KEPULAUAN SERIBU DAN POTENSI DAYA HAMBATNYA
TERHADAP BAKTERI PATOGEN
MUHAMMAD FIKRI
C 34103008
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
RINGKASAN
MUHAMMAD FIKRI. C34103008. Penapisan Inhibitor Protease Dari Ekstrak Karang Lunak Asal Perairan Pulau Panggang, Kepulauan Seribu dan Potensi Daya Hambatnya Terhadap Bakteri Patogen. Dibawah bimbingan TATI NURHAYATI dan DESNIAR.
Beberapa komponen bioaktif yang dihasilkan oleh karang lunak meliputi antibiotika, senyawa antitumor, antijamur dan antikanker. Selain itu, diketahui juga karang lunak sebagai penghasil senyawa inhibitor enzim salah satunya adalah inhibitor protease. Enzim protease dihasilkan secara ekstraseluler dan intraseluler oleh hewan, tanaman, maupun oleh mikroba. Enzim protease dapat terlibat dalam aktivasi protease eukariotik yang berpotensi mempunyai sifat-sifat patogenik dan secara langsung atau tidak langsung terlibat dalam patogenesis penyebab penyakit asal bakteri (seperti tifus, kolera, pnemonia), virus (seperti influenza, HIV dan SARS) dan kanker. Semakin jelasnya keterlibatan enzim protease dalam berbagai mekanisme molekular penyakit tersebut, maka dalam beberapa tahun terakhir ini perhatian terhadap protease sebagai target senyawa obat yang dihasilkan oleh organisme di alam khususnya karang lunak sebagai penghambat kerja enzim protease (inhibitor protease). Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan karang lunak yang berpotensi sebagai penghambat aktivitas kerja enzim protease (inhibitor protease) pada beberapa bakteri patogen penghasil enzim protease serta mengetahui Minimum Inhibitory Concentration (MIC) dari ekstrak karang lunak tersebut.
Penelitian ini dilakukan dalam lima tahap. Tahap pertama adalah mengkoleksi karang lunak (soft coral) dan penumbuhan bakteri uji (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus dan Aeromonas hydrophyla). Selanjutnya mengekstrak karang lunak dan memilih bakteri patogen yang potensial memproduksi enzim protease, setelah itu penapisan ekstrak karang lunak sebagai inhibitor protease. Ekstrak karang lunak yang potensial, akan dilakukan uji untuk mengetahui konsentrasi minimum hambatannya(MIC).
Pernyataan Mengenai Skripsi dan Sumber Informasi
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi Penapisan Inhibitor Protease Dari Ekstrak Karang Lunak Asal Perairan Pulau Panggang, Kepulauan Seribu dan Potensi Daya Hambatnya Terhadap Bakteri Patogen adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal dari atau kutipan dari karya yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan dari penulis telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Bogor, Agustus 2007
PENAPISAN INHIBITOR PROTEASE DARI EKSTRAK
KARANG LUNAK ASAL PERAIRAN PULAU PANGGANG,
KEPULAUAN SERIBU DAN POTENSI DAYA HAMBATNYA
TERHADAP BAKTERI PATOGEN
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada Fakultas Perikanan dan Ilmu kelautan
Institut Pertanian Bogor
Oleh:
MUHAMMAD FIKRI
C 34103008
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
SKRIPSI
Judul Skripsi : PENAPISAN INHIBITOR PROTEASE DARI EKSTRAK KARANG LUNAK ASAL PERAIRAN PULAU PANGGANG, KEPULAUAN SERIBU DAN POTENSI DAYA HAMBATNYA TERHADAP BAKTERI PATOGEN
Nama : Muhammad Fikri
NRP : C 34103008
Menyetujui,
Pembimbing I Pembimbing II
Dr. Tati Nurhayati, S.Pi, M.Si Desniar, S.Pi, M.Si NIP. 132 149 436 NIP. 132 159 705
Mengetahui,
Dekan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Dr. Ir. Kadarwan Soewardi NIP. 130 805 031
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Palembang, pada tanggal 15 Januari 1986. Penulis adalah anak pertama dari 3 bersaudara dari Bapak Azmanuddin MY SH dan Ibu Hulmini SH. Penulis memulai jenjang formal pada pendidikan Sekolah Dasar Negeri 02 Inderalaya Kabupaten Ogan Komering Ilir, Sumatera Selatan dan lulus pada tahun 1997. Penulis melanjutkan Sekolah Menengah Pertama di SLTP Negeri 1 Inderalaya lulus pada tahun 2000, dan melanjutkan pendidikan Tingkat Menengah Atas di SMU Negeri 1 Inderalaya, Sumatera Selatan dan lulus pada tahun 2003.
Penulis masuk Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI pada tahun 2003 dan diterima sebagai mahasiswa Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan pada Program Studi Teknologi Hasil Perikanan. Selama menjalani pendidikan akademik penulis pernah mengikuti organisasi Himpunan Mahasiswa Teknologi
Hasil Perikanan pada tahun 2004/2005. Penulis juga aktif di organisasi Fisheries Diving Club-IPB (FDC-IPB) yang bergerak di bidang selam ilmiah sebagai anggota dan koordinator bidang Rumah Tangga pada tahun 2004/2005 dan koordinator bidang Publikasi dan Dokumentasi pada tahun 2005/2006. Selain itu penulis juga pernah mengadakan kegiatan Photo Exhibition “OCEANOSPHERE” pada Tahun 2006 sebagai Ketua Pelaksana dan berpartisipasi dalam kegiatan coral bleaching monitoring yang diselenggarakan oleh WWF-Indonesia di Taman Nasional Bali Barat dan sekitarnya. Dalam bidang akademik penulis juga merupakan Asisten dosen pada mata kuliah Ikhtiologi, Teknologi Pengolahan Tradisional Hasil Perikanan dan Mikrobiologi Hasil Perairan.
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan atas Kehadirat Allah SWT atas rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul
Penapisan Inhibitor Protease Dari Ekstrak Karang Lunak Asal Perairan Pulau Panggang, Kepulauan Seribu dan Potensi Daya Hambatnya Terhadap Bakteri Patogen sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
Penulis sampaikan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam menyelesaikan skripsi ini :
1. Ibu Dr. Tati Nurhayati, S.Pi, M.Si dan Ibu Desniar, S.Pi, M.Si selaku dosen pembimbing yang telah memberikan bimbingan, masukan dan saran sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.
2. Ibu Ir. Iriani Setyaningsih, MS dan Ibu Ir.Hj. Komariah Tampubolon, MS selaku dosen penguji skripsi ini.
3. Ayah, Ibu dan Adik tercinta. Terima kasih banyak atas dukungan baik moril maupun materil selama ini. Kasih sayang, cinta dan doa yang tulus dari Ayah dan Ibu mungkin tidak akan pernah terbalaskan sepanjang hidupku.
4. Keluarga besar di Lampung dan Palembang. Nenek, Adis Lia, Makwo, Pakwo (Alm), Mang Suman, Bibi Tri (Alm), Mang Aris, Mang Enda, Mang Yusri, Adis Tatik, Pak Cik Hamami, Yuk Rian, Yuk Dek, Nopan dan Elan. Terima kasih atas dukungannya selama ini.
5. Ika Puspasari. Terima Kasih atas dukungan, perhatian, kesabaran, kasih sayang, cinta dan semuanya.
6. Keluarga besar Ika Puspasari. Terima kasih atas kepercayaan yang diberikan selama ini.
7. Terima kasih kepada Indra Gunawan dan Ikhwan Dimas Permana atas persahabatan dan kerjasamanya selama ini.
9. Teman-teman THP 40 terutama Pisuko, Bangun, Aal, Ira, Angling, Lisda, Caca, Putri, Tari, Setyo, Udin, Merry, Ditya dan Riri.
10. Fisheries Diving Club (FDC), terima kasih telah mengenalkanku kepada dunia bawah laut dan juga teman-teman diklat 21 FDC atas kebersamaannya.
11. Semua pihak yang telah membantu penyelesaian skripsi ini yang tidak dapat disebutkan satu persatu.
Penulis menyadari masih terdapat kekurangan dalam penyusunan skripsi ini, namun penulis berharap skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi ilmu pengetahuan dan semoga menjadi suatu amal ibadah bagi penulis.
Bogor, Agustus 2007
DAFTAR ISI
2.1. Klasifikasi dan Morfologi Karang Lunak ... 3
2.2. Komponen Bioaktif Karang Lunak... 5
2.3. Enzim Protease... 7
2.4. Bakteri Patogen Penghasil Protease ... 9
2.5. Mekanisme Patogenitas dan Keterlibatan Protease... 11
2.6. Inhibitor Protease dari Karang Lunak ... 12
2.7. Ekstraksi... 12
2.8. Metode Ekstraksi Bioaktif Karang Lunak... 13
2.9. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) ... 14
3. METODOLOGI... 16
3.1. Waktu dan Tempat ... 16
3.2. Alat dan Bahan... 16
3.3. Metode Penelitian ... 16
3.3.1. Koleksi dan karakterisasi sampel karang lunak ... 17
3.3.2. Ekstraksi komponen bioaktif karang lunak... 17
3.3.3. Bakteri uji... 19
(1). Pembuatan media pertumbuhan bakteri uji ... 19
(a). Media luria bertani (LB) broth ... 19
(b). Media luria agar (LA) skim 2%... 20
(2). Penyegaran bakteri uji ... 20
(3). Penentuan indeks proteolitik ... 20
3.3.4. Penapisan ekstrak karang lunak ... 21
3.3.5. Minimum inhibitory concentration (MIC) ... 21
4. HASIL DAN PEMBAHASAN... 23
4.1. Koleksi dan Karakterisasi Karang Lunak ... 23
4.2. Penapisan Enzim Protease Asal Bakteri Patogen... 26
4.3. Ekstraksi komponen Inhibitor Protease dari Karang Lunak ... 27
4.4. Penapisan Potensi Inhibitor Protease pada Karang Lunak... 29
4.5. Minimum Inhibitory Concentration ( MIC ) ... 34
5. KESIMPULAN DAN SARAN... 39
5.1. Kesimpulan ... 39
5.2. Saran... 39
6. DAFTAR PUSTAKA... 40
KEPULAUAN SERIBU DAN POTENSI DAYA HAMBATNYA
TERHADAP BAKTERI PATOGEN
MUHAMMAD FIKRI
C 34103008
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
RINGKASAN
MUHAMMAD FIKRI. C34103008. Penapisan Inhibitor Protease Dari Ekstrak Karang Lunak Asal Perairan Pulau Panggang, Kepulauan Seribu dan Potensi Daya Hambatnya Terhadap Bakteri Patogen. Dibawah bimbingan TATI NURHAYATI dan DESNIAR.
