Kajian mengenai penggunaan Ko-Kultur sel epitel tuba fallopi dan hasil supernatanya terhadap keerhasilan maturasi Oosit dan perkembangan Embrio pada Monyet Ekor panjang (Macaca fasciculris)

LAPORAN PE8ELZTIAIV

IIIBAH BERSATNG lW2 PERGURUAN TINGCI TABUN ANGGARAN 2002

-4. Judu! : Kajian Mengenai Yenggunaan KO-kultur Sel Epitei 'fuba Fallopii dan Hasil Supernatannya Terhadap KeberhasiIaa Maturasi Oosit dan Perkembangan Embrio

pada

;lionyet

Ekor

Panjang (.Uncaca fnscicu inris)

B. Ketua Yeneliti

Narna : Ur.drh. T u e Lac~;arrii k'usuf, MS

Jenis Keiair. ~n : Perempuan

PangkaKrolongan~NW : Fernbindl Vbi 130522396

Bidang Keahlian : Reproduksi He\van

Pusat Studi : Pusat Studi Satwa Primata

Perguruan Tinggi : lnstitut Pertnnian Bogor

C. Anggota Pencliti

5u Nailla

+ Bidwng KeahIian FakdtasfJurusan Perguruan T h g i -

I Dondin Saiutlli KdoLLeran Prirnua;Bmbirnia F~IPr3-1'SSP/Blokirnia lnstitut Pertanian Bogor

2 .%rid ~oedionu EmbrioIogiKultur Jarinsan FKHI.4natomi lnslitur Pcrtarliar~ ~ o g o r 3 11n.m Supriatna Pembekuan dan Tranyfer FKHmeprcdukG dan Institul Ptnabian Bogor

ErnSrio Krbidnnarz

4 1 Kerut Suatba Biologi R~produksi FKH-PSSP lztilut Dertanian R o ~ o r

I). Peodaaaan dan Jangka Waktu Penelitiarr

Jangka Wakru penel itran yang

diusulkan

: 3 tahun

Biaya yang diusulkan : Rp.103.455.850,-

Biaya yang

disetujui bhun2002: Rp. 3 5 000.000,-

Bogw, I8 Oktober 2002

RINGKASAN

tiAJl.47'4 MERGENAJ PENGGUNAAN KO-KULTC'R SEL EPITEL TUBA FALLOPIi

D A N KASIL

SUPEKNATANNYA T E M A D A P KEBE'RHASmAN MATURASI OOSIT DAN PERKEMk4RGAN EMBRIO PADA MOWYET EKOR PANJANC ( Macaca fascicularis).

(Yusuf T.L., Sajuthi D., Brrediono A., Supriatna I., Suatha IK., 2002,

IX

+ 10 halaman)

Untuk meningkatkan produksi ernbrio hasil teknologi ftailisssi

in

vitro (FIV)

yang pada saat ini dinilai masih rendah, perlu dilakukan upay a pengembangan teknik ko-

ku!tur. Teknik ku!tur sel ads!ah s ~ z k ~ cara tmtuk rnz~biakkan se! secara rn vitrn dalam !ingkungan yang terkontrol ( Freshney, 1987). Kultur sel epitel tuba Falopii ini sudah

banyak ditel iti untuk mernpelajari biolog sel tuba Falopii, mem pelajari proses kapasitasi

spermarozoa, mcnunjang proses

fertilisasi

irz v i m

(FN),

maupun untuk meinpertahankan

perkembangan embrio (Godke, 1992). Narnun ko-kultur pada monyet ekor panjang

beluin pernah dilaporkan.

Tujuan yang ingin dicapai pada penelitian ini adalah untuk menguasai teknik

isolasi, kultur dan pernbekuan seI epitel tuba fa1 lopii pada monyet ekor panjang (Macucu

fi~~~cic~tkuris), dan untuk ~nemproduksi biakan sei tuba fallopi i sebagai ko-kultur serta

pembuatan kultur jaringan epitel tuba Falopii untuk penelit~an di bidang kesehatan

regrcrduksi satwa primata maupun rnanusia.

Manfaat y ang diharapkan dari hasil peneli tian ini adalah meningkatkan produksi

ein brio baik kuantitas maupun kualitasnya melalui penambahan ko-kul tur sel tuba fallopii

pada medium yang digunakan dalm program FIVdan menyediakan Siakan

sel

tuba

fallopii un tuk kebutuhan Iaimya terutama berhubungan dengan kesehatan satwa

priinata'manusia, serta pengembangan teknik kultur untuk digunakan sebagai model pada sativa primata Iiiinnya temasuk Mtwa yang terancarn punah.

