The hydrolysis of bile acid conjugates by selected fungi : a thesis presented in partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Biotechnology at Massey University

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A The s i s p r e s e n t e d i n p a r t i a l f u l f i l m e n t o f t h e r e q u i r emen t s f o r t h e d e g r e e o f Do c t o r o f Ph i l o s o phy i n B i o t e c hno l o g y

a t Ma s s e y U n i v e r s i t y .

M I CHAEL RUSS E L JOH N S 1 9 8 0

(3)

1

A B S T RACT

The p r e s e n c e o f c o n s t i t u t i v e , i n t r ac e l l u l a r a n d e x t ra c e l l u l a r e n z yme s c a t a l y s i n g t h e hydr o l y s i s o f g l yc i n e b i l e a c i d

c on j u ga t e s i n t h e fun g u s Cer c o s p ora me l o n i s C B S 1 6 2 . 6 0 w a s d e mo n s t r a t e d b y t h e u s e o f c e l l - f r e e s y s t em s . S h a k e f l a s k

a n d f e r me n t e r s tud i e s w e r e u n d e r t a ke n t o d e t e rm i n e env i r o n me n t a l f a c t o r s f a vo u r i n g h i gh f r e e b i l e a c id y i e l d s . Two maj o r

f a c t o r s w e r e o b s e rv e d t o r e du c e s uch y i e l d s . The s e w e r e t h e b in d i ng o f t h e b i l e a c i d t o t h e myc e l i um a n d t h e d e g r a da t i o n o f f r e e b i l e a c i d s t o n o n - s t e r o i d a l p ro du c t s b y t he fungu s .

Who l e - c e l l c u l t u r e s o f C . me l o n i s e x h i b i t e d p o o r u t i l i s a t i o n o f t a u r i n e c o n j u g a t e s w i t h no c o n c om i t an t p r o duc t i o n o f f r e e b i l e a c i d . I nc ub a t i o n o f s yn t he t i c b i l e c o n j u g a t e a na l o gue s w i t h C . me l o n i s a n d t h e u s e o f c e l l - fr e e s y s t em s s ug g e s t ed t h a t t h i s wa s du e t o t wo m a j o r f a c t o r s : f i r s t l y , t h e s p e c i f i c i t y o f t he e x t r a c e l l u l a r e n z yme f o r a - am i n o c a r b o xy l i c a c i d

c o n j ug a t e s a n d s e c o nd l y , t he a p p a r e n t i n ab i l i ty o f t au r i n e c o n j u g a t e s t o g a i n a c c e s s t o a c o n s t i t u t i v e , i n t r ac e l lu l a r c ho l an o y l t au r ine h yd r o l a s e . I t i s p ro p o s e d t ha t t h e p o o r

p e rm e a b i l i t y o f t h e fun ga l c e l l m emb r a n e i s r e s p o n s i b l e . H e n c e , t he l o w a c t i v i t y o f w ho l e - c e l l c u l tu r e s o f C . me l o n i s o n

t au r i n e c on j u ga t e s s u g g e s t s t ha t an i n du s t r i a l p ro c e s s emp l o y i n g t he�fung a l hydro l y s i s o f g a l l i s no t f e a s i b l e .

C ompa r a t i v e s tud i e s w i t h C u r v u l a r i a fa l l ax I FO 8 8 8 5 s howe d t h a t i t p o s s e s s e d supe r i o r s p e c i f i c h y dr o l a s e a c t i v i t y o n g l yc o

d e o x y c h o l i c ac i d c o m p a r e d t o C . me l o n i s , a l t ho u g h t h i s i s no t appa r e n t f r o m qua l i t a t i ve s c r e e n i n g .

The a b i l i t i e s o f C . me l o n i s , Curv u l a r i a c o i c i s I FO 7 2 7 8 a n d A s pergi l l u s o c h ra ceu s I FO 4 0 7 1 ( W i l he l m ) t o 7 a - d e hydroxy l a t e c ho l i c a c i d and i t s n a t u r a l c o n j u ga t e s w e r e i n v e s t i g a t e d . De s p i t e t he p r e s en c e o f an a p p a r e n t l y c o n s t i t u t i v e , i n t r a c e l l u l a r 7 a - hyd r ox y c ho l a n o y l d e hyd r o x y l a s e in t h e s e o r g a n i sm s , o n l y l ow y i e l d s o f d e h yd r o x y l a t ed p rodu c t s we r e ob t a i n e d w i t h who l e - c e l l c u l t u r e s .

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A C K NOWLE DGEMENTS

I w i s h to a c k n ow l e d g e a n d t ha n k the fo l l o w i n g :

D r's R . C h o n g a n d I . S . Maddox for t he i r p a t i e n t a n d s t i mu l a t i n g s up e rv i s i o n .

T h e C h em i s t ry D e p a r tm e n t o f O t a go U n i v e r s i t y , N e w Z e a l an d a nd P r o f e s s o r R . Ho d g e s o f t he Chem i s t ry D e p a r t me n t o f Ma s s e y Un i v e r s i t y , N e w Ze a l an d fo r p e r fo rm i n g t h e e l e m e n t a l and m a s s s p e c t rome t r i c a n a l y s es r e s p e c t i v e l y .

