V HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1.2 Viabilitas Sel Limfoid Udang Vaname
Viabilitas sel limfoid udang vaname dihitung pada hari terakhir pemeliharaan sel yakni pada hari ke-18. Viabilitas menggambarkan kemampuan daya hidup dari sel yang dikultur. Penentuan viabilitas sel menggunakan pewarnaan dengan trypan blue dan penghitungannya dilakukan dengan bantuan handlycounter. Semua sel yang terlihat dalam satu lapang pandang dihitung baik sel yang berwarna bening maupun sel yang berwarna biru. Sel yang bening menunjukkan bahwa sel masih bertahan hidup sedangkan sel yang berwarna biru menunjukkan bahwa sel tersebut telah mati. Hasil penghitungan sel yang hidup dan mati kemudian dimasukkan dalam rumus viabilitas. Hasil prosentase viabilitas sel pada ketiga media disajikan dalam Tabel. 5.2.
Tabel. 5.2 Viabilitas Sel Limfoid pada Media Berbeda
Ulangan MEM (%) Perlakuan L-15 (%) TCM (%)
1 98 97 97
2 97 98 98
3 98 99 97
Rata-rata ± SD 97,667 ± 0,577a 98 ± 1,000a 97,333 ± 0,577a
Keterangan: notasi yang sama pada kolom yang berbeda menunjukkan bahwa setiap perlakuan tidak memberikan pengaruh yang signifikan (p>0,05)
Hasil Analisis of Varian (ANOVA) viabilitas sel limfoid udang vaname yang dikultur pada media MEM, L-15 dan TCM menunjukkan bahwa perlakuan media tidak memberikan pengaruh yang nyata (p>0,05) terhadap viabilitas sel limfoid udang vaname. Hasil analisis data dapat dilihat pada Lampiran 5. Grafik
viabilitas sel limfoid udang vaname pada media MEM, L-15 dan TCM disajikan pada Gambar 5.4.
Gambar 5.4. Grafik Viabilitas Sel Limfoid Udang Vaname
Pada penelitian ini, berdasarkan hasil penghitungan viabilitas sel limfoid pada media MEM, L-15 dan TCM menunjukkan hasil yang baik karena nilai viabilitas pada ketiga media lebih dari 95 %. Hal ini ditunjukkan dengan warna sel berwarna bening yang lebih dominan setelah diberi trypan blue (Gambar. 5.5).
Gambar. 5.5. Viabilitas Sel Limfoid
Keterangan: : sel yang hidup : sel yang mati
96,8 97 97,2 97,4 97,6 97,8 98 98,2 MEM L-15 TCM Rata-rata (%)
32
5.2Pembahasan
Kultur sel merupakan istilah yang digunakan dalam pemeliharaan atau pengembangan sel secara in vitro mencakup kultur sel tunggal. Pada kultur sel, sel yang tumbuh tidak panjang seperti sel pada jaringan (ATCC, 2012). Sel yang ditumbuhkan di dalam media kultur (in vitro) akan kehilangan sifat interaksi sel yang spesifik serta menjadi mobile ketika sel menyebar dan mulai berproliferasi sehingga populasi sel meningkat (Djuwita, 2002). Media merupakan faktor terpenting bagi pertumbuhan dan perkembangan kultur sel. Pada penelitian ini, media yang digunakan ada tiga macam yakni media MEM, media L-15 dan media TCM. Metode aseptis harus selalu diterapkan dalam proses pembuatan kultur sel, mengingat rawannya terjadi kontaminasi.
Pertumbuhan kultur sel limfoid udang vaname menunjukkan hasil yang berbeda pada masing-masing media. Sel limfoid yang dikultur ini bisa tumbuh setelah 24 jam inokulasi (Itami et al., 1999) dan mencapai monolayer pada hari ke-7 hingga hari ke-8 (Lu et al., 1995). Proses pembelahan sel limfoid terbagi dalam 12 tahap. Setelah pembelahan sel, sel turunan mereka berbentuk seperti sel fibroblas atau epiteloid (Lang et al., 2002). Sel limfoid yang dikultur dapat bertahan hingga 54 hari. Sel tidak bisa bertahan lama setelah diberi tripsin atau kolagen yang digunakan saat pemisahan sel (Itami et al., 1999).