Penelitian dilakukan 6i hboratorium Mikrobiolog &r! Tmundogi

PSSF

LP-IPB, pada bulan Maret sampai Oktober 2002. Organ tuba Falopii dikoleksi dari monyet betina

sccara bedah laparotomi di Fasilitas Karantina Hewan PSSP LP-PB. Fenelitian ini rneliputi persiapan bahan dan aIat ymg digunakan, pengambilan organ tuba Faicpii,

proses ~ m b u a t a n kultur sel primer epitel ruba Falopii dan pasase menggunakan ~ p s i n 0,25%, pe~nbekuar! sel dan pencairan kembali sel (~hawlng).

Med~um penumbuh yang dibanakar.: adnlah DMEM yang telah di tambah NaHCO, dan Fe,ul Bovine Scrrrrn (FBS) 1Q04. Kultur sel epitel tuba Falopii ini kemudian

memben tuk sel apis sel (monolayer). Seielah dipasase, sebagian sel disimpan dan dibekukan dalam DMSO 10% pada suhu -70°C dan setelah 24 jam dipindahkan kc srrhu - 196" C (dalam Nitrogen cair

;.

-I~~uR(

y~qa~ ueorlaud sped uaq~un8fp wd~p qnmn ISE~ q~Lueq qlqal IUI las mlpy uoqqmquraut

yoiun usyumes!a -ley$u!ua\it Llyatu %urA uuqnqlunuad ehrp uduap k q asesed r~dm~s as~wdrp - IrsgqJaq - I U I 13s Jnqny '$3 u ~ p 3 , ~ 5 nyns ~psd !scqnyur!p

usp %0 1 UBIYE~MEJ?~ ZUEA N~NQ UBYEU~%U~UI u~3uap ~nqnq~p IrsEqJaq

~rdop~

. . aqnl ~alrda !as e q v q ueqlndur!s!p ru! IL~~E deqw w!l!qauad psey pus

-1qlyas wepn u ~ p '111puas u e y y q l p UE~E S u ~ i ue8uu~C 'utry~unfi~p %ueA mqn_y

wpam u~p wqsq 'rreqvr1n3r p SUFI;. I ~ V - 1 ~ 1 ~ jl~p Iwwaq led~p rsvu!ure)uo)i -13s snqnq ue~enqruad u~3uap uelleyiq Buei qeleselu riles qelas w y dmau~ . ~seul . umluo3

-asmd d~yas ~ped leyZu!uau~ u! yeru 3 u ~ i y nqrun) urmduieuraq ueqqr~ Cunuau

Co-culture Productions of Epithelial Celts Derived from Oviduct of Cynomolgus for Improving Oocyte Maturation aad Early Embryo Development Fertitised I n

Vitro

(Yusuf T.L., Sajuthi

D.,

Boediono A,, Supriatna L, Suatha

DL,

2001,

X

+

11 pp)

To raising the lack production

of

embryos by fertilised in vjtro, w e need to develop co-culture technique which can produce cell by in vitro. There were morc

research had been done with epithelial cells to study

biology

and capacitation

of

sperm to

support in vitro fertil~zation and maintaining the developing of embryo. Althoug the

result oU study in cynornolgus macaque never be reported yet.

- _{M a ~ n objectives of t h s study are: to master in isolation, culture and frcczing}

technicque of oviductal epithelial cells and to produce cell lor co-culture

in

macaque and other species. The expected benefit the result of this study to increase the quality and

quantity of c m b q o production, failitation celIs for other research related to human and

enirnal hedrh and as

an

animal models for endangered species.

This work were conducted at Microbiology and Imvnunology laboratorium from March until1 October 22002. Collection of oviduct organ from cynomdgus macaque was hcld in Quaranitine Facility Primates Research Center Bogor Agricultural University. This

work include inaterial and toll preparation, primary culture passaged with tqpsine 0,25%, Sizezing and thawing cells.

Medium for growth cell are Dulbecco's Mod~fied Eagle Media (D-MEM) with NaliCO3 and F e d Bovine Serum (FBS)

lP/o.

'Freezing with DMSO 10% il - 7 0 ' ~ overnight

nd

in liquid nitrogen for long time- ~ n x j r n a q culturz the amount of cells is

decrease because a lot of cells cannot adaptation Gth new environment or dead due to collection process

that

we

do.