D r R . P . G a r l an d a n d New Ze a l and P h a r m a c eut i c a l s Lt d . , fo r t h e u s e o f t he i r ana l y t i c a l e q u i pm e n t .

The De p a r tme n t o f S c i e n t i f i c and I n du s t r i a l Re s e a r ch f o r fund i n g t h i s p r o j ec t .

Mr s M . Na t i o n f o r h e r s up e rb t yp i n g o f th i s t h e s i s a n d Mr P . L e C ev e f o r h i s e x c e l l e n t d r awi n g o f t he

f i gu r e s .

Ju fo r h e r l o v i n g e n c o u r a g e men t .

My L o r d and S a v i o u r J e s u s C h r i s t whom I s e r v e a b o v e a l l . F o r H i s s t e ad f a s t l ove a n d h e l p . T o H im b e a l l g l o r y.

(5)

TAB L E O F CONT ENT S

A B S T RACT ¹

AC KNOWL E D GEMENT S ¹¹

TAB LE O F C ONTENTS ¹¹¹

L IST O F F I GU R E S v i i

L IST O F TAB L E S ^X1

B I L E AC ID NOMENC LATURE x i i

A B B REV IAT I O N S ^{X 1 1 1}

CHAPT E R 1 P R E LUDE 1

CHAPT E R 2 L IT E RATURE REV IEW 4

2 . 1 . B i l e A c i d s 4

2 . 1 . 1 . P r o p e r t i e s an d O r i g i n 4

2 . 1 . 2 . B i l e Ac i d s a s M i c r o b i a l S ub s t ra t e s 5 2 . 1 . 2 . 1 . The t o x i c i t y o f b i l e a c i d s

to m i c r o o r g a n i s m s 7

2 . 1 . 2 . 2 . The p h y s i c a l s t a t e o f b i l e

ac i d s i n fe rme n t a t i o n b ro t h 7 2 . 2 . T h e M i c rob i a l Hyd r o l y s i s o f B i l e A c i d C o n j ug a t e s 9

2 . 2 . 1 . Bac t e r i a l Hydr o l y s i s 9

2 . 2 . 2 . Fung a l H y dr o l y s i s 1 0

2 . 3 . M i c r o b i a l T r a n s fo r m a t i o n s o f F r e e B i l e Ac i d s 1 3 2 . 3 . 1 . Ox i da t i v e T r a n s f o r ma t i o n s 1 4

2 . 3 . 2 . O t he r T r a n s fo rm a t i o n s 1 6

CHAPT E R 3 METHODS 2 1

3 . 1 . 3 . 2 .

3 . 3 . 3 . 4 . 3 . 5 . 3 . 6 .

Me l t i n g Po in t s Ma t e r i a l s

3 . 2 . 1 . Med i a

3 . 2 . 2 . Chroma t o g raphy

3 . 2 . 3 . B i l e A c i d s M a t e r i a l s 3 . 2 . 3 . 1 .

3 . 2 . 3 . 2 . 3 . 2 . 3 . 3 .

F r e e b i l e a c i d s G l yc i ne and t a u r i ne c on j u g a t e d b i l e a c i d s Syn t he t i c b i l e a c i d c o n j u g a t e s

3 . 2 . 4 . So l v e n t s

3 . 2 . 5 . O t h e r C h em i c a l s O r g a n i sms

S t e r i l i s at i o n o f Me d i a C l e a n i ng o f G l a s swa r e Ana l y t i c a l Me t ho d s 3 . 6 . 1 . p H M e a s u r e me n t

3 . 6 . 2 . Dry We i g ht De t e rm i n a t i o n 3 . 6 . 3 . To t a l C a rb o h yd ra t e An a l y s i s

2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 4 2 4 2 6 2 8 2 9 2 9 2 9 3 0 3 0 3 0 3 0

111

(6)

3 . 7 .

3 . 8 .

3 . 9 .

3 . 1 0 .

3 . ll.

3 . 1 2 .

3 . 6 . 4 . 3 . 6 . 5 . 3 . 6 . 6 . 3 . 6 . 7 ^• 3 . 6 . 8 . 3 . 6 . 9 . C u l t u r e 3 . 7 . 1 . 3 . 7 . 2 .

