VARIABEL DAN DEFINISI OPERASIONAL

Definisi : Adalah suatu indeks atau perbandingan antara ukuran tumor dengan ukuran edema peritumoral.

Cara Ukur : Dari hasil pemeriksaan radiologis, volume dari tumor dan edema dapat diukur dan indeks edema dapat dihitung. Volume dapat dihitung dengan formula hitung volume bola :

Hubungan antara edema peritumoral dengan volume tumor dihitung dengan PTEI :

Alat Ukur : Volume tumor dan edema diukur melalui pemeriksaan MRI secara terkomputerisasi. Untuk data-data yang tidak diukur dengan komputer, diukur secara manual dengan skala dan mistar.

abc

v

=

π

×

3

4

Tumor Edema

v

v

v

OeI

=

+

Tumor Meningioma Intrakranial PTEI VEGF

Hasil Ukur : Hasil penghitungan akan didapat dalam satuan milimeter

kubik (mm3

Coating antibody anti-VEGF-A manusia ditempelkan pada sumur- sumur mikro.

), dan hasil penghitungan indeks akan mendapat satuan angka indeks.

VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)

Definisi : VEGF adalah suatu faktor pertumbuhan dengan aktivitas

mitogenik spesifik terhadap endotel, berbentuk protein terglikosilasi berbentuk dimer dengan ikatan disulfida, berukuran 34 – 46 kD.

Cara Ukur : Kadar VEGF akan diukur dengan cara Sandwich ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) dengan perangkat pemeriksaan (VEGFA (Human) ELISA kit, Abnova, Taiwan). Pemeriksaan dilakukan dengan menggunakan ELISA analyser Chemwell 2910 (Awareness Technology, Inc.).

Prinsip Pengujian :

Keberadaan VEGF-A manusia pada sampel atau standar akan berikatan dengan antibody yang telah ditempelkan pada sumur- sumur mikro.

Setelah dilakukan inkubasi, komponen-komponen biologis dibuang dengan melakukan tahap pencucian. Antibodi terhadap VEGF-A manusia yang telah dikonjugasikan dengan biotin ditambahkan dan akan berikatan dengan VEGF-A yang telah ditangkap oleh antibody yang telah ditambahkan pertama kali. Setelah dilakukan inkubasi, antibody anti-VEGF-A manusia yang terkonjugasi dengan biotin yang tidak berikatan akan dibuang dengan tahap pencucian. Streptavidin-HRP ditambahkan dan berikatan pada antibody anti- VEGF-A manusia yang terkonjugasi dengan biotin.

Setelah dilakukan inkubasi, Streptavidin-HRP yang tidak berikatan dibuang dengan tahap pencucian, kemudian larutan substrat reaktif terhadap HRP ditambahkan pada sumur-sumur pemeriksaan.

Reaksi antara substrat reaktif yang berikatan dengan HRP akan menghasilkan produk berwarna berhubungan dengan proporsinya terhadap keberadaan VEGF-A manusia yang terkandung dalam sampel atau standar. Reaksi ini dihentikan dengan menambahkan larutan bersifat asam. Kandungan VEGF-A didapat dengan mengukur absorbansi pada 450 nm. Kurva standar dibuat dari 7 standar VEGF-A dengan beberapa pengenceran, sehingga kadar VEGF-A sampel dapat ditentukan.

Protokol Penelitian : Protokol Pengujian

Konsentrat buffer sebaiknya berada dalam temperature ruangan dan sebaiknya dilarutkan sebelum melakukan prosedur pemeriksaan. Jika terbentuk kristal di dalam konsentrat buffer, dapat dihangatkan sedikit hingga terlarut secara menyeluruh.

Buffer pencuci

Tuangkan 50 ml konsentrat buffer pencuci (20x) ke dalam tabung 1000ml. Larutkan hingga mencapai volume 1000ml dengan air de-ionisasi atau akuadest. Campurkan perlahan untuk menghindari pembentukan busa.Pindahkan ke dalam

botol pencuci dan simpan pada temperatur 2o hingga

25oC.Larutan buffer pencuci ini (1x) stabil selama 30 hari.

Buffer penguji

Tuangkan semua isi (5ml) kosentrat buffer penguji (20x) ke dalam tabung 100ml. Larutkan hingga mencapai volume 100ml dengan akuadest. Campurkan perlahan untuk

menghindari pembentukan busa. Simpan pada temperatur 2o

hingga 8oC. Larutan buffer pencuci ini (1x) stabil selama 30 hari

Konjugat Biotin

Larutan konjugat Biotin harus digunakan dalam waktu 30 menit setelah dilakukan pengenceran.Buatlah larutan 1:100 dari konsentrat konjugat Biotin dengan Buffer penguji (1x) dalam tabung plastik bersih. (0,06ml konsentrat ditambahkan 5,94ml buffer penguji atau 0,12 ml konsentrat ditambahkan 11,88ml buffer penguji).

Streptavidin-HRP

Larutan Streptavidin HRP harus digunakan dalam waktu 30 menit setelah dilakukan pengenceran.Buatlah larutan 1:100 dari konsentrat Streptavidin-HRP dengan Buffer penguji (1x) dalam tabung plastik bersih. (0,06ml konsentrat ditambahkan 5,94ml buffer penguji atau 0,12 ml konsentrat ditambahkan 11,88ml buffer penguji).