Beberapa komponen bioaktif yang dihasilkan oleh karang lunak meliputi antibiotika, senyawa antitumor, antijamur dan antikanker. Selain itu, diketahui juga karang lunak sebagai penghasil senyawa inhibitor enzim salah satunya adalah inhibitor protease. Enzim protease dihasilkan secara ekstraseluler dan intraseluler oleh hewan, tanaman, maupun oleh mikroba. Enzim protease dapat terlibat dalam aktivasi protease eukariotik yang berpotensi mempunyai sifat-sifat patogenik dan secara langsung atau tidak langsung terlibat dalam patogenesis penyebab penyakit asal bakteri (seperti tifus, kolera, pnemonia), virus (seperti influenza, HIV dan SARS) dan kanker. Semakin jelasnya keterlibatan enzim protease dalam berbagai mekanisme molekular penyakit tersebut, maka dalam beberapa tahun terakhir ini perhatian terhadap protease sebagai target senyawa obat yang dihasilkan oleh organisme di alam khususnya karang lunak sebagai penghambat kerja enzim protease (inhibitor protease). Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan karang lunak yang berpotensi sebagai penghambat aktivitas kerja enzim protease (inhibitor protease) pada beberapa bakteri patogen penghasil enzim protease serta mengetahui Minimum Inhibitory Concentration (MIC) dari ekstrak karang lunak tersebut.
Penelitian ini dilakukan dalam lima tahap. Tahap pertama adalah mengkoleksi karang lunak (soft coral) dan penumbuhan bakteri uji (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus dan Aeromonas hydrophyla). Selanjutnya mengekstrak karang lunak dan memilih bakteri patogen yang potensial memproduksi enzim protease, setelah itu penapisan ekstrak karang lunak sebagai inhibitor protease. Ekstrak karang lunak yang potensial, akan dilakukan uji untuk mengetahui konsentrasi minimum hambatannya(MIC).
Pernyataan Mengenai Skripsi dan Sumber Informasi
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi Penapisan Inhibitor Protease Dari Ekstrak Karang Lunak Asal Perairan Pulau Panggang, Kepulauan Seribu dan Potensi Daya Hambatnya Terhadap Bakteri Patogen adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal dari atau kutipan dari karya yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan dari penulis telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Bogor, Agustus 2007
PENAPISAN INHIBITOR PROTEASE DARI EKSTRAK
KARANG LUNAK ASAL PERAIRAN PULAU PANGGANG,
KEPULAUAN SERIBU DAN POTENSI DAYA HAMBATNYA
TERHADAP BAKTERI PATOGEN
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada Fakultas Perikanan dan Ilmu kelautan
Institut Pertanian Bogor
Oleh:
MUHAMMAD FIKRI
C 34103008
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
SKRIPSI
Judul Skripsi : PENAPISAN INHIBITOR PROTEASE DARI EKSTRAK KARANG LUNAK ASAL PERAIRAN PULAU PANGGANG, KEPULAUAN SERIBU DAN POTENSI DAYA HAMBATNYA TERHADAP BAKTERI PATOGEN
Nama : Muhammad Fikri
NRP : C 34103008
Menyetujui,
Pembimbing I Pembimbing II
Dr. Tati Nurhayati, S.Pi, M.Si Desniar, S.Pi, M.Si NIP. 132 149 436 NIP. 132 159 705
Mengetahui,
Dekan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Dr. Ir. Kadarwan Soewardi NIP. 130 805 031
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Palembang, pada tanggal 15 Januari 1986. Penulis adalah anak pertama dari 3 bersaudara dari Bapak Azmanuddin MY SH dan Ibu Hulmini SH. Penulis memulai jenjang formal pada pendidikan Sekolah Dasar Negeri 02 Inderalaya Kabupaten Ogan Komering Ilir, Sumatera Selatan dan lulus pada tahun 1997. Penulis melanjutkan Sekolah Menengah Pertama di SLTP Negeri 1 Inderalaya lulus pada tahun 2000, dan melanjutkan pendidikan Tingkat Menengah Atas di SMU Negeri 1 Inderalaya, Sumatera Selatan dan lulus pada tahun 2003.
Penulis masuk Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI pada tahun 2003 dan diterima sebagai mahasiswa Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan pada Program Studi Teknologi Hasil Perikanan. Selama menjalani pendidikan akademik penulis pernah mengikuti organisasi Himpunan Mahasiswa Teknologi
Hasil Perikanan pada tahun 2004/2005. Penulis juga aktif di organisasi Fisheries Diving Club-IPB (FDC-IPB) yang bergerak di bidang selam ilmiah sebagai anggota dan koordinator bidang Rumah Tangga pada tahun 2004/2005 dan koordinator bidang Publikasi dan Dokumentasi pada tahun 2005/2006. Selain itu penulis juga pernah mengadakan kegiatan Photo Exhibition “OCEANOSPHERE” pada Tahun 2006 sebagai Ketua Pelaksana dan berpartisipasi dalam kegiatan coral bleaching monitoring yang diselenggarakan oleh WWF-Indonesia di Taman Nasional Bali Barat dan sekitarnya. Dalam bidang akademik penulis juga merupakan Asisten dosen pada mata kuliah Ikhtiologi, Teknologi Pengolahan Tradisional Hasil Perikanan dan Mikrobiologi Hasil Perairan.
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan atas Kehadirat Allah SWT atas rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul
Penapisan Inhibitor Protease Dari Ekstrak Karang Lunak Asal Perairan Pulau Panggang, Kepulauan Seribu dan Potensi Daya Hambatnya Terhadap Bakteri Patogen sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
Penulis sampaikan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam menyelesaikan skripsi ini :
1. Ibu Dr. Tati Nurhayati, S.Pi, M.Si dan Ibu Desniar, S.Pi, M.Si selaku dosen pembimbing yang telah memberikan bimbingan, masukan dan saran sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.
2. Ibu Ir. Iriani Setyaningsih, MS dan Ibu Ir.Hj. Komariah Tampubolon, MS selaku dosen penguji skripsi ini.
3. Ayah, Ibu dan Adik tercinta. Terima kasih banyak atas dukungan baik moril maupun materil selama ini. Kasih sayang, cinta dan doa yang tulus dari Ayah dan Ibu mungkin tidak akan pernah terbalaskan sepanjang hidupku.
4. Keluarga besar di Lampung dan Palembang. Nenek, Adis Lia, Makwo, Pakwo (Alm), Mang Suman, Bibi Tri (Alm), Mang Aris, Mang Enda, Mang Yusri, Adis Tatik, Pak Cik Hamami, Yuk Rian, Yuk Dek, Nopan dan Elan. Terima kasih atas dukungannya selama ini.
5. Ika Puspasari. Terima Kasih atas dukungan, perhatian, kesabaran, kasih sayang, cinta dan semuanya.
6. Keluarga besar Ika Puspasari. Terima kasih atas kepercayaan yang diberikan selama ini.
7. Terima kasih kepada Indra Gunawan dan Ikhwan Dimas Permana atas persahabatan dan kerjasamanya selama ini.
9. Teman-teman THP 40 terutama Pisuko, Bangun, Aal, Ira, Angling, Lisda, Caca, Putri, Tari, Setyo, Udin, Merry, Ditya dan Riri.
10. Fisheries Diving Club (FDC), terima kasih telah mengenalkanku kepada dunia bawah laut dan juga teman-teman diklat 21 FDC atas kebersamaannya.
11. Semua pihak yang telah membantu penyelesaian skripsi ini yang tidak dapat disebutkan satu persatu.
Penulis menyadari masih terdapat kekurangan dalam penyusunan skripsi ini, namun penulis berharap skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi ilmu pengetahuan dan semoga menjadi suatu amal ibadah bagi penulis.