T h i n L ay e r C h r o ma t o g r aphy

H i gh P e r fo rman c e L i q u i d C h r omato graphy I n fr a - r e d S p e c t r o p ho t ome t r y

E qu iva l e n t We i g h t D e t e rm i na t i o n E l emen t a l Ana l y s i s

Ma s s S p e c t rome t r y Cond i t i o n s

F l as k C u l t u r e Fe rmen t e r C u l t u r e

3 . 7 . 2 . 1 . Equ i pm e n t a n d 3 ^•7 . 2 . 2 ^•

3 . 7 . 2 . 3 . 3 . 7 . 2 . 4 . 3 . 7 . 2 . 5 .

i n s t rume n t a t i o n

S t e r i l i s a t i o n m e t hods I no c u l um p r e p a r a t i on Op e r a t i o n

D i s c u s s i o n C e l l - f r e e Sys t e m s

3 . 8 . 1 . Ce l l P r o du c t i o n

3 . 8 . 2 . The C e l l - f r e e F i l t r a t e 3 . 8 . 3 . The C e l l - fr e e E x t r a c t 3 . 8 . 4 . I ncuba t i o n C o nd i t i o n s

B i l e A c i d E x t r a c t i on a n d S amp l e P r e p a ra t i o n 3 . 9 . 1 . So l v e n t E x t ra c t i o n

3 . 9 . 2 . F r e e z e - Dr y E x t r a c t i o n P r o du c t Chara c t e r i s a t i o n

3 . 1 0 . 1 . The Ac t i o n o f C . m e l o n i s C B S 1 6 2 . 6 0 on G l yc o d e o x y c h o l i c a c i d

3 . 1 0 . 2 . The Ac t i o n o f C . m e l o n i s C B S 1 6 2 . 6 0 on G l yco c h o l i c a c i d

3 . 1 0 . 3 . The Ac t i o n o f C . fa l l ax I FO 8 8 8 5 on G l yc o d e o x yc h o l i c a c i d

3 . 1 0 . 4 . The Ac t i o n o f C . c o i c i s I F O 7 2 7 8 o n G l y c o c ho l ic a c i d

3 . 1 0 . 5 . The Ac t io n o f C . m e l o n i s C B S 1 6 2 . 6 0

on G l yc o d e o xy c ho l i c a c i d i n t he F e rme n t e r a t p H 7 . 5

C a l c u l a t ion s

3 . 1 1 . 1 . Hp l c D a t a Ana l y s i s 3 . 1 1 . 2 . Ma s s B a l an c e s

3 . 1 1 . 3 . B i l e A c i d Da t a Ana l y s i s D i s c u s s i o n o f Me t ho d s

C HA P T E R 4 THE HYDROLY S I S O F G L Y C I NE B I L E AC I D C ONJUGATE S B Y � . ME LO N I S

4 . 1 . 4 . 2 .

4 . 3 .

I n t r o du c t i on

Shake F l a s k S tu d i e s

4 . 2 . 1 . The C o u r s e o f Hyd r o l ys i s

4 . 2 . 2 . The T i m e o f S ub s t r a t e Add i t i o n

4 . 2 . 3 . The E f f e c t o f G l yc o d e o xyc h o l i c ac i d C o n c e n t r a t i o n o n i t s Hyd r o l y s i s 4 . 2 . 4 . The L o c a t i on o f A c t i v i t y

4 . 2 . 5 . The E f fe c t o f C y c l o hex i m i de 4 . 2 . 6 . D i s cu s s i o n

T h e Lo s s o f B i l e Ac i d i n C . me l o n i s C u l t u r e s 4 . 3 . 1 . The B i n d i ng o f B i l e Ac i d s t o Myc e l ium 4 . 3 . 2 . The E f fe c t o f 8 - H y d roxyqu i n o l i n e o n

B i l e Ac i d Lo s s

3 1 3 2 3 4 3 4 3 4 3 5 3 5 3 5 3 5 3 6 4 0 4 1 4 1 4 2 4 3 4 3 4 3 4 3 4 4 4 4 4 4 4 5 4 5

4 5 4 6 4 7 4 7

4 9

so 5 0 5 1 5 2 5 2

5 7 5 7 5 8 5 8 6 2 6 3 6 9 7 1 7 5 7 8 7 8 8 0

(7)

4 . 4 .

4 . 5 .

4 . 6 .

4 . 7 .

4 . 3 . 3 . The Lo s s o f Hydro l ys i s P r o du c t 4 . 3 . 4 . D i s c u s s i o n

F e rm e n t e r S t ud i e s

4 . 4 . 1 . T he C o u r s e o f Hydr o l y s i s 4 . 4 . 2 . T he E f f e c t o f Ae r a t i o n

4 . 4 . 3 . T h e E ffe c t o f t h e C a rb on S o u r c e 4 . 4 . 4 . The E f f e c t o f G l u c o s e Add i t i o n 4 . 4 . 5 . The E ff e c t o f pH .

4 . 4 . 6 . D i s c u s s i on .

B i l e a c i d Me t a b o l i t e s o f G l y c o d e o xy c h o l i c a c i d 4 . 5 . 1 . F r ac t i on A

4 . 5 . 2 . F r a c t i o n B 4 . 5 . 3 . D i s cu s s i o n

F e rm e n t e r S t ud i e s w i t h G l yc o c ho l i c a c i d 4 . 6 . 1 . The C o u r s e o f Hydr o l y s i s

4 . 6 . 2 . D i s c u s s i o n Summ ar y

C HA P T E R 5 T H E HYDROLYS I S O F TAUR I NE B I LE AC I D C ONJU GATE S B Y � . MELON I S

5 . 1 . 5 . 2 . 5 . 3 . 5 . 4 . 5 . 5 . 5 . 6 . 5 . 7 . . 5 . 8 . 5 . 9 .