Sel limfoid udang vaname bisa tumbuh dengan baik kemungkinan karena dipengaruhi oleh beberapa faktor misalnya suhu, CO2 dan nutrisi yang terkandung dalam media. Pada penelitian kultur sel limfoid udang vaname, suhu yang digunakan sebesar 280C. Menurut Hsu et al. (1995) dan Luedeman (1990),
pada suhu 280C kultur sel limfoid udang dapat tumbuh dengan baik. Pernyataan ini didukung oleh Itami et al. (1999) yang menyatakan bahwa kultur sel limfoid udang tumbuh baik pada suhu 250C - 300C dan akan tumbuh optimum pada suhu 300C. Pada penelitian ini kadar CO2 yang digunakan sebesar 5%. Malole (1990) menyebutkan penggunaan kadar CO2 sebesar 5% dapat digunakan sebagai pengatur keseimbangan pH dalam media.
Umur udang juga bisa berpengaruh terhadap pertumbuhan kultur sel limfoid udang. Semakin dewasa udang maka kemampuan regenerasi selnya semakin melambat sehingga saat dikultur pertumbuhan selnya butuh waktu yang agak lama. Kultur sel yang berasal dari jaringan muda akan mengandung lebih banyak sel-sel prekursor dan memiliki kemampuan proliferasi serta daya tahan yang lebih tinggi dibandingkan sel yang berasal dari jaringan dewasa (Djuwita, 2002). Lu et al., (1995) menyatakan ukuran udang optimal yang digunakan untuk preparasi kultur primer sel Oka adalah 20 – 30 gram. Penggunaan udang yang berukuran kurang dari 10 gram akan menyulitkan saat pengambilan organ limfoid. Udang yang telah dewasa dan beratnya lebih dari 30 gram umumnya tidak direkomendasikan karena sel dari organ-organnya terlihat lebih lambat saat berproliferasi dan lebih cepat berdegenerasi walaupun terlihat organnya lebih besar.
Pertumbuhan sel pada ketiga media yang diujikan menunjukkan hasil yang baik karena viabilitas sel limfoid lebih dari 95%. Gibco (2011) menyatakan bahwa media yang baik adalah yang dapat mempertahankan kelangsungan hidup sel yang dikultur dengan nilai viabilitas minimal 95%. Penelitian ini dianggap berhasil
34
karena jumlah sel limfoid yang tumbuh pada ketiga media melebihi 104 sel/ml. Menurut Phelan (1998) kultur sel yang tumbuh sebesar 104 sel/ml termasuk dalam kategori rendah dan kultur sel dalam kategori tinggi ataupun bisa juga dikatakan berhasil yakni bila sel yang dikultur tumbuh minimal 105 sel/ml.
Pertumbuhan kultur sel limfoid udang vaname yang tertinggi adalah pada media L-15 dengan rata-rata jumlah sel sebesar 19,667 x 106 sel/ml pada hari ke-6 dan menjadi 39 x 106 sel/ml pada hari ke-18 dengan viabilitas mencapai 98%. Data statistik menunjukkan bahwa pertumbuhan kultur sel limfoid udang vaname pada media L-15 berbeda signifikan dengan pertumbuhan kultur sel limfoid udang vaname pada kedua media lainnya (p < 0,05).
Crane and Williams (1997) menyatakan bahwa dari tiga media komersial yakni MEM, L-15 dan TCM yang digunakan dalam kultur sel udang, L-15 merupakan media terbaik daripada kedua media lainnya. Pendapat ini didukung oleh Toullec (1999) yang menyatakan media L-15 dan TCM bila digunakan dalam kultur sel menunjukkan hasil yang berbeda jauh. TCM dan L-15 secara konsisten berhasil menghasilkan kultur primer dari berbagai jaringan krustasea. Kedua media ini memiliki komposisi dan konsentrasi komponen yang berbeda secara signifikan (Lang et al., 2002). Baik TCM dan L-15 biasanya digunakan sebagai media kultur sel ikan, tetapi L-15 lebih sering digunakan (Lee et al., 1993 dalam Claydon, 2009) dan dilaporkan lebih berhasil daripada TCM dalam memulai kultur sel primer ikan (Schreera et al ., 2005 dalam Claydon, 2009).
Keberhasilan L-15 ini mungkin dikarenakan media ini memiliki kapasitas buffer yang lebih besar daripada kedua media lainnya, sehingga memungkinkan
sel-sel untuk memanfaatkan asam amino bebas dan menggantikan glukosa dengan galaktosa dan piruvat. Piruvat pada media ini memungkinkan sel untuk meningkatkan produksi CO2 endogeneous sehingga tidak bergantung pada CO2 dan HCO3 eksogeneous (Griffiths, 1986). Walaupun TCM mengandung lebih banyak jenis vitamin dan asam amino, namun vitamin dan asam amino yang terdapat pada L-15 mempunyai konsentrasi yang lebih tinggi (Claydon, 2009). Konsentrasi asam amino dan vitamin yang lebih tinggi mengakibatkan kemampuan proliferasi sel limfoid udang vaname pada media L-15 lebih optimal daripada media MEM maupun TCM.