Bogor, Agustus 2007
DAFTAR ISI
2.1. Klasifikasi dan Morfologi Karang Lunak ... 3
2.2. Komponen Bioaktif Karang Lunak... 5
2.3. Enzim Protease... 7
2.4. Bakteri Patogen Penghasil Protease ... 9
2.5. Mekanisme Patogenitas dan Keterlibatan Protease... 11
2.6. Inhibitor Protease dari Karang Lunak ... 12
2.7. Ekstraksi... 12
2.8. Metode Ekstraksi Bioaktif Karang Lunak... 13
2.9. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) ... 14
3. METODOLOGI... 16
3.1. Waktu dan Tempat ... 16
3.2. Alat dan Bahan... 16
3.3. Metode Penelitian ... 16
3.3.1. Koleksi dan karakterisasi sampel karang lunak ... 17
3.3.2. Ekstraksi komponen bioaktif karang lunak... 17
3.3.3. Bakteri uji... 19
(1). Pembuatan media pertumbuhan bakteri uji ... 19
(a). Media luria bertani (LB) broth ... 19
(b). Media luria agar (LA) skim 2%... 20
(2). Penyegaran bakteri uji ... 20
(3). Penentuan indeks proteolitik ... 20
3.3.4. Penapisan ekstrak karang lunak ... 21
3.3.5. Minimum inhibitory concentration (MIC) ... 21
4. HASIL DAN PEMBAHASAN... 23
4.1. Koleksi dan Karakterisasi Karang Lunak ... 23
4.2. Penapisan Enzim Protease Asal Bakteri Patogen... 26
4.3. Ekstraksi komponen Inhibitor Protease dari Karang Lunak ... 27
4.4. Penapisan Potensi Inhibitor Protease pada Karang Lunak... 29
4.5. Minimum Inhibitory Concentration ( MIC ) ... 34
5. KESIMPULAN DAN SARAN... 39
5.1. Kesimpulan ... 39
5.2. Saran... 39
6. DAFTAR PUSTAKA... 40
DAFTAR TABEL
Nomor Halaman
1. Jenis-jenis senyawa terpenoid pada ekstrak karang lunak ... 6
2. Contoh endoprotease dan eksoprotease ... 7
3. Beberapa pelarut organik dan sifat fisiknya ... 13
4. Persentase komponen penyusun LB dan LA skim 2% ... 19
5. Pengenceran ekstrak karang lunak dengan media LA skim 2% ... 22
6. Hasil karakterisasi karang lunak ... 23
DAFTAR GAMBAR
Nomor Halaman
1. Morfologi karang lunak (Manuputty 1996) ... 4 2. Kerja ekso dan endoprotease... 7 3. Alur ekstraksi karang lunak (Rachmaniar 1995) ... 14 4. Proses koleksi sampel karang lunak... 17 5. Alur ekstraksi karang lunak (modifikasi Quinn 1988)... 18 6. Karang lunak hasil koleksi dari perairan Pulau Panggang, Kepulauan
Seribu ... 24 7. Indeks proteolitik bakteri patogen... 27 8. Randemen total ekstraksi komponen bioaktif lima karang lunak ... 29 9. Daya hambat ekstrak karang lunak terhadap Pseudomonas aeruginosa... 30 10. Daya hambat ekstrak karang lunak terhadap Escherichia coli... 31 11. Daya hambat ekstrak karang lunak terhadap Staphylococcus aureus... 32 12. Daya hambat ekstrak karang lunak terhadap Aeromonas hydrophyli... 32 13. Daya hambat ekstrak Sarcophyton sp. terhadap protease Staphylococcus
aureus... 36 14. Daya hambat EDTA terhadap protease Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococus aureus, Escherichia coli dan Aeromonas hydrophyli... 36 15. Daya hambat ekstrak Sinularia sp. terhadap protease Staphylococcus
Aureus... 37 16. Daya hambat ekstrak Nephthea terhadap protease Pseudomonas
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor Halaman
1. Peta lokasi pengambilan sampel karang lunak... 44 2. Indeks proteolitik bakteri patogen pada media LA skim 2 % (b/v) ... 44 3. Hasil ekstraksi karang lunak ... 45 4. Zona bening yang dibentuk akibat protease bakteri uji dari ekstrak
metanol karang lunak Xenia sp. ... 46 5. Zona bening yang dibentuk akibat protease bakteri uji dari ekstrak
etil asetat karang lunak Sinularia sp. ... 46
6. Zona bening yang dibentuk akibat protease bakteri uji dari ekstrak heksan karang lunak Nephthea... 47
7. Data penapisan potensi karang lunak sebagai inhibitor protease Pseudomonas aeruginosa... 48 8. Data penapisan potensi karang lunak sebagai inhibitor protease
Escherichia coli... 49 9. Data penapisan potensi karang lunak sebagai inhibitor protease
Staphylococcus aureus... 50 10. Data penapisan potensi karang lunak sebagai inhibitor protease
Aeromonas hydrophyli... 52 11. Data MIC ekstrak karang lunak terhadap protease Staphylococcus
aureus... 54 12. Data MIC ekstrak karang lunak terhadap protease Pseudomonas
1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Karang lunak (soft coral) merupakan bagian dari ekosistem terumbu karang yang penting (Benayahu 1985) dan termasuk komponen terbesar setelah karang batu (Manuputty 1996). Karang lunak termasuk ke dalam hewan invertebrata yang hidupnya di daerah pasang surut dan di dasar perairan dengan kedalaman 200-3.000 m. Hewan ini menyukai perairan yang hangat atau sedang terutama di Indo-Pasifik (Manuputty 2002). Diantara organisme yang hidup di laut, karang lunak termasuk organisme penghasil komponen bioaktif yang terbesar. Dalam dekade terakhir, dilaporkan bahwa sebanyak 50 % senyawa bioaktif yang ditemukan dalam invertebrata laut ini bersifat toksik (Radhika 2006). Beberapa komponen bioaktif yang dihasilkan oleh karang lunak meliputi antibiotika, senyawa antitumor, antijamur dan antikanker (Manuputty 2002). Selain itu, diketahui juga karang lunak sebagai penghasil senyawa inhibitor enzim salah satunya adalah inhibitor protease (Rashid et al. 2000). Inhibitor protease
adalah senyawa yang memiliki kemampuan menghambat aktivitas enzim dengan cara mengganggu kerja sel penghasil protease (Lehninger 1993). Hambatan yang dilakukan oleh inhibitor pada umumnya disebabkan oleh terjadinya proses destruksi atau modifikasi sebuah gugus fungsi yang terdapat pada molekul enzim (Poedjiadi 1994). Sebagai contoh, karang lunak Lobophytum cristagalli menghasilkan senyawa terpena yang mampu menghambat kerja protein transferase pada penyakit kanker (Coval et al. 1996). Inhibitor enzim lainnya juga ditemukan pada karang lunak Sinularia sp. yang memiliki potensi sebagai inhibitor H,K-ATPase (Sata et al. 1998).
atau tidak langsung terlibat dalam patogenesis penyebab penyakit asal bakteri (seperti tifus, kolera, pnemonia), virus (seperti influenza, HIV dan SARS) dan kanker (Suhartono 2000). Penelitian terakhir virus SARS menunjukkan adanya peran dari enzim protease dalam mekanisme molekuler hidupnya (Anan et al. 2003). Selain itu para peneliti HIV saat ini sedang melakukan uji klinik menggunakan protease sebagai target klinis (David et al. 2006). Semakin jelasnya keterlibatan enzim protease dalam berbagai mekanisme molekular penyakit tersebut, maka dalam beberapa tahun terakhir ini perhatian terhadap protease sebagai target senyawa obat yang dihasilkan oleh organisme di alam sebagai penghambat kerja enzim protease (inhibitor protease).
Indonesia sebagai negara tropis dan mempunyai biodiversitas serta keanekaragaman hayati yang berlimpah, salah satunya adalah karang lunak. Hampir seluruh perairan indonesia memiliki karang lunak dengan tingkat keragaman yang berbeda. Kepulauan seribu merupakan gugusan pulau-pulau kecil yang terletak di laut jawa tepatnya di utara Jakarta, memiliki pulau dengan kondisi perairan yang masih baik. Salah satunya adalah pulau Panggang. Penutupan
terumbu karang di pulau ini termasuk dalam kategori sedang sampai baik (34,72-62,68 %) dengan indeks keanekaragaman berkisar antara 0,2-2,81 % (Mahaza 2003). Diharapkan dari perairan ini akan didapatkan suatu senyawa yang dapat menghambat aktivitas protease bakteri patogen.
Sebagai salah satu upaya untuk mengoptimalkan pemanfaatan bahan alam laut Indonesia, dilakukan penelitian dengan tujuan mencari jenis soft coral (karang lunak) yang potensial penghasil inhibitor protease untuk selanjutnya diisolasi dan diuji daya hambatnya terhadap protease bakteri patogen penyebab beberapa penyakit.
1.2 Tujuan
2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Klasifikasi dan Morfolologi Karang Lunak (Soft Coral)
Karang lunak dari sub-ordo Alconiina adalah hewan sangat bervariasi serta mempunyai jumlah spesies yang besar. Sub-ordo Alcyoniina terdiri dari enam famili yaitu Paralcyoniidae, Alcyoniidae, Asterospiculaiidae, Nephteidae, Nidaliidae, Xeniidae. Dua diantaranya, yaitu famili Alcyonidae dan Nephthidae mempunyai genus yang relatif banyak. Klasifikasi karang lunak sebagai berikut (Fabricius dan Alderslade 2001):
Filum : Coeloenterata Kelas : Anthozoa Sub-kelas : Octocorallia Ordo : Alcyonacea Sub-ordo : Alcyoniina
Famili : Paralcyoniidae, Alcyoniidae, Asterospiculaiidae, Nephteidae, Nidaliidae, Xeniidae
Marga : Sinularia, Sarcophyton, Xenia, Nephthea, Dendronephthya
Karang lunak (Soft coral) atau dikenal sebagai Octocorallia (Alcyonaria), hidup di daerah pasang surut terendah sampai kedalaman 200 meter. Kondisi optimal bagi kelangsungan hidup karang lunak hampir sama dengan karang batu. Hewan ini menyukai perairan yang hangat atau sedang terutama di Indo-Pasifik.
Keanekaragaman jenis karang lunak pada rataan terumbu karang umumnya rendah, persentase penutupan yang terbesar terdapat pada lereng terumbu (Manuputty 2002).
antostela merupakan dasar dari polip yang terdiri dari jaringan solenia, jaringan inilah yang menghubungkan polip satu dengan yang lainnya (Manuputty 2002).