I n t ro du c t i o n

T h e U s e o f T a u ro c ho l a t e a s a S o l e S u l phur S o u r c e T h e E f f e c t o f L a c t o s e o n t h e Ac t i o n o f

C . me l o n i s o n T a u r o c ho l a t e

eo - f e rm e n t a t i on o f T a ur o c ho l a t e a n d G l yc o de o xy c ho l i c a c i d

T h e U t i l i s a t i o n o f Va r i o u s Am i n o a c i d s a s S o l e N i t r o g e n S o u r c e s b y C . me l o n i s

T h e I n f l ue n c e o f t h e Am i n o a c i d Mo i e t y o n B i l e C on j u ga t e Hydro l y s i s

E n z ym e L o c a t i on S tud i e s T h e E f f e c t o f C y c l o hex im i d e

D i s c u s s i o n

C HA P T E R 6 T H E HYDRO LY S I S O F B I LE AC I D C ONJUGAT E S B Y CURVULAR I A FALLAX

6 . 1 . 6 . 2 .

6 . 3 . 6 . 4 .

I n t r oduc t i on

S h a k e F l a s k S t ud i e s

6 . 2 . 1 . The H y dr o l y s i s o f G l y c o d e oxycho l i c a c i d a t V a r i o u s C o n c e n t r a t i on s

6 . 2 . 2 . The e o - f e rme n t a t i on o f T a u r o c ho l a t e a nd G l y c o d e o xyc ho l i c a c i d

F e rm e n t e r S t ud i e s D i s cu s s i o n

C HA P T E R 7 FUNGAL 7 a - DEHYDROXY LAT I O N 7 . 1 .

7 . 2 . I n t roduc t i on

D e h y d r o xy l a t i o n us i n g Who l e C e l l s o f C . co i c i s 7 . 2 . 1 . The C o u r s e o f D e h y d r o x y l a t i on

7 . 2 . 2 . The E f f e c t o f Sub s t r a t e

7 . 2 . 3 . The E f f e c t o f t h e Me t hod o f I nc ub a t i o n

8 6 8 7 8 9 9 0 9 4 9 5 9 7 9 8 1 0 5 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 4 1 1 6 1 1 6 1 2 1 1 2 2

1 2 5

V

1 2 5 1 2 5

1 2 6 1 3 0 1 3 2 1 3 5 1 4 0 1 4 2 1 4 5

1 4 9 1 4 9 1 5 0 1 5 0 1 5 7 1 5 9 1 6 2

1 6 5 1 6 5 1 6 5 1 6 5 1 6 6 1 6 9

(8)

7 . 3 .

7 . 4 . 7 . 5 .

D e hy dr o x y l a t i o n U s i ng Who l e C e l l s o f A . o c h r a ceus

7 . 3 . 1 . T he E ffe c t o f t he Sub s t r a t e

7 . 3 . 2 . T he E ffe c t o f t he Me thod o f I nc ub a t i o n Dehyd r o x y l a t i o n u s i n g C e l l - fr e e S y s t ems

D i s c u s s i o n

CHAPT E R 8 F I NAL D I S C US S I ON C HA P T E R 9

RE F E RE N C E S

A P P E N D I C ES A P P E N D I X 1 . A P P E N D I X 2 .

SUMMARY

I n fra - r e d S p e c t r a

T h e De t e rm i n a t i o n o f B i l e A c i d P a r t i t i o n C o e ffi c i e n t s

1 7 0 1 7 0 1 7 0 1 7 0 1 7 3

1 7 6

1 8 1 1 8 3

1 8 8 1 9 1

(9)

L I ST O F F I GU RE S

2 . 1 5 8 - c ho l a n i c a c i d . b i l e a c i d s .

The p a r e n t s t ru c t u r e for 2 . 2 The s t r u c t u r a l fo r mu l a e o f s om e c ommo n b i l e

v i i

6

a c i d s . 6

3 . 1 A p ho t o g ra ph o f t he fe rme n t e r and i t s anc i l l a r y

e qu i pmen t . 3 7

3 . 2 A s ch e m a t i c d i ag r am o f t h e f e rme n t e r and i t s

a nc i l l a r y e q u i pme n t . 3 8

4 . 1 A t yp i c a l s ha k e f l a s k c u l t u r e o f C . me l o n i s i n t h e p r e s e n c e o f O . S g l - 1 g l y c i n e c o n j u g a t e s i n

g l u c o s e - p ep t o n e m e d i um . 5 9

4 . 2 The h y d r o l ys i s o f O . S g l - 1 g l y c o de o xyc ho l i c a c i d

b y C . m e l o n i s i n g l uc o s e - p ep t o n e med i um . 6 0 4 . 3 The hyd r o l y s i s o f O . S g l - 1 g l yc o c ho l i c a c i d b y

