (Lampiran 3).
Primer TL berupa rol B1 sekuen ( 5’ ATGGATCCCAAATTG
CTATTCCCCCACG 3’) dan rol B2 sekuen ( 5’ TTAGGCTTCTTTCATTCG
GGTTTACTGCAGC 3’ )
(
Hamill et al. 1991).
(10). Serapan hara N, P, dan K daun bibit manggis
Penetapan kandungan nitrogen dengan metode Semi-mikro Kjeldahl dan penetapan kandungan P dan K daun dengan metode pengabuan kering (Lampiran 4).
(11). Kandungan hormon IAA akar bibit manggis
Pengukuran kandungan hormon akar bibit manggis dilakukan dengan metode (Ergűn et al. 2002), sebanyak 1 g akar segar bibit manggis yang telah dihaluskan, dimasukkan dalam 60 ml larutan ekstrak (MeOH: CHCl3: 2N NH4OH, 12:5:3 v/v/v). Larutan ekstrak tersebut dibuat satu hari sebelum dipergunakan dan disimpan pada -20oC. Campuran akar dan larutan ekstrak tersebut diaduk selama 1 jam kemudian disaring dengan kertas saring sampai didapatkan cairan yang bersih. Cairan tersebut ditambahkan 25 ml akuades diaduk dan biarkan sampai terbentuk dua fase, fase kloroform dibuang sedangkan fase air di atur pH-nya menjadi 2.5 kemudian diekstrak 3 kali dengan 15 ml etil asetat. Fase air dan etil asetat dipisahkan.
Fase etil asetat selanjutnya dipergunakan untuk pengukuran IAA bebas sedangkan fase air di pH kembali sampai menjadi pH 11 yang selanjutnya diinkubasikan pada suhu 70oC selama 1 jam dan dibiarkan mencapai suhu ruang.. Prosedur yang sama dilakukan untuk mengisolasi IAA dalam bentuk terikat. Etil asetat dievaporasi menggunakan alat rote-evaporator system (Büchi Instruments).
Thin-layer chromatography (TLC) dikerjakan menggunakan silika gel GF254 (Merck) sebanyak 30 g dilarutkan dalam 75 ml akuades kemudian dituangkan di atas glass plaque dan disimpan dalam inkubator selama 2.5 jam, kemudian 10 µl IAA bebas, terikat dan standar ditetes di atas glass plaque tersebut selanjutnya diletakkan dalam tabung kaca yang telah berisi larutan eluen TLC (i-PrOH:NH4OH:H2O 10:1:1 v/v/v) selama 3 jam setelah itu dilarutkan dengan 2 ml metanol kemudian disaring dan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 222 nm (Lampiran 5).