Gambar 1. Morfologi karang lunak (Manuputty 1996)
Tubuh Alcyonaria lemah tetapi disokong oleh sejumlah besar duri-duri yang kokoh, berukuran kecil dan tersusun sedemikian rupa sehingga tubuh alcyonaria lentur dan tidak mudah putus. Duri-duri ini mengandung kalsium karbonat yang disebut spikula. Komponen ini memegang peranan penting dalam mengidientifikasi karang lunak. Karang lunak terlihat seperti tumbuhan karena bentuk koloninya yang bercabang-cabang seperti pohon dan melekat pada substrat yang keras (Bayer 1956).
Koloni Octocorallia umumnya memiliki warna-warna yang sangat indah. Warna ini disebabkan oleh sejumlah Zooxanthellae yang hidup di dalam jaringan
Zooxanthellae adalah genus Alcyonium, Lithophyton, Lobophytum, Sarcophyton, Sinularia, Capnella, Cladiella, Lemnalia, Paralemnalia, sedangkan pada genus Dendronephthya, Stereopnephthya dan Umbellulufera tidak ditemukan Zooxanthellae (Sorokin 1989).
Karang lunak diketahui berkembang biak dengan tiga cara, yaitu fertilisasi internal, yaitu telur yang dibuahi tetap tinggal pada permukaan tubuh, fertilisasi eksternal, yaitu terjadi diluar tubuh dimana larva yang terbentuk memiliki silia atau bulu getar, kemudian berenang bebas mencari tempat perlekatan berupa substrat dasar yang keras untuk selanjutnya tumbuh menjadi polip atau koloni baru dan reproduksi secara aseksual yaitu peleburan atau pertumbuhan koloni dan fragmentasi (Manuputty 2002).
2.2 Komponen Bioaktif Karang lunak
Karang lunak merupakan sumber yang kaya akan senyawa kimia, seperti terpenoid, steroid, steroid glykosida, racun lipoid dan bahan bioaktif. Senyawa kimia ini dihasilkan secara alamiah melalui proses metabolisme tubuh. Dalam dekade terakhir, dilaporkan bahwa sebanyak 50 % senyawa bioaktif ditemukan
dalam invertebrata laut ini bersifat toksik (Radhika 2006). Beberapa komponen bioaktif yang dihasilkan oleh karang lunak meliputi antibiotika, senyawa antitumor, antijamur dan antikanker (Manuputty 2002). Selain itu juga diketahui bahwa karang lunak menghasilkan senyawa antineoplastik, HIV-inhibitory (Rashid et al. 2000) dan anti-inflammatory (Radhika 2006).
Salah satu senyawa yang paling banyak ditemukan pada karang lunak adalah terpena. Senyawa terpena merupakan suatu kelompok senyawa kimia dari golongan hidrokarbon isometrik yang mempunyai rumus molekul C10H16. Senyawa ini umumnya ditemukan dalam minyak astiri dari tumbuhan yang berbau harum, seperti eucalyptus, pinus, damar dan sebagainya. Senyawa ini digunakan dalam industri farmasi terutama dalam pembuatan obat-obat antibiotik, antijamur dan antitumor. Secara alamiah senyawa terpena digunakan oleh karang lunak itu sendiri sebagai penangkal terhadap serangan predator, dalam hal memperebutkan ruang lingkup, dan dalam proses reproduksi (Manuputty 2002).
lunak Sinularia flexibilis setelah difraksinasi dengan TLC menghasilkan 5 komponen terpenoid yaitu diterpena fleksiibilida, dihidrofleksiibilida, sinulariolida, episinulariolida dan episinularilida asetat yang terbukti memiliki aktivitas antimikrobial (Aceret et al. 1997). Sinularia erecta merupakan jenis karang lunak yang dilaporkan memiliki komponen bioaktif dengan nama sinularektin yang termasuk ke dalam kelas cembrana turunan terpenoid (Rudi et al. 2006). Selain itu marga Clediella dilaporkan mampu menghasilkan 55 jenis metabolit sekunder yang dapat dimanfaatkan sebagai antifungal, sitotoksik dan antibakteri (Radhika 2006). Xenia umbellata menghasilkan bioaktif dengan nama xenibellal yang bersifat sitotoksik terhadap sel P-388 dengan konsentrasi 3.2 µg/mL (El-Gamal et al. 2005). Beberapa senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh karang lunak disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Jenis-jenis senyawa terpenoid pada ekstrak karang lunak
Nama senyawa Jenis Karang Lunak Literatur
2.3 Enzim Protease
Protease dikelompokkan berdasarkan tiga kriteria utama, yaitu berdasarkan letak pemecahan ikatan peptida, lingkungan daya kerja dan sifat kimia sisi aktif. Dilihat dari letak pemecahan ikatan peptida, protease dibedakan menjadi eksoprotease dan endoprotease. Eksoprotease menguraikan protein dari ujung rantai sehingga dihasilkan satu asam amino dan sisa peptida yang kemudian akan menghasilkan sejumlah asam amino. Golongan endoprotease menguraikan ikatan peptida pada bagian dalam rantai protein, sehingga dihasilkan peptida dan polipeptida (Gambar 2). Oleh karena itu, kebanyakan endoprotease hanya akan menghasilkan asam amino bebas dalam jumlah terbatas (Suhartono 1992). Beberapa contoh endoprotease dan eksoprotease diperlihatkan pada Tabel 2.
Gambar 2. Kerja ekso dan endoprotease
Tabel 2. Contoh endoprotease dan eksoprotease
Jenis enzim Contoh
Khimotripsin Tripsin Trombin
Plasmin Elastase Subtilisin
Papain Bromelin Endoprotease
Termolisin Amino peptidase Eksoprotease
Ditinjau dari lingkungan daya kerja, protease dapat digolongkan menjadi protease asam, netral dan alkali. Protease asam bekerja pada pH asam, seperti enzim pepsin yang diperoleh dari lambung sapi, renin mikroba dihasilkan oleh Mucor miehei. Protease netral bekerja pada pH netral, seperti enzim papain yang dihasilkan dari getah pepaya, enzim bromelin yang dihasilkan dari nenas dan protease bakteri yang diperoleh dari Bacilus subtilis, sedangkan protease alkali bekerja pada pH basa (Suhartono 1992).
Berdasarkan sifat kimia dari sisi aktif dikenal empat golongan protease, yaitu protease serin, protease aspartat, protease sistein dan metaloprotease. Protein serin dicirikan dengan adanya residu serin pada sisi aktifnya. Enzim ini banyak terdapat pada archaea, eukariot dan virus serta aktif pada pH 7 dan 11 contoh protease serin adalah tripsin, khimotripsin, elastase, subtilisin dan proteinase (Walsh 2002). Aktivitas enzim protease serin dihambat oleh diisopropil-fluorofosfat (DFP), 3,4-dikhloroisokoumarin (3,4-DCL), L-3-karboksitrans 2,3-epoksipropil-leusilamido (E.6,4), fenilmetilsulfonilflourida (PMSF) dan tosil-L-lisin khlorometil keton (TLCK) (Rao et al. 1998).
Protease aspartat merupakan nama yang dianjurkan untuk group protease asam yang memiliki residu asam aspartat pada sisi katalitiknya. Sebagian besar memiliki aktivitas maksimum pada pH 3 dan 4. Enzim ini dapat dihambat oleh DFP, EDTA dan p-khloromerkuribenzoat (pCMB). Protease sistein (thiol) tersebar luas yang dicirikan dengan adanya residu sistein dan histidin pada sisi aktifnya yang merupakan bentuk katalitik esensial untuk aktivitas biologinya. Contoh protease sistein adalah papain, ficin dan bromelin. Enzim ini dapat dihambat oleh senyawa pCMB tetapi tidak terpengaruh oleh PMSF atau senyawa pengikat logam (Walsh 2002). Metaloprotease adalah protease yang aktivitasnya tergantung pada adanya logam. Logam-logam yang mengaktifkan enzim ini adalah magnesium (Mg), seng (Zn), kobalt (Co), besi (Fe), merkuri (Hg), kadmium (Cd), tembaga (Cu) dan nikel (Ni). Sebagian besar aktif pada pH netral sampai alkali. Contoh metaloprotease adalah elastase, kolagenase dan termolisin. Enzim ini dapat dihambat dengan EDTA (etilen diamin tetratacetic acid) (Suhartono 1992).
2.4 Bakteri Patogen Penghasil Protease
Bakteri penghasil protease adalah bakteri yang mampu memproduksi enzim protease ekstraseluler, yaitu enzim pemecah protein yang diproduksi di dalam sel kemudian dilepaskan keluar sel. Tidak semua bakteri memiliki kemampuan menghasilkan enzim protease, bakteri yang memproduksi enzim protease jika ditumbuhkan pada media yang mengandung substrat protein, maka akan mengeluarkan enzim disekeliling koloninya dan akan menghidrolisis substrat yang ditandai dengan adanya zona bening disekitar koloninya. Bakteri patogen penghasil protease antara lain Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, dan Aeromonas hydrophyla.
Escherichia coli merupakan bakteri gram negatif yang bersifat anaerob fakultatif. Bakteri ini ada yang bersifat motil bergerak dengan flagella peritrik, dan ada juga yang nonmotil. Berbentuk batang tunggal dan berpasangan dengan ukuran 1,1-1,5 µm x 2,0-6,0 µm, diameter koloni 2-3 µm, memiliki kapsul dan mikrokapsul. Bakteri ini mampu memfermentasi laktosa pada media Eosin Methylene Blue (EMB) menghasilkan koloni berwarna gelap dengan kilap logam (Suwandi 1999). Bakteri ini dibagi ke dalam empat kategori berdasarkan kepada sindrom klinik, perbedaan interaksi dengan mukosa usus, perbedaan dalam epidemilogi, serta jarak serogroup O-H, yaitu Enteropathogenic E. coli (EPEC),
Enteroinvasive E. coli (EIEC), Enterotoxigenic E. coli (ETEC) dan Enterohemorragic E. coli (EHEC) (Doyle dan Padhye 1994).