C . me l o n i s i n g lu c o s e - p e p t o n e m e d i um . 6 1 4 . 4 The h y d r o l y s i s o f O . S g l - 1 g l y c o d e o xy c ho l i c a c i d

a d d e d to g r own c u l t u r e s o f· C . me l o n i s . 64 4 . 5 The h y d r o l y s i s o f 1 . 0 g l - 1 g l y c o d e o xy c ho l i c a c i d

i n s ha k e f l a s k b y C . me l o n i s g r o w n o n g l u c o s e -

p ep t o n e m e d ium . 6 6

4 . 6 The hydr o l y s i s o f S . Og l - 1 g l yc o d e o x y c ho l i c a c i d i n s ha k e f l a s k b y C . me l o n i s g r own o n g lu c o s e -

p e p t o n e med ium . 6 7

4 . 7 The h y dr o l y s i s o f 1 0 g l - 1 g l y c o d e o x y c ho l i c a c i d i n s ha k e f l a s k b y C . me l o n i s g rown o n g l u c o s e -

p e p t o n e me d i um . 68

4 . 8 The " r a t e " o f g l yc o d e o xych o l i c a c i d ut i l i s a t i on v s . t he i n i t i a l s ub s t r a t e c onc e n t r a t i o n i n s ha k e

f l a s k c u l tu r e s o f C . me l o n i s . 7 0

4 . 9 The e f f e c t o f c y c l o he x im i de add i t i o n t o g rown c u l tu r e s o f C . me l o n i s i n c u b a t e d i n g l uc o s e -

p e p t o n e med i um . 7 3

4 . 1 0 The h y d r o l y s i s o f O . S g l - 1 g l yc o d e o xycho l i c a c i d by c u l t ur e s o f C . me l o n i s p r e t r e a t e d w i t h c yc l o -

h e x i m i de . 7 4

4 . 1 1 The e f fe c t o f 8 - hydro xyqu i no l i ne o n t h e d r y we i ght o f C. me l o n i s g rown in g l u c o s e - p e p t one m e d ium

c o n t a i n i n g O . S g l - 1 g l yc o d e o x y c ho l i c ac i d . 8 3

(10)

4 . 1 2

4 . 1 3

4 . 1 4

4 . 1 5

4 . 1 6

4 . 1 7

4 . 1 8

4 . 1 9

4 . 2 0

4 . 2 1

4 . 2 2

4 . 2 3

4 . 2 4

4 . 2 5

T h e e ff e c t o f 0 . 3 4 mm o l l - l 8 - hy d r o xyqu i n o l i n e o n t he hydro l y s i s o f 0 . 5 g l - l g l yc o de o xyc ho l i c a c i d b y C . me l o n i s .

- 1 -1

T h e e f f e c t o f 0 . 6 8 mm o l l 8 - hy d r o x y qu i no l i n e on t he hydr o l y s i s o f 0 . 5 g l and 1 . 3 6mmo l l _1 g l y c o d e o x yc ho l i c a c i d b y C . me l o n i s .

The d i s a p p e a ra n c e o f 0 . 5 g l - l d e o xy c h o l i c ac i d from c u l t u r e s o f C . me l o n i s g rown o n g l uc o s e p e p t o n e med i um .

- 1

The c o u r s e o f t h e hydr o l y s i s o f 0 . 5 g l g l yco - d e o xy c ho l i c a c i d b y C . me l o n i s i n t h e f e rmen t e r u s i n g g l uc o s e - p e p t o n e me d ium .

S p e c i f i c r a t e s o f g l y c o d e o xy c ho l i c a c i d

d i s a p p e a r an c e a n d d e o x y c h o l i c a c i d a c cumu l a t i o n i n t h e f e rme n t e r .

The e f f e c t o f r e duc e d a e r a t i on o n t h e hydro l y s i s o f O . S g l - 1 g l yc o d e o xycho l i c a c i d b y C . me l o n i s g r own o n g luco s e - p e p t o n e m e d i um i n a f e rmen t e r . The e f f e c t o f l ac t o s e o n t he hydr o l y s i s o f

0 . 5 g l - l g l yc o d e o x y c ho l i c a c i d by C . me l o n i s g rown i n l a c t o s e - p e p t on e m e d i um i n a f e rm e n t e r .

The e f f e c t o f i n c r emen t a l g l uc o s e a dd i t i on on t he h y dr o l y s i s o f 0 . 5g l - l g l yc o d e o x y c h o l i c a c i d b y C . me l o n i s g r own o n g l u c o s e - p e p t o n e med ium

i n a f e rm e n t e r .

S p e c i f i c r a t e s o f g l yc o d e o x y c ho l i c a c i d

d i s ap p e a r an c e a n d d e ox y c h o l i c ac i d a c cumu l a t i o n i n t he f e rmen t e r .

The hyd r o l ys i s o f 0 . 5 g l - l g l y c o d e o x ycho l i c ac i d a t p H 5 . 5 b y C . me l o n i s g rown i n g l u c o s e - p e p t o n e m e d i um i n a fe rme n te r .