After passaged, hrsh

cell

growth more high

and

higher

then others. Contamination is onc of the number of problem in cuIture cell production,

due to aseptic material medla and air.

Based on this finding we concluded that oviducta1 epit helial cells S U C W S S ~ U I I ~

cultured with DMEM with NaKCO: and FBS 10% in incubator 3 7 0 ~ and 5% CO?. We

suggested that cell cultured more and more for firther research.

And based on other work, we concluded that supernatan of epithelial cells

KATA PENGANTAR

Ilmu pengetahuan dan teknobgi (iptek) memegang peranan yang penting dan

sangat menentukan &lam mencapai kzmajuan

dan

perceptan pentbangunan.

Keberhasilan peinbangunan jangka panjang sangat tergantung dari kuaiitas surnber daya manusia Indonesia tennasuk kemampuan mengadopsi dm mengernbangkan iptek serta

kemampuan mananfaa~kan teknologi dan biotehologi yang &an menentukan

breunggulan k o r n ~ r a t i f dan kompoteti f dari sistem produhi.

Sdah satu tanta~igan yang terpanparlg di depan adalah peningkatan penggunaan sahva primata sebzgai hewan model untuk kepentingan biorneds pada manusla sepedi pengujian obat, pernbuatan vaksin polio serta unhrk riset p y a k i t PJDS menyebabkan

penunman populasi dan berkurangnga popuIasi harus diimbangi dengan upaya untuk

rnenjaga kelestariannya. Salah satu upayanya adalah dengan menerapkan dan

mengembangkan teknoiob dart bioteknologi reproduksi sepzrti fertiiisasi in vitro (FIV),

untuk memperoleh embrio yang lebih banyak dibandingkan dsngan produksi embrio secara in vivo yang jumlahya smgat tertratas. Dengan teknik FlV dirnungkinkan

pengembangan biteknologi reproduksi yang lainnya.

Salati satu tel:nik yang rnzndukung keberhasilan program bioteknologi reproduksi adzla11 tek~lik pembuatan kul tur janngan atau Lultur sel yang dibizkkan diluar tubuh

sebagai ko-kultur.

SeI

ep itzi tuba Failopi i sering chgunakan sebagar ko-kultur unt uk

mernbantu lnaturasi dan perkernhangan embrio karena sekresi yang dihasilkannya dapat rnemberikan Iingkungan yang opt~inum bagi penyatuan Furnet jantan dan bctina serta

perkembangan embno di ni. Lingkungan ter sebut berupa penyediaan makanan dan

pertindungan bag spermatozoa, sel telur dan embriv dini.

Yembiakan sel epitel tuba Fallopii secara in vitro memungkinkan ~ n y e d i a a n dan

produksi embrio daIm jumlah banyak serta r n e n ~ k r i

kernudahzn-kernudahan

dalam kcgatan man~pulzsi cmbrio dan rckayasa gcnetik untuk v n g c m b a ~ g a n hiotelmologi

reprduksi yang sangat berman faat bagi pcngembangblakan hewan p d a urnumnya &in

temak pada khususn) a.

Hasil ynelitian ini jclya akan ~ n e ~ b e r i k a n informasi ilrniah untuk penelitian serupa pada satwa pri~nata sehingga penmbahan populasi satwa primata langka dan yang terancarn

punah dapat diterapkan dengan menggunakan teknik FIV pa& rnanusia.

Laporan hasil ~ n e l i t i a n ini rnerupakan kegiatan yang diIaLxkan pada rahun

pe-ca~s dan kedua dari rangkaian penelitian yang hrencanakan selama tiga tahun. Dari

has11 pcnelitian bhun pertama kesimpdan yang dapat dikemukakan b a h w sel epitel tuba Fa!iopii rnonyet ekor w j a n g berhasii dikultur dalarn media DMEAM dengan FBS 10% pada suhu 37% dan 5% C02 dan berhasil dipasase sampai pasase keernpar serta &pat

disimpan dengan cara dibekukan. Dari hasil peneiitian tahun kedua kesimpularl yang

Sehubuncgan dengan pelaksanaan penelitian ini, patut diucapkan terirna kasih k epada Pimpinan Proyek Peningkatan Yeneli tian dan Pengabdi an Pada Msyaiakat, rekorat Jcnderal Pendidikan Tinggi, beserta stat; Ketua Lembaga Peneli tian IPB k s e r t r l staf dan KepaIa Pusat Studi Sahva Primata (PSSP) LP-IPB. Ucapan terimakasih

luga disampai kan kcpada Kepal a Laboratorium Mihbio~ogilErnunoIogi PSSP [PI3 kserta staf

dan

Kepala Karantina Hewan PSSP-LP IPB beserta staf. Untuk kolega Drh.