Enteropathogenic E. coli (EPEC) yang diisolasi dari penderita diare menghasilkan protease serin yang aktivitasnya berkorelasi dengan tingkat infeksi yang ditimbulkan. Protease ini mampu mendegradasi protein musin (Budiarti dan Suhartono 1999) Enteropathogenic E. coli K1.1 menghasilkan protease jenis serin-metaloprotease. Protease tersebut mempunyai berat molekul 42 kD dan mempunyai kemampuan untuk mendegradasi musin menjadi komponen yang lebih kecil (Waturangi 1999).
dengan warna kuning keemasan dan mediapun berubah menjadi kuning (Suwandi 1999). Staphylococcus aureus menghasilkan protease ekstraseluler jenis metaloprotease yang bersifat toksin dan merupakan salah satu bakteri patogen yang berpotensi mengkontaminasi makanan, seperti daging dan produk-produk ikan, susu. Selain itu dapat menyebabkan luka infeksi/peradangan pada kulit yang luka. Methisilline resistant Staphylococcus aureus merupakan salah satu bakteri patogen yang resisten terhadap segala macam antibiotik dan dianggap sebagai bakteri paling berbahaya karena dapat menurunkan sistem ketahanan tubuh manusia (Yulindo 2003).
Pseudomonas aeruginosa bersifat gram negatif, berbentuk batang lurus dan tidak membentuk spora, berukuran kecil dengan lebar 0,5-1,0 µm dan 1,5-4,0 µm. Termasuk ke dalam bakteri aerob obligat dan oksidase positif. Bakteri ini membutuhkan aw 0,96-0,98, pH optimum 6,6-7,0 dan suhu 37 oC untuk pertumbuhannya (Banwart 1989). Bakteri ini dapat diuji dengan media Cetrimide Agar Medium (CAM) yang menghasilkan warna kehijauan pada media. Pseudomonas aeruginosa bersifat patogen dan sering menimbulkan kerusakan pada berbagai produk pangan (Fardiaz 1992). Sifat patogenik yang ditimbulkan dengan cara menginfeksi inang dengan memproduksi metaloprotease ekstraseluler, elastase dan alkalin protease. Bakteri ini dapat ditemukan di dalam air, tanah, sayuran, telur, daging ‘curing’, daging segar, ikan, udang, kerang dan susu (Fields 1979).
2.5 Mekanisme Patogenitas dan Keterlibatan Protease
Patogenitas merupakan kemampuan dari suatu bakteri untuk menginfeksi
atau menyebabkan infeksi. Faktor-faktor patogenitas adalah faktor invasi sel inang, peleketan, toksin, enzim, faktor antifagosit, patogenitas intrasel dan keanekaragaman antigen (Jawetz et al. 1996).
Banyak spesies bakteri menghasilkan enzim yang berperan dalam proses patogenitas, salah satunya enzim protease yang mendegradasi komponen matrik ekstraseluler sehingga merusak struktur jaringan inang. Enzim protease yang dihasilkan oleh mikroorganisme terlibat di dalam mekanisme penyebab penyakit pada manusia, hewan maupun tumbuhan baik secara langsung maupun tidak langsung (Suhartono 2000). Enzim ini juga digunakan oleh bakteri untuk memperoleh sumber karbon dan energi dengan menghancurkan polimer inang menjadi gula sederhana dan asam amino (Salyers dan Whitt 1994).
Bakteri yang terkenal penyebab penyakit adalah EPEC (Escherichia coli enteropatogenik) yang menyebabkan penyakit diare, penyakit ini banyak terdapat di negara-negara berkembang dan biasanya menyerang anak-anak. Hasil penelitian menunjukkan bahwa EPEC mensekresi protease serin yang mampu
mendegeradasi musin (Budiarti dan Suhartono 1999). Bakteri Pseudomonas aeruginosa bersifat patogen yang menyebabkan penyakit
pneumonitis dengan mensekresi metalloprotease zinc netral ( Hase dan Finkelstein 1993).
Staphylococcus menyebabkan penyakit melalui kemampuannya berkembangbiak dan menyebar luas dalam jaringan dan melalui pembentukan berbagai zat ekstraseluler, zat tersebut berupa metalloprotease yang bersifat toksik. Bakteri lain yang memproduksi protease penyebab penyakit adalah Clostridium yang menghasilkan metaloprotease ekstraseluler bersifat toksik dan merupakan faktor virulensi ( Hase dan Finkelstein 1993).
enzim protease dalam mekanisme molekuler hidupnya berupa protein M yang biasa ditulis Mpro (Anan et al. 2003).
2.6 Inhibitor Protease dari Karang Lunak
Kunitz dan Northrop (1936) pertama kali mengisolasi inhibitor protease dari pankreas sapi dan mengkristalisasikannya. Sejak saat itu berbagai penelitian menunjukkan adanya potensi inhibitor di alam secara luas tersebar baik pada tumbuhan, hewan, fungi, actinomycetes dan beberapa jenis bakteri yang mampu memproduksi inhibitor.
Coval et el. (1996) berhasil mengidentifikasi senyawa terpen dari jenis Lobophytum cristagalli yang berpotensi sebagai inhibitor dari fernesyl protein transferase (FPT) yang berasosiasi pada sel kanker. Enzim FPT ini dilepaskan oleh sel kanker untuk mendegradasi protein yang akan digunakan untuk meregulasi sel induk. Hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa diterpena dari karang lunak mampu berkompetisi dengan FPT untuk mendapatkan substrat, sehingga kinerja dari enzim FPT dapat terhambat. Senyawa inhibitor FPT ini sangat potensial untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker.
Selain itu, sumber lain menyatakan bahwa karang lunak Lobophytum mampu memproduksi senyawa turunan terpen yang berpotensi sebagai HIV- protease inhibitor yang dapat menghambat kinerja protease dari virus HIV (Rashid et al. 2000).
2.7 Ekstraksi
Ekstraksi merupakan suatu metode pemisahan yang didasarkan pada distribusi zat terlarut dengan perbandingan tertentu antara dua pelarut yang tidak saling bercampur. Faktor-faktor yang berpengaruh terhadap proses ekstraksi adalah lama ekstraksi, suhu, dan jenis pelarut yang digunakan. Dalam pemilihan jenis pelarut yang digunakan harus memperhatikan daya melarutkan, titik didih, sifat toksik, mudah tidaknya terbakar dan sifat korosif terhadap peralatan ekstraksi (Khopkar 2003).
melarutkan senyawa organik, pelarut air akan melarutkan senyawa anorganik (Achmadi 1992). Tabel 3 menunjukkan beberapa jenis pelarut dan sifat-sifatnya.
Proses ekstraksi terdiri dari beberapa tahap, yaitu penghancuran bahan, penimbangan, perendaman dengan pelarut, penyaringan dan tahap pemisahan. Penghancuran bertujuan agar dapat mempermudah pengadukan dan kontak bahan dengan pelarutnya pada saat proses perendaman. Kemudian bahan ditimbang untuk mengetahui berat awal bahan sehingga dapat menentukan rendemen yang dihasilkan. Bahan yang telah ditimbang kemudian direndam dalam pelarut, seperti heksana (non polar), etil asetat (semi polar), dan metanol (polar). Proses perendaman ini disebut dengan maserasi. Prinsip pelarutan yang dipakai pada metode ini adalah like dissolve like artinya pelarut polar akan melarutkan senyawa polar dan pelarut non polar akan melarutkan senyawa non polar. Tahap selanjutnya, yaitu tahap pemisahan yang terdiri dari penyaringan dan evaporasi. Penyaringan dilakukan untuk memisahkan sampel dengan pelarut yang telah mengandung bahan aktif. Untuk memisahkan pelarut dengan senyawa bioaktif yang terikat dilakukan evaporasi, sehingga pelarutnya akan menguap dan diperoleh senyawa hasil ekstraksi yang dihasilkan (Khopkar 2003).
Tabel 3. Beberapa pelarut organik dan sifat fisiknya
Pelarut Titik didih (oC) Titik beku (oC) Konstanta dielektrik
Sumber : Nur dan Adijuwana (1989)
2.8 Metode Ekstraksi Bioaktif Karang lunak
belum diketahui jenisnya) menggunakan metanol 80 % (v/v) untuk mengekstrak komponen bioaktifnya. Alur ekstraksi karang lunak disajikan pada Gambar 3.
Soft coral segar (25 g) dipotong kecil-kecil
Ekstrak kasar (diblender)
Maserasi dengan metanol 80 % (v/v) (35 ml ; 24 jam)
Ekstrak disaring dengan kertas saring (milipore)
Ekstrak disimpan dalam lemari pendingin
Gambar 3. Alur ekstraksi karang lunak (Rachmaniar 1995)
2.9 Minimum Inhibitory Concentration
Minimum inhibitory concentration (MIC) merupakan metode pengujian yang dilakukan secara in vitro untuk mengetahui konsentrasi minimum dari suatu zat untuk dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme lebih dari 99 % (Andrews 2001). Suatu zat dapat dikatakan mempunyai aktivitas yang tinggi terhadap mikroba apabila dengan konsentrasi yang rendah tetapi mempunyai daya hambat yang besar.