Standar VEGF-A manusia

Rekonstitusi VEGF-A manusia standar dengan menambahkan akuadest.Volume rekonstitusi ditentukan dari label tabung standar. Goyangkan atau campurkan perlahan untuk memastikan proses pelarutan yang homogen (konsentrasi standar rekonstitusi = 2 ng/ml).Rekonstitusikan standar selama 10-30 menit. Campurkan dengan baik sebelum melakukan pelarutan berikutnya.Setelah digunakan, larutan standar yang tersisa tidak dapat disimpan dan harus dibuang.Pelarutan standar dapat dilakukan secara langsung pada plat sumur mikro atau secara alternatif pada tabung lain.Pipetkan 225µl pengencer sampel pada setiap tabung. Pipetkan 225µl standar ter-rekonstitusi (2ng/ml) ke dalam tabung pertama, berikan tanda S1 dan kemudian campurkan (konsentrasi 1ng/ml), pipetkan 225µl larutan S1 ke dalam tabung kedua, berikan label S2 dan kemudian campurkan. Lakukan dilusi serial 5 kali lagi sehingga dapat membentuk kurva standar.Pengencer standar digunakan sebagai blanko.

Prosedur penelitian:

1. Tentukan jumlah sumur yang akan dibutuhkan untuk

melakukan pengujian (Jumlah sampel ditambahkan dengan blanko dan standar. Setiap sampel, standar, blanko dan sampel control sebaiknya diuji sebagai duplo. Lepaskan sumur-sumur yang tidak dipakai dari pemegang dan simpan dalam kantung aluminium dengan pengering yang telah disediakan pada temperatur 2o-8o

2. Cucilah sumur mikro dua kali dengan sekitar 400µl,

Buffer pencuci pada setiap sumur dengan aspirasi berulang diantara pencucian. Diamkan buffer pencuci selama sekitar 10-15 detik sebelum aspirasi. Perhatikan untuk tidak menggores permukaan sumur mikro. Kosongkan sumur dan ketukkan perlahan sumur mikro pada handuk kertas / tissue / atau sponge penghisap untuk menghilangkan buffer pencuci yang berlebihan. Gunakan sumur mikro segera setelah pencucian. Cara lain: sumur mikro dapat diletakkan terbalik pada handuk kertas / tissue / atau sponge penghisap tidak lebih dari 15 menit. Sumur mikro tidak boleh mengalami pengeringan.

dengan pengemasan ketat.

3. Pengenceran standar:

Tambahkan 100µl pengencer sampel duplo terhadap

semua sumur standar. Pipetkan 100µl larutan standar

(2000pg/ml) duplo pada sumur A1 dan A2. Campurkan kandungan sumur A1 dan A2 dengan aspirasi dan ejeksi berulang (konsentrasi standar 1, S1 = 1000pg/ml), dan

pindahkan 100µl ke dalam tabung B1 dan B2. Lakukan

proses pengenceran serial sebanyak 5 kali, membentuk dua baris standar VEGF-A standar dengan konsentrasi 1000 hingga 15,6 pg/ml.

4. Tambahkan 100µl pengencer sampel duplo pada sumur

kosong (blanko).

5. Tambahkan 50µl pengencer sampel pada sumur sampel. 6. Tambahkan 50µl sampel-sampel secara duplo pada sumur

sampel.

7. Tutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada

temperatur ruangan 18-25o

8. Persiapkan konjugat biotin.

C selama 2 jam pada pengaduk plat mikro dengan 100rpm.

9. Lepaskan lapisan penutup. Cucilah sumur mikro

sebanyak 6 kali seperti pada tahap 2 dari protokol pengujian.

10.Tambahkan 100µl konjugat biotin.

11.Tutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada

temperatur ruangan 18-25o

12.Persiapkan Streptavidin-HRP.

C selama 1 jam pada pengaduk plat mikro dengan 100rpm.

13.Lepaskan lapisan penutup. Cucilah sumur mikro

sebanyak 6 kali seperti pada tahap 2 dari protokol pengujian.

14.Tambahkan 100 µl Streptavidin-HRP yang telah diencerkan pada semua sumur, termasuk sumur blanko.

15.Tutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada

temperatur ruangan 18-25o

16.Lepaskan lapisan penutup. Cucilah sumur mikro

sebanyak 6 kali seperti pada tahap 2 dari protokol pengujian.

C selama 1 jam pada pengaduk plat mikro dengan 100rpm.

17.Pipetkan 100µl larutan substrat TMB pada semua sumur.

18.Tutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada

temperatur ruangan 18-25o

19.Pengembangan warna pada plat sebaiknya terus

diperhatikan dan reaksi substrat di-stop sebelum tidak dapat diukur lagi. Penentuan waktu yang ideal untuk setiap pengembangan warna harus dilakukan secara individual terhadap setiap pengujian.

C selama 30 menit. Hindari paparan terhadap cahaya.

20.Direkomendasikan untuk menambahkan larutan stop

ketika standar tertinggi telah berwarna biru gelap. Cara lain, dapat dengan menggunakan reader ELISA pada 620 nm. Reaksi substrat sebaiknya distop ketika standar 1 mencapai OD 0,9 – 0,95.

21.Stop reaksi enzimatik dengan memberikan 100µl larutan stop secara cepat pada setiap sumur. Hasil harus dibaca segera setelah larutan stop diberikan atau dalam 1 jam jika disimpan pada suhu 2-8o

22.Baca absorbansi setiap sumur mikro pada

spektrofotometer menggunakan 450 nm sebagai gelombang cahaya primer (dapat juga menggunakan 610 - 650nm).

Alat Ukur : Pengukuran dilakukan dengan menggunakan ELISA analyser Chemwell 2910 (Awareness Technology, Inc.)

Hasil Ukur : Hasil ukur akan didapat dalam satuan pg/ml.