IAah Pratitvi, .Drh.Suzy.

T,

Drh

Pcasodjo

dan

Drh Nyon~an W yang telah banyak rncmbantn dalam kolcksi organ tuba Fallopii dan ovarim dan Shilrni

M

van3 telah

hany ak ~nembantu dalam pelaksanaan kuItur sel, tim peneliti mengucapkan terima a s i h . Dern~kian pula diucapkan terima kasih kepada Dr. Maria Diarnente, Drh.

Diah

I ,kandriati &in Drh. Nengah budiarsa yang telah mengjtnkan dm memberi kan dukunpn renuh umtuk pengembangan iptck dan simber daya n~ailusia, ssf~a selumh staf yang

klah ban yak rne~nbantu &lam pelaksanaan penelitian ini.

Snaru penelitian yang barn selesaj dikerjakan, merupahn awal bagi peneljtian

hinnya . PeneIitian tidak pernah akan berakhir, dan selalu menimbulkan banyak lay

~lcrtanyaan yang memerlukan jawwban melahi penelitian Ian,iutarqa. Begitu juga

~ a e l i t i a n ini

masih

memerlukan kaji ulang agar mendaptkin

hasil

kornperatif

yang

Halaman

. .

LEM BAR IDEN'I'ITAS DAN PENGESAHAN --- 11

. . .

K

INGKASAN DAN SL'MMAR Y --- 111

KATA PENGANTAR ---

- - -

--I----- vi

.

. . DAFTAR IS1 ---

-

----

VIl1 D.9FTAR TABEL --- -*---*---+-- ix

DAFTAR GAMBAR

---

---

----

X I. P E m A H m U A N ---

-

--- - 1

Il. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN TAHUN KE 2

---

I 11 TIN JAUAN PUSTAKA

-

---

--

---

--- 2

3. I . Teknolog~ KwKultur --- 2

3.2. Isolasi.dan Biakan Sel Tuba Faltopii

---

-

7

Lr 3.3. KoIeksi Sel Tuba Falopii

--

--- 3

3.4. Penggunaan Media--

--

---

-

- w e - - 3

3.5. KO-ku ltur

---

--- 4

3.6. Pembekuan Biakan Sel

-

--

---

4

3.7. Penyiapan Spermatozoa dan Fertilisasi Sel Telur --- 5

I

v

METODE PEELITIAN

---

---

6

4.1. Materi dan Hewan Percobaan

---

---

6

4.2. Persiapan Media yang Digunakan --- 6

Sterjilsasi

---

-

--- --- 6

Medium TCM ] 99 ---+--- 6

Medium D m M ---

---

7

Medl Pen;rmbuh --+--- ---

---

---

--

7

Medium Transport ---

---

7

4 - 3 . Isolasi Szl Epitel Tuba FaIIopii --- 7

4.3.1. Pengambilan Organ Tuba FalIopii

---

---

---

7

4.3.2. Fernbaitan Kultur Sel Primer Epitel Tuba Fallopii

----

7

4.3.3. P m s e Kulm SeI - - - + - - -

---

. . 8

4.4. Pernbekuan Sei 5~lre: Tuba Fal lop:^ ---

---

8

4.5.

Y

encairan Kembalr (7. hawing) ---. 8

4.6. Koleksi Sel Telur

---

-- ---+

---

9

4 7. Pematanpap Sq] Tclur

----

---

-

--- ----

-

9

J 8, Periyiapan Spermatozoa ---+---- ..--- . . . 10

4 3, Ie-ertljlsasl In ---

-

---

----

---

---

10 [image:7.847.56.483.64.573.2]

DAFTAR 1SI

Halam an . .

LEMBAR IDENTITAS DAN PENGESAHAN --- 11

RlNGKASAN DAN SCMMARY --- . ₁₁₁ . .