Metode difusi agar menggunakan sejumlah paper disc steril yang telah diisi zat antibakteri dengan konsenterasi berbeda, lalu diletakkan di atas permukaan agar yang telah mengandung bakteri dan diinkubasi selama waktu tertentu. Zat antimikroba akan terdifusi dari paper disc menuju agar dan menimbulkan suatu gradien konsentrasi disekelilingnya atau terlihat zona penghambatan. Aktivitas bakteri ditentukan dengan mengukur diameter hambatannya, yaitu daerah bening yang terbentuk disekitar kertas (Schlegel dan Schmidt 1994).
3. METODOLOGI
3.1. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November 2006 sampai dengan April 2007, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Institut Pertanian Bogor.
3.2. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah cool box, timbangan analitik (Precisa tipe XT 120A), freezer, freeze dryer (Yamato), autoclave (Yamato SM52), shaker bath (Yamato BT:25), inkubator (Thermolyne tipe 4200), alat-alat gelas, cawan petri, bunsen, jarum ose, pipet mikro (Pipetman), pipet volumetrik, Global Positioning System (Garmin GPS 60) Spektrofotometer, alat selam SCUBA DIVING dan kamera underwater (OLYMPUS C7070WZ).
Bahan-bahan yang digunakan adalah karang lunak yang dikoleksi dari Pulau Panggang, Kepulauan Seribu. Bakteri uji yang digunakan antara lain Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus dan Aeromonas hydrophyla. Bahan-bahan kimia yang digunakan antara lain akuades, alkohol 70 %, metanol (teknis), etil asetat (teknis), heksana (teknis), spirtus, EDTA (Merck), Buffer Tris-HCl 0,2 M pH 8. Media penapisan menggunakan Luria agar dengan skim 2 % (b/v) dan Luria Bertani (LB) Broth. Komposisi media tercantum pada Tabel 4.
3.3. Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam lima tahap. (1) mengkoleksi karang lunak (soft coral) menggunakan peralatan menyelam (Gambar 4) serta mengidentifikasinya, (2) mengekstrak karang lunak, (3) menumbuhkan dan memilih bakteri patogen yang potensial memproduksi enzim protease, (4) penapisan ekstrak karang lunak sebagai inhibitor protease dan (5) ekstrak karang lunak yang potensial sebagai inhibitor protease dan memiliki daya hambat
3.3.1. Koleksi dan karakterisasi sampel karang lunak
Sampel karang lunak dikoleksi dari perairan pulau Panggang, Kepulauan Seribu sebanyak 5 jenis dan diambil pada kedalaman berbeda (2-14 m). Pengambilan sampel dilakukan dengan memotong bagian tubuh karang lunak, lalu dimasukkan kedalam plastik, kemudian dibawa ke permukaan air secara perlahan. Sampel disimpan dalam media pelarut metanol hingga terendam, kemudian ditransportasikan dalam keadaan dingin menggunakan cool box. Karang lunak mempunyai morfologi dan warna seperti yang dituliskan oleh Manuputty (2002).
Gambar 4. Proses koleksi sampel karang lunak
3.3.2. Ekstraksi komponen bioaktif karang lunak
Ekstraksi komponen bioaktif pada karang lunak menggunakan metode Quinn (1988) diacu dalam Kusumadewi (2004). Pelarut yang digunakan dalam ekstraksi yaitu heksana, etil asetat dan metanol. Perbandingan antara sampel dan masing-masing pelarut adalah 1: 3.
Sampel karang lunak disiapkan sebanyak 100 gram, kemudian dipotong kecil-kecil lalu diblender dan ditambahkan pelarut sebanyak 300 ml. Ekstraksi pertama menggunakan pelarut metanol, dengan waktu maserasi 24 jam, tujuannya agar komponen bioaktif pada karang lunak terlarut dalam pelarut. Hasil maserasi disaring menggunakan kertas saring hingga diperoleh ampas dan filtrat yang diinginkan. Ampas sisa ekstraksi metanol dimaserasi kembali menggunakan etil asetat sebanyak 300 ml selama 24 jam, sedangkan filtratnya dievaporasi hingga
dimaserasi selama 24 jam, sedangkan filtrat hasil ekstraksi etil asetat dievaporasi hingga pelarut dan ekstrak terpisah. Hasil maserasi heksana kemudian disaring dan filtratnya dievaporasi. Apabila ekstrak dalam bentuk cairan, maka dilakukan pengeringan beku (freeze dryer). Alur ekstraksi karang lunak dapat dilihat pada Gambar 5.
Sampel
Maserasi 24 jam dengan metanol
Filtrat1
Evaporasi
Ekstrak1
Maserasi 24 jam dengan etil asetat
Filtrasi Residu filtrasi
Residu Filtrat 2
Maserasi 24 jam dengan heksana Evaporasi
Filtrasi
Residu Filtrat
Ekstrak 2
Evaporasi
Ekstrak3
Serbuk ekstrak karang lunak ditimbang untuk mengetahui rendemen yang didapatkan dengan rumus :
Rendemen (b/b) = 100%
Bakteri yang digunakan pada penelitian ini adalah bakteri patogen penghasil protease, yaitu Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus dan Aeromonas hydrophyla.
(1). Pembuatan media pertumbuhan
Media pertumbuhan dibuat bertujuan untuk sebagai tempat bakteri, media yang dibuat harus sesuai dengan standar nutrisi yang dibutuhkan oleh bakteri sehingga pertumbuhannya baik. Penelitian ini menggunakan media Luria Bertani (LB) Broth dalam bentuk cair dan luria agar (LA) dengan skim 2 % (b/v) padat
dengan komposisi seperti disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4. Persentase komponen penyusun LB dan LA skim 2%
Bahan Media LB (ml) Media LA (ml)
(a). Media luria bertani (LB) broth
(b). Media luria agar (LA) skim 2 %
Sebanyak 0,5 gram ekstrak khamir, 1 gram NaCl, 1 gram tryptone dan 3,5 % (b/v) agar dimasukkan ke dalam erlenmeyer, kemudian ditambahkan akuades sampai tanda tera 70 ml, lalu dihomogenkan (media agar). Sedangkan untuk skim, sebanyak 2 gram skim dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan akuades sampai menunjukkan tanda tera 30 ml, kemudian dihomogenkan. Secara terpisah, media agar dan skim disterilisasi (suhu 121 oC selama 15 menit). Selanjutnya didinginkan hingga suhu 40 oC, kemudian kedua media tersebut dicampurkan hingga homogen.
(2). Penyegaran bakteri uji
Penyegaran bakteri bertujuan untuk meregulasi pertumbuhan sel bakteri pada media yang baru sehingga diperoleh isolat bakteri dengan kondisi pertumbuhan yang optimum. Bakteri uji yang akan disegarkan diambil satu ose, lalu digoreskan pada media agar miring yang baru lalu diinkubasi selama 24 jam.
(3). Penentuan indeks proteolitik (modifikasi Febrian 2004)
Tujuan uji ini adalah untuk mendapatkan bakteri yang potensial
menghasilkan enzim protease. Uji ini dilakukan dengan cara penapisan menggunakan media Luria Agar (LA) skim 2 % (b/v). Cawan petri disiapkan dan diberi tanda untuk memisahkan atau membatasi penapisan setiap bakteri dengan membuat garis diagonal sehingga terdapat empat kuadran. Sebanyak 10 ml media LA skim 2 % (b/v) dituangkan ke dalam cawan petri, lalu didiamkan hingga beku. Masing-masing bakteri uji ditotolkan pada media menggunakan tusuk gigi yang terlebih dahulu telah disterilisasi. Media diinkubasi selama 24 jam hingga terbentuk zona bening.
Zona bening yang terbentuk menunjukkan aktivitas protease dari masing-masing bakteri uji yang mampu mendegradasi skim dalam media LA. Diameter zona bening diukur dengan jangka sorong, kemudian dihitung indeks proteolitik masing-masing bakteri.
Indeks Proteolitik (IP) =
3.3.4. Penapisan inhibitor protease dari ekstrak karang lunak
Media yang digunakan untuk penapisan ini adalah LA skim 2 % (b/v). Penapisan ini berfungsi untuk mendapatkan ekstrak karang lunak yang potensial sebagai inhibitor protease.
Ekstrak masing-masing dari jenis karang lunak yang berbeda dilarutkan kembali dengan pelarutnya, yaitu metanol, etil asetat dan heksana dengan konsentrasi 10 %(b/v). Selanjutnya sebanyak 200 µl larutan tersebut ditambahkan ke dalam cawan petri, kemudian dicampur dengan 10 ml LA skim 2 % dan digoyang-goyang hingga ekstrak tercampur merata, lalu media didiamkan hingga beku. Untuk kontrol digunakan pelarutnya, yaitu metanol, etil asetat dan heksana sebanyak 200 µl dicampur dengan LA skim 2 %.
Sebanyak satu ose bakteri patogen ditusukkan ke dalam media. Setiap cawan ditusukkan 4 jenis bakteri uji secara duplo, lalu di inkubasi selama 24 jam dengan suhu 37 oC.
Pengamatan dilakukan dengan mengukur diameter zona bening yang dihasilkan oleh masing-masing bakteri uji. Untuk menghitung potensi daya
hambat dari masing-masing ekstrak digunakan rumus :
Potensi Daya Hambat = 1 x100%
IPe : Indeks proteolitik bakteri uji pada media
mengandung ekstrak
IPk : Indeks proteolitik bakteri uji pada media kontrol
Ekstrak karang lunak yang memiliki potensi penghambatan lebih dari 50 % dilanjutkan untuk pengujian minimum inhibitory concentration (MIC).