The g r ow t h and u t i l i s a t i o n o f g l u c o s e b y

C . me l o n i s a t p H 7 . 5 i n a f e rmen t e r , i n g l uc o s e p e p t o n e med i um c on t a in i n g O . S g l - 1 g l yc o de o xycho l i c a c i d .

S p e c i f i c r a t e s o f g l y c o d e o xy c ho l i c a c i d

d i s app e a r an c e a n d d e o x y c ho lic a c i d a c cumu l at i on i n t h e f e rme n t e r a t pH 5 . 5 .

T h e e f f e c t o f v a r i ab l e s a n d t he i r c omb i n a t i o n s o n t he max imum y i e l d o f d e o xyc ho l i c ac i d from hyd r o l y s i s i n t h e f e rmen t e r .

The hydro l y s i s o f O . S g l - l g l yc o c ho l i c a c i d b y C . me l o n i s grown o n g lu c o s e - p e p t o n e m e d i um 1 n a fe rmen t e r .

8 4

8 5

8 8

9 1

9 3

9 5

9 6

9 9

1 0 0

1 0 2

1 0 3

1 0 4

1 0 6

1 1 8

(11)

4 . 2 6

5 . 1

S p e c i f i c r a t e s o f g l y c o c ho l i c a c i d d i sapp e a r a n c e and p r o du c t a c c umu l a t i o n i n a f e rmen t e r .

The g r o w t h o f C . me l o n i s i n s ha k e f l a s k u s i n g t au r o c h o l a t e w i t h , a n d w i t ho u t , t au r i ne a s a s o l e s u l p h u r s ou r c e .

5 . 2 Tau r o c h o l a t e c o n c e n t ra t i o n s i n C . me l o n i s c u l t u r e s : w i t h t au r o c ho l a t e a s s o l e s u l p hu r

s o u r c e . 5 . 3

5 . 4

5 . 5

5 . 6 5 . 7

5 . 8

5 . 9

5 . 1 0

5 . 1 1

6 . 1

6 . 2

Tau r o c h o l a t e c o n c e n t r a t i o n s i n C . me l o n i s cu l tu r e s : w i t h t au r o c ho l a t e and t au r i n e a s s u l p hu r s ou rc e .

The myc e l i a l d r y w e i gh t o f C . me l o n i s a n d l a c t o s e c o n c e n t r a t i o n s i n t h e p r e s en c e o f 0 . 5 g l - l

t au r o c h o l a t e i n a f e rme n t e r .

B i l e a c i d c o n c en t r a t i o n i n s h a k e f l a s k c u l tu r e s o f C . me l o n i s c o n t a in i n g 0 . 5 g l - l e a c h o f

t au r o c h o l a t e and g l y c o d e o x yc ho l i c a c i d i n g l uco s e - p e p t o n e m e d i um .

The g r o w t h o f C . me l o n i s o n v a r i ou s am i n o a c i d s p r o v i d e d a s s o l e n i t r o g e n s ou r c e s .

- 1

The hydr o l y s i s o f 0 . 5 g l N - ( a - a l an o ) - de oxy - c ho l i c a c i d b y C . me l o n i s g rown i n s ha k e f l a s k cu l tu r e s o n g l u c o s e - p e p t o n e med ium .

The c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 5 g l - l N - ( B - a l ano ) deoxy c ho l i c a c i d i n s ha k e f l a s k c u l t u r e s o f C . me l o n i s g r ow n o n g lu c o s e - p e p t o n e med ium .

The c o n c e n t r a t i on o f N - ( a - am i nome thane s u l phony l ) d e o x yc ho l a t e i n C . me l o n i s s ha k e f l a s k c u l tu r e s g r o wn o n g lu c o s e - p e p t o ne m e d i um .

The c o n c e n t r a t i o n o f s o d i um t au r ode o x y c ho l a t e i n C . m e l o n i s s h a k e f l a s k c u l t ur e s g r own o n g l uc o s e - p e p t o n e m e d i um .

The e f f e c t o f c y c l o he x i m i de o n t h e hydr o l y s i s o f 0 . 5 g l - l t au r o c ho l at e b y C . me lo n i s g r ow n i n

g l uc o s e - p e p t o n e m e d i um .

The h y d r o l ys i s o f 0 . 5 g l - l g l y c o d e o xycho l i c a c i d by C . fa l l ax i n s ha k e f l a s k s c o n ta i n in g g lu c o s e pep t o n e m e d i um .

The h y d r o l y s i s o f l . Og l - l g l yc o d e o xycho l i c a c i d b y C . fa l l ax i n s ha k e f l a s k s c on t a i n i n g g l u c o s e pep t o n e m e d i um .

i x

1 2 0

1 2 7

1 2 8

1 2 9

1 3 1 1 3 4

1 3 7

1 3 8

1 3 9

1 4 4

1 5 1

1 5 2

(12)

6 . 3

6 . 4

6 . 5

6 . 6

6 . 7

6 . 8

7 . 1

7 . 2

The hyd r o l y s i s o f 5 . 0 g l - l g l y c o d e o xycho l i c a c i d b y C . fa Z Z ax i n s ha k e f l a s k s c on t a in i n g g l uc o s e p e p t on e me d i um .

T h e hydr o l y s i s o f l Og l - 1 g l y c o d e o xycho l i c a c i d b y C . fa Z Z ax i n s h a k e f l a s k s c on t a in i n g g l u c o s e p e p t o n e me d i um .

T h e e x t e n t o f g lyco d e o x y c ho l i c a c i d u t i l i s a t i on v s . t he i n i t i a l sub s t ra t e c o nc e n t r a t i o n i n s ha k e f l a s k c u l t u r e s o f C . fa Z Z ax .

- 1

The e f f e c t o f 0 . 5 g l t au r o c ho l a t e on t h e

hydr o l y s i s o f 0 . 5 g l - 1 g l yc o d e o x y c ho l i c a c i d b y s ha k e f l a s k c u l t u r e s o f C . fa Z Z ax g rown i n g luc o s e p e p t o n e m e d i um .

The hyd r o l y s i s o f 0 . 5 g l - 1 g l y c o d e oxyc ho l i c a c i d i n a f e rm e n t e r b y C . fa Z Z ax g ro wn i n g l u c o s e p e p t o n e m e d i um .

The s p e c i f i c r a t e s o f g l y c o d e o x y c h o l i c a c i d hydr o l y s i s b y C . fa Z Z ax i n a f e r m e n te r .

The g r o w t h o f C . c o i c i s i n s ha k e f l a s k c u l t u r e s o f g l u co s e - p e p t o n e m e d i u m c o n t a i n i n g 1 . 0 g l - l o f g l yc o cho l i c a c i d .

The hydr o l y s i s and 7 a - d e hy d r o xy l a t i o n o f 1 . 0 g l - l g l y c o c ho l i c a c i d in s h a k e f l a s k c u l tur e s o f

C . c o i c i s g r own i n g l uc o s e - p e p t o n e med i um .

1 5 3

1 5 4

1 5 6

1 5 8

1 6 0

1 6 1

1 6 7

1 6 8

(13)

L I ST O F TAB LES

2 . 1 2 . 2

2 . 3

3 . 1 3 . 2 3 . 3

3 . 4

3 . 5 3 . 6

3 . 7 3 . 8

Some p rop e r t i e s o f c ommo n b i l e a c i d s .

T h e ab i l i t y o f fung i t o hydr o l y s e b i l e a c i d c on j u g a t e s i n s ha k e f l a s k c u l tu re .

R ep o rt e d f u n g a l 7 a - d e h y d r o xy l a t i o n , and c o n c om i t a n t p r o duc t s , o f b i l e a c i d s .

T h e g l uc o s e - p e p t o n e m e d i um . T h e s u l p hu r - de f i c i e nt med i um .

Da t a f r o m t he g l yc i n e and t au r i n e b i l e a c i d c on j ug a t e s y n t he s e s .

T h e c h a r a c t e r i s a t i o n o f t he s yn t he t i c c o n j uga t e s . T h e r e t e n t i o n v o l um e s o f b i l e a c i d s .

Fo rmul a e s ug g e s t e d f o r N - (S - a l a no ) de o x y c h o l i c a c i d .

Re c o v e r i e s o f b i l e a c i d s by c h l o ro fo rm e x t rac t i o n . R e c o ve r i e s o f b i l e a c i d from me d i um b y f r e e z e d r y e x t r ac t i o n .

4 . 1 T h e l o s s o f b i l e a c i d a t d i f fe r e n t g l yc o d e o xyc ho l i c a c i d c o n c e n t r a t i on s .

4 . 2

4 . 3

4 . 4 4 . 5 4 . 6 5 . 1

7 . 1

T h e h y d r o l y s i s o f g l y c i n e c o n j u g a t e s b y c e l l - fr e e s y s t ems o f C . me l o n i s .

B i l e a c i d b i n d i n g t o m yc e l ium o f C . me l o n i s .

C h r oma t o g ra p h i c p r o p e r t i e s o f me t a bo l i t e s A a n d B .

F r a gme n t a t i o n p a t t e r n s o f me t a b o l i t e s A a n d B . C h r oma t o g rap h i c p r o p e r t i e s o f c omp ound X .

T h e hydr o l y s i s o f b i l e ac i d c o n j ug a t e s b y c e l l f r e e s ys t em s o f C . me l o n i s .

P r oduc t s f r om t he i nc uba t i o n o f b i l e a c i d s w i t h t h e c e l l - f r e e s y s t ems .

Xl

s

1 2 1 7

2 2 2 3

2 5

2 7 3 3

5 3

s s

5 6

6 5

6 9 7 9

1 1 3 1 1 5 1 1 9

1 4 1

1 7 2

(14)

B I LE AC I D NOMENC LAT U RE

T h e t r i v i a l name s u s e d f o r. b i l e a c i d s a r e g i v e n , fo l l owe d b y t h e a b b r ev i a t i o n s emp l o y e d , i n b r a c k e t s , a n d t h e i r I . U . P . A . C .

s y s t em a t i c c hem i c a l n a m e s ( I . U . P . A . C . - I . U . B . , 1 9 6 9 ) .