3.3.5. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) (modifikasi Parish dan Davidson 1993)
density) menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 620 nm. Prekultur ini dilakukan untuk mendapatkan bakteri uji dengan nilai OD = 0,5. Selanjutnya masing-masing ekstrak karang lunak diencerkan dengan pelarutnya (b/v), sebagai kontrol negatif digunakan pelarutnya dan kontrol positif digunakan EDTA yang dilarutkan dalam buffer Tris-HCl 0,2 M, pH 8. Pengenceran ekstrak karang lunak dengan LA skim 2 % disajikan pada Tabel 5.
Setiap cawan diisi dengan 10 ml media LA skim 2 % dengan suhu ±40 oC, kemudian 200 µl larutan ekstrak karang lunak dan larutan EDTA dari tiap-tiap konsentrasi dimasukkan ke dalam cawan. Campuran media digoyang-goyang hingga homogen, lalu didiamkan hingga membeku. Setelah membeku setiap cawan dibuat sumur dengan diameter 6 mm sebanyak 4 buah. Suspensi bakteri prekultur dengan nilai OD=0,5 dipipet sebanyak 2 µl ke dalam sumur, lalu diinkubasi media selama 24 jam dengan suhu 37 oC, kemudian dihitung aktivitas penghambatan protease. Nilai MIC diperoleh dengan menentukan konsentrasi minimum yang mampu menghambat aktivitas protease bakteri patogen lebih
dari 99 %.
Tabel 5. Pengenceran ekstrak karang lunak dengan media LA skim 2%
Ekstrak karang lunak (%)
Konsentrasi ekstrak karang lunak dalam
media agar (%)
EDTA (%) Konsentrasi EDTA dalam media agar (%) Kontrol (pelarut) 0 Kontrol (Buffer
Tris-HCL 0,2 M pH 8) 0 Catatan : konsentrasi ekstrak disesuaikan dengan daya hambat yang diperoleh
3.3.6. Analisis Data
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Koleksi dan Karakterisasi Karang Lunak
Pada penelitian ini, karang lunak dikoleksi dari perairan Pulau Panggang, Kepulauan Seribu pada kedalaman 2-14 m. Perairan Pulau Panggang merupakan lokasi yang masih cukup baik, hal ini dikarenakan oleh penutupan terumbu karang termasuk dalam kategori sedang sampai baik (34,72-62,68 %) dengan indeks keanekaragaman berkisar antara 0,2-2,81 % (Mahaza 2003). Peta lokasi disajikan pada Lampiran 1.
Karang lunak yang diperoleh disimpan dalam media pelarut metanol hingga terendam, kemudian ditransportasikan dalam keadaan dingin. Ada lima jenis karang lunak yang diperoleh, yaitu Sarcophyton sp., Sinularia sp., Nephthea, Xenia sp. dan Dendronephthya. Kelima jenis karang lunak dapat dilihat pada Gambar 6. Karang lunak diidentifikasi berdasarkan bentuk morfologi dan warna (Manuputty 2002). Hasil identifikasi karang lunak disajikan pada Tabel 6.
Tabel 6. Hasil karakterisasi karang lunak
Jenis karang
lunak Polip
Bentuk pertumbuhan
Bentuk
kapitalum Warna Penyebaran
Sarcophyton sp. Autosoid Seperti jamur Melebar seperti jamur
Krem keabuan
<15 m
Sinularia sp. Autosoid Merambat (encrusting)
Xenia sp. Sifonosoid Merambat dimana
Foto bawah air Nephthea (2 m) Foto atas air Nephthea
Foto bawah air Sarcophyton sp. (2 m) Foto atas air Sarcophyton sp.
Foto bawah air Sinularia sp. (3 m) Foto atas air Sinularia sp.
Foto bawah air Xenia sp. (2 m) Foto atas air Xenia sp.
Foto bawah air Dendronephthya (14 m) Foto atas air Dendronephthya
Sarcophyton sp. merupakan karang lunak dari famili Alcyoniidae (Verseveldt 1983 diacu dalam Manuputty 2002). Karang lunak jenis ini biasanya berukuran besar, mempunyai tangkai berwarna putih atau senada dengan kapitulum. Kapitulum melebar seperti jamur atau bundar dengan bagian tepi berlekuk atau melipat, permukaan halus seperti beludru, jumlah polip autosoid lebih banyak. Koloni yang masih muda dan baru tumbuh berbentuk jamur. Warna koloni krem atau krem keabuan. Penyebaran karang lunak ini dari rataan terumbu sampai kedalaman 15 meter dengan konsentrasi pada kedalaman 3-10 meter.
Sinularia sp. termasuk ke dalam famili Alcyoniidae (Verseveldt 1983 diacu dalam Manuputty 2002). Koloninya bertangkai atau merambat (encrusting). Kapitulum lebar, lobata pada yang merambat, yang bertangkai digitata, aboresen atau glomerata. Polip monomorfik yaitu tidak memiliki sifonosoid, dan retraktil. Warna koloni krem, coklat muda atau abu-abu. Penyebaran karang lunak ini dari rataan terumbu sampai kedalaman 20 meter. Anggota dari marga Sinularia sangat banyak sehingga untuk membedakan jenis yang satu dengan lainnya tidak cukup hanya dengan ciri-ciri morfologinya saja. Untuk itu harus dibedakan dari bentuk sklerit atau spikulanya.
Nephthea merupakan karang lunak yang termasuk ke dalam famili
Neptheidae (Verseveldt 1977 diacu dalam Manuputty, 2002). Koloninya berbentuk pohon atau semak (arboresen), lunak dan dinding koloni berbentuk kanal-kanal yang tersusun memanjang, tipis dan gampang sobek, bertangkai dengan kapitulum lobata atau glomerata. Polip non retraktil, tersusun berkelompok pada ujung lobus, mengandung spikula yang tersusun rapi berfungsi sebagai penyokong tubuh. Tangkai berwarna abu-abu sampai putih, lobus krem, abu-abu atau coklat. Penyebaran karang lunak ini dari rataan terumbu sampai kedalaman 10 meter.
masing-masing jenis mempunyai warna tersendiri sehingga memberikan kesan indah.
Warna koloni merah, kuning, oranye, ungu tua, ungu muda dan putih. Umumnya ditemukan di tempat yang agak dalam di kedalaman di bawah 10 meter
dan terlindung di balik bongkahan karang (Bayer 1956; Verseveldt 1977 diacu dalam Manuputty 2002).
Xenia sp. merupakan karang lunak yang termasuk ke dalam famili Xeniidae (Bayer 1956; Verseveldt 1977 diacu dalam Manuputty 2002). Memiliki koloni yang kecil, tangkai pendek dan kolumnar, umbellata dengan percabangan yang jarang. Polip lebih besar dari Alcyonacea lainnya, non retraktil
dan monomorfik. Tentakel memiliki deretan duri (pinnula) di bagian tepinya. Masing-masing polip tersusun rapi pada kapitulum dan bila ditemukan percabangan atau polip yang rapat, permukaan atas kapitulum masih tetap nampak. Warna koloni abu-abu, krem sampai coklat muda, ditemukan dari rataan terumbu sampai kedalaman 10 meter.
4.2. Penapisan Enzim Protease Asal Bakteri Patogen
Bakteri yang tergolong ke dalam penghasil protease adalah bakteri yang memproduksi enzim protease ekstraseluler, yaitu enzim pemecah protein yang di produksi di dalam sel kemudian dilepaskan ke luar sel (Suhartono 1992). Penapisan enzim protease asal bakteri patogen ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri patogen dalam memproduksi enzim protease secara ekstraseluler atau yang biasa disebut indeks proteolitik. Nilai dari suatu indeks
proteolitik diperoleh dari diameter zona bening yang terbentuk.
Indeks proteolitik yang dihasilkan oleh empat jenis bakteri dapat dilihat pada Gambar 7 dan Lampiran 2.
Ket : A= Escherichia coli C= Pseudomonas aeroginosa
B= Staphylococus aureus D= Aeromonas hydrophyla
Gambar 7. Indeks proteolitik bakteri patogen
Enzim protease dihasilkan secara ekstraseluler untuk menghidrolisis nutrisi protein menjadi peptida dan amino yang terdapat di dalam media LA skim 2 % yang ditandai dengan adanya zona bening. Hidrolisis protein ini berperan dalam reduksi proses metabolisme, mekanisme patogenesis, germinasi spora dan proses biologi lainnya ( Ward 1985 diacu dalam Febrian 2004). Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan hasil bahwa Pseudomonas aeruginosa memiliki kemampuan tertinggi untuk menghasilkan enzim protease dengan indeks proteolitik sebesar 4,7 (Baehaki 2004). Protease yang dihasilkan oleh bakteri ini adalah metaloprotease ekstraseluler, elastase dan alkalin protease, semakin tinggi jenis protease yang dihasilkan maka berkorelasi dengan tingkat patogenitasnya (Hase dan Finkelstein 1993).
4.3. Ekstraksi Komponen Inhibitor Protease dari Karang Lunak
bertujuan untuk mengekstrak komponen bioaktif dalam karang lunak sesuai dengan tingkat kepolarannya sehingga zat aktif dapat diekstrak secara optimal pada salah satu pelarut yang digunakan.
Proses ekstraksi terdiri dari beberapa tahap, yaitu penghancuran bahan, penimbangan, perendaman dengan pelarut, penyaringan dan pemisahan bahan aktif dari pelarutnya. Penghancuran sampel dalam tahap ekstraksi bertujuan untuk mempermudah komponen-komponen bioaktif terekstrak di dalam pelarut. Prinsip pelarutan yang dipakai pada metode ini adalah like dissolve like artinya pelarut polar akan melarutkan senyawa polar dan pelarut non polar akan melarutkan senyawa non polar (Khopkar 2003). Selanjutnya dilakukan maserasi dengan tujuan agar terjadi tumbukan antara partikel yang dapat memperbesar kemungkinan pengikatan dan pemecahan sel sehingga komponen bioaktif dapat keluar dari jaringan dan larut didalam pelarut.