Cho l i c a c i d ( CA )

Che n o d e o xy c ho l i c a c i d De hydro c ho l i c a c i d D e o x y c h o l i c a c i d ( DC )

3 a , 7 a , l 2 a - t r i hyd roxy - 5 S - c h o l an - 2 4 - o i c a c i d .

3 a , 7 a - d i hy d r o x y - 5 8 - c ho l a n - 2 4 - o i c a c i d .

= 3 a , 7 a , l 2 a - t r i o xo - 58 - c ho l an - 2 4 - o i c a c i d .

= 3 a , l 2 a - d i h y d r o x y - 5S- c ho l an - 2 4 - o i c a c i d . Li t ho c ho l i c a c i d 3 a - h y d r o x y - 5 S - c h o l a n - 2 4 - o i c ac i d .

N - ( a - a l an o ) �d e o xy c ho l i c ac i d ( a - A D ) = 3 a , l 2a - d i hydroxy - 5S- c ho l a n - 2 4 - o y l - a - a l a n i n e .

N - ( S- a l an o ) - de o xycho l i c ac i d ( S - A D ) = 3 a , l 2a - d i hy d r o x y - 5S- c ho l an - 2 4 - o y l - S - a l an i n e .

N - ( a - am i n om e t ha n e s u l ph o ny l ) -

de o xycho l i c a c i d ( N a - a - AMSD ) = 3 a , l 2 a - d i hydroxy - 5 S- c ho l a n - 2 4 - o y l a - am i nome t h a n e s ulpho n i c a c i d .

G l yc o c ho l i c a c i d ( G C ) 3 a , 7 a , 1 2 a - t r i hy d r oxy - S S - c ho l an - 2 4 - o y l g l yc i n e .

G l y c o c heno d e o x y c ho l i c a c i d = 3 a , 7 a - d i hyd r o xy - 5 S - c ho l a n - 2 4 - o y l g l yc i n e .

G l yc o d e o xy c ho l i c ac i d ( G D) = 3 a , l 2 a - d i hy d r oxy - 5 S - c h o l a n - 2 4 - o y l g l yc i n e .

T au r o c ho l i c a c i d ( Na T C ) = 3 a , 7 a , 1 2 a - t r i h y d r oxy - 5S- c ho l an - 2 4 - o y l t au r i ne .

T au r o c h e n o d e o xy c ho l i c a c i d = 3 a , 7 a - d i h y d r o xy - 5 S - c ho l an - 2 4 - o y l t au r i n e .

T au ro d e o x y c ho l i c ac i d ( NaTD) = 3 a , 1 2 a - d i hydroxy - S S- c ho l an - 2 4 - o y l t a u r i n e .

T h e t e rm " f r e e b i l e a c i d" d e no t e s a b i l e a c i d w i t h a n un s ub s t i tu t e d C - 2 4 c a rb o x y l i c ac i d g r oup . S u l p h o n i c a c i d c o n j ug a t e s w i l l b e u s u a l l y r e f e r r e d t o a s t he s o d ium s a l t .

(15)

x i i i

A B B R E V I AT I ONS

Abb r e v i a t i o n s o f u n i t s :

a mu o C d g

X g h

1 m M m / e m i n mmo l P a p s 1 rpm

a t o m i c ma s s un i t s d e g r e e s C e l S i u s d a y

g r a m

g r a v i t a t i o n a l a c c e l e r a t i o n (ms - 2 ) h o u r

l i t re m e t r e

mo l e p e r l i t r e

m a s s : c h a r g e r a t i o m i n u t e

m i l l i mo l e p e r l i t r e

p a s c a l ( N e w t o n p e r s qu a r e me t r e ) p o un d p e r s q ua re i n c h

r e vo l u t i o n s p e r m i nu t e

O t h e r a b b r e v i a t i o n s : ACC

ATC C c a l c d . C B S D . O . hp l c HUT

8HQ I . D . I FO I M I I R L i t . m.p . R.o t l c

A k e r s Cu l tu r e C o l l e c t i on o f Imp e r i a l Chem i c a l I nd u s t r i e s L t d .

Ame r i c a n Typ e C u l t u r e C o l l ec t i o n c a l cu l a t e d

C e n t r a a l b u r e a u vo o r S c h i mme l cu l t u r e s D i s s o l v e d o x y g e n

h i g h p e r f o rm a n c e l i q u i d c hroma t o g r a phy

H i ro s h ima U n i v e r s i t y , F a cu l ty o f E n g i ne e r i n g 8 - Hy d r o xyqu i no l i n e

I n t e rn a l d i a me t e r

I n s t i t u t e f o r F e rme n t a t i o n , O s a k a C o mmonwe a l t h Myco l o g i c a l I n s t i t u t e

I n f r a - r e d L i t e r a t u r e m e l t i ng p o i n t

T l c mo b i l i t y o f a c o mp ound r e l a t i ve t o t h e s o l v e n t f r o n t mob i l i t y

t h i n l a y e r c h roma t o g r a p h y