Tahap selanjutnya adalah pemisahan dengan penyaringan dan evaporasi. Penyaringan dilakukan untuk memisahkan sampel karang lunak dengan pelarut yang telah mengandung komponen aktif, sedangkan evaporasi bertujuan untuk
memisahkan bahan aktif dengan pelarutnya dengan cara menguapkan pelarutnya dalam keadan vakum. Suhu yang digunakan berkisar antara 30-40 oC, karena suhu yang terlalu tinggi dapat menyebabkan kerusakan senyawa aktif sampel (Harborne 1984).
Hasil ekstraksi karang lunak Sarcophyton sp., Sinularia sp., Nephthea, Xenia sp. dan Dendronephthya dengan perbandingan sampel karang lunak dan volume pelarut yaitu 1:3 didapatkan rendemen hasil ekstraksi dengan pelarut metanol (9,6762 %) lebih besar dibanding pelarut etil asetat (3,5682 %) dan heksan (0,6375 %) (Lampiran 3). Hal ini menunjukkan bahwa komponen-komponen pembentuk karang lunak tersebut cenderung larut pada pelarut metanol. Metanol termasuk ke dalam golongan alkohol yang memiliki berat molekul (BM) rendah, sehingga memudahkan pembentukan ikatan hidrogen dengan molekul air dalam jaringan sampel (Hart 1987). Selain itu pelarut ini mampu mengekstrak senyawa organik, sebagian lemak serta tanin, akibatnya
Berdasarkan Gambar 8 dan Lampiran 3 diketahui bahwa nilai rendemen yang tertinggi diperoleh dari ekstrak karang lunak jenis Sarcophyton sp. sebesar 4,0421 %. Tingginya rendemen yang dihasilkan disebabkan oleh besarnya komponen polar, semi polar dan non polar yang terkandung pada karang lunak Sarcophyton sp. yang terlarut didalam pelarutnya, sedangkan rendemen yang terkecil diperoleh dari ektrak karang lunak jenis Dendronephthya sebesar 0,8776 %. Rendahnya rendemen ini diduga karena pada proses pengkoleksian sebagian cairan yang merupakan penyokong tubuh karang lunak Dendronephthya (Fabricius dan Alderslade 2001) keluar akibat proses pemotongan. Cairan yang keluar tersebut diduga mengandung sebagian besar komponen zat aktif yang terdapat pada karang lunak sehingga pada saat ekstraksi, hanya sedikit zat aktif yang terekstrak.
Sarcophyton sp Sinularia sp Nephthea Xenia sp Dendronephthya
Karang Lunak
Gambar 8. Rendemen total ekstraksi komponen bioaktif lima karang lunak.
4.4. Penapisan Potensi Inhibitor Protease pada Karang Lunak
Penapisan ini bertujuan untuk mengetahui jenis karang lunak yang
berpotensi sebagai inhibitor protease. Ekstrak karang lunak yang didapat dari
proses ekstraksi dilarutkan kembali dengan pelarutnya, kemudian ditambahkan ke
dalam media LA skim 2 %. Ekstrak karang lunak ini berfungsi sebagai inhibitor
protease terhadap bakteri patogen, sedangkan bakteri yang digunakan adalah
bakteri yang memiliki kemampuan untuk menghasilkan enzim protease, yaitu
Escherichia coli, Staphylococus aureus, Pseudomonas aeruginosa dan
Aeromonas hydrophyla. Dengan adanya ekstrak dari karang lunak tersebut maka
ditandai dengan mengecilnya atau tidak terbentuknya areal bening di sekeliling koloni.
Hasil percobaan penapisan ekstrak dari lima jenis karang lunak terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa diperoleh dengan daya hambat ekstrak karang lunak berkisar antara 1,39–50,83 % untuk ekstrak metanol, pada ekstrak etil asetat berkisar antara 1,63–8,81 % dan pada pada ekstrak heksana berkisar antara 2,47–22,70 %. Potensi daya hambat terbesar terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa dimiliki oleh ekstrak metanol dari karang lunak jenis Nephthea, yaitu sebesar 50,83 %, sedangkan ekstrak karang lunak jenis Sinularia sp. dan Dendronephthya secara berturut-turut, yaitu 42,3 % dan 29,35 %. Ekstrak karang lunak dengan pelarut etil asetat memiliki daya hambat terbesar, yaitu pada karang lunak Sinularia sp. dan Xenia sp. sebesar 8,81 % dan 8,24 %, sedangkan daya hambat ekstrak dengan pelarut heksana yang terbesar yaitu pada karang lunak jenis Xenia sp. dan Sinularia sp. sebesar 22,7 % dan 21,85 % (Gambar 9).
1.39
42.32 50.83
18.73
29.35
1.632.47 8.81 3.93 8.24 4.40
21.85 19.10 22.70
Sarcophyton sp Sinularia sp Nephthea Xenia sp Dendronephthya
D
Gambar 9. Daya hambat ekstrak karang lunak terhadap Pseudomonas aeruginosa
karang lunak dengan pelarut etil asetat memiliki daya hambat terbesar juga pada Dendronephthya sebesar 23,70 % di ikuti oleh Nephthea dan Sinularia sp. sebesar 22,26 % dan 19,95 %, sedangkan daya hambat ekstrak dengan pelarut heksana yang terbesar, yaitu pada karang lunak jenis Nephthea sebesar 4,53 %
Sarcophyton sp Sinularia sp Nephthea Xenia sp Dendronephthya
D
Gambar 10. Daya hambat ekstrak karang lunak terhadap Escherichia coli
Hasil penapisan ekstrak dari lima jenis karang lunak terhadap bakteri
Staphylococus aureus didapatkan daya hambat ekstrak karang lunak berkisar antara 30,99–100 %. Untuk ekstrak dengan pelarut metanol, sedangkan
untuk ekstrak karang lunak dengan pelarut etil asetat dan heksana masing-masing berkisar antara 1,03–45,21 % dan 6,07–16,88 %. Ekstrak karang lunak dengan pelarut metanol dari jenis Sinularia sp. dan Sarcophyton sp. memiliki daya hambat yang sempurna terhadap protease bakteri Staphylococus aureus sebesar 100 %, diikuti oleh ekstrak karang lunak jenis Xenia sp. sebesar 62,41 %. Ekstrak dengan pelarut etil asetat memiliki daya hambat terbesar pada karang lunak Nephthea dan Sarcophyton sp. sebesar 45,05 % dan 45,21 %, sedangkan daya hambat ekstrak dengan pelarut heksana yang terbesar yaitu pada karang lunak Sinularia sp. sebesar 16,88 %. (Gambar 11).
13,68–29,17 %, sedangkan untuk ekstrak karang lunak dengan pelarut heksana potensi daya hambatnya berkisar antara 5,06–22,14 %. Ekstrak dengan pelarut metanol dari karang lunak Sarcophyton sp. dan Dendronephthya mempunyai potensi daya hambat terbesar, yaitu sebesar 23,59 % dan 20,98 %. Pada ekstrak karang lunak dengan pelarut etil asetat memiliki daya hambat terbesar, yaitu pada karang lunak Sinularia sp. sebesar 29,17 % diikuti oleh ekstrak Dendronephthya sebesar 27,04 %, sedangkan daya hambat ekstrak dengan pelarut heksana yang terbesar yaitu pada karang lunak Xenia sp. yaitu sebesar 22,14 % (Gambar 12). Foto hasil penapisan ekstrak karang lunak disajikan pada Lampiran 4, 5 dan 6.
Sarcophyton sp Sinularia sp Nephthea Xenia sp Dendronephthya
D
Gambar 11. Daya hambat ekstrak karang lunak terhadap Staphylococus aureus
23.59
Sarcophyton sp Sinularia sp Nephthea Xenia sp Dendronephthya
D
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak karang lunak mampu menghambat sempurna bakteri gram positif, seperti pada jenis Sinularia sp. dan Sarcophyton sp. yang memiliki daya hambat sempurna terhadap protease bakteri Staphylococus aureus sebesar 100 %, diikuti oleh ekstrak karang lunak jenis Xenia sp. sebesar 62,41 %. Hal ini karena bakteri Staphylococus aureus menghasilkan protease jenis serin (Baehaki 2004), enzim ini disekresikan dalam bentuk zimogen (tidak aktif) dan diaktifkan melalui mekanisme proteolisis terhadap substrat, diduga ekstrak karang lunak mampu berikatan dengan substrat sehingga menghambat proteolisis dan produksi enzim protease. Sementara itu karang lunak Nephthea mampu menghambat protease bakteri gram negatif (Pseudomonas aeruginosa) yang memiliki beberapa lapisan sel berupa struktur lipopolisakarida yang berikatan silang dengan protein dan mampu memproduksi beberapa jenis protease seperti metaloprotease ekstraseluler, elastase dan alkalin protease (Hase dan Finkelstein 1993). Hal ini diduga karena komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak karang lunak Nephthea mampu berkompetisi dengan substrat yang berupa protein (Coval et al. 1996), sehingga membentuk kompleks
enzim-inhibitor (EI). Dengan demikian terjadi persaingan antara inhibitor dengan substrat terhadap bagian aktif enzim (Poedjiadi 1994). Akibat dari kompleks enzim-inhibitor ini menyebabkan terhambatnya produksi enzim ekstraseluler yang ditandai dengan mengecilnya zona bening disekeliling koloni.