KATA PENGANTAR - - -

---

vi

. . . D m A R ISf

-

- - - --- V l l l D.4FTAR TABEL --- --- ix

DAFTAR CAMBAR - - - -

--

--- x

I. P E m M U L U A N --- - - . - - - 1

11. TUJUAN

DAN

MANFAAT PENE LlTIAN TAIiUN KE 2 --- 1

11 1, TINJAUAN PUSTAKA

-

---

-

---

-

---

----

---

2

3.1 . Teknologi KO-Kultur

--

--

--+-+---- 2

3.2. Isolasi-dm Biakan Sel Tuba Fallopii

---

7

L. 3.3. Koleksi Sel Tuba Falopii

-

--- - 3

3.4. Penggunaan Media-

---

-

---

---

3

3.5. Ko-kultur ---

---

4

3.6. Pemkkuan Biakan Sel

- - -

----

4

3.7. Penyiapan Spermatozoa dan Fertilisasi Sel Telur

---

5

j V. METODE PEmLIT[AN ---

---

---

--

--- ₆

4.1. Materi dan Hewan Percobam --- 6

4.2. Persiapan Media yang Digunakan --- . - . 6 Sten\!sasl --- ₆

Medium TCM 99 - - - - - - --- 6

Medium DMEM --- 7

Medium Pen;lmbh

---

----

-

- - -

-

--- ₇

M d l u m Transport --- 7

4.3. isolasi St1 Epitel Tuba Fallopii

-

----

-

---+---

-

---

--

7

4.3. I . Pengambilan Organ Tuba Fallopii

---

7

4.3.2. Pembuatan Kultur Sel Primer Epitel Tuba Fallopi i

---

7

4.3.3. Fasase Kultur Sel-

---

-

8

4.4. Pembekuaa Sei Zplze; Tuba Fallopi I

-

---.

--- 8

4 . 5 . Pencairan Kern bal i ('I hawin21

---

8

4.6. Koleksi Sel Telur --- --- 9

4.7. Pematangan Sel *Tclur ---- ---

-

--- -- ₉

4 8, Perlylapan Spermatozoa --- . . . 10

4.g. Fcrtlllsasl irltro ---- ---- - -- -- -- --- --- - -- lo

[image:8.842.60.496.96.615.2]

_ _ I - - - _ _ _ _ _ _ ---

---

a

p 0 3 w

---- --- ---- snsnyy umfn_t

---- '

---

VAAW~NV~F~S NtrlLI?ZNZId VNV3NS'tl JIA

---+---+--- _mJEs 'Z.9 +---*--- ---- uelndmrsay - 1.9

--*--- ---+---

NVWS NVQ NV'lndNISElX 'IA

--- _{m!al 133 I"l[!trad '8'5}

---

~n

!a

las u&uw~u~aj -L-S

- ---- --A ---- !sel~oladns u ~ 2 u a ~ . .q

----

---

-

--

----

_{~w~mo~adns due~ -e}

---+---*- .> ---

-'"la1 1% !s)l=loY Y 5

-_l_d_II________-___Id- 11dol1e~ Eqnl la~!da !as 301s menquad - 5 ' ~

---

u q a u d n g

pw1e3 uelndwmSuad 'p'g

+---+---*---+---+----

~&?as

[as

mqny - ~ ' 5

------I-------

-.-1_3_--_

-----

13s

J"ll"y

'Z'S

---+---r---f----_-_--

!!d~l[%I qn_t lal!d3 (35 !*\OS\ -1.5

+-_ll----*--r-f-d---+--k--_L_-_----_CI

I C--- laqda [as rmltq yruun ue~un31p Such

Hma

qnqrunuad mn~pa~q

.E

OZ--- sr~s~n~r~scj e ~ m ~ y 11soa !sles!g!uaj uep ~se;nl~m '!sya~oq ~npaso~d

61--- I!dolled eqnl pqda las uenyaqu~ad uvp

irub4

'~nl~ny !selos! mpasojd _{- I}

ueqdmey

Nomor

D A m A R GAMBAR

Teks

I . Pertumbuhan

biakan

sel tuba Fdlopii

-

-

--

---

2. Spermatozoa monyet e kor panjang

h a i l

aspirasi epididimis

---

I

I 3. Sel telur monyei e k o ~ panjang pada stadium inti,

GV

---

---

4. Sel teIw mmyet ekor panjang pa& stn?iuln M. I,

GVBD

-

---

5 . %I telur monyet ekor panjang yang matang,

stadium

M-LI

,

PB I

---

PENDAHULUAN

Monyet ekor panjang serlng digunakan sebaga i hewan model untuk kepentingan biorl~edis pada manusia s~perti percobaan pengujian obat, pembuatan vaksin poiio dan

pada satkva primata lainnya untuk riset pen yakit AIDS. Peningkatan penggunaan satwva primata menyebabkan p e n m a n populasi dan berkurangriya populasi hams diimbangi dengan upaya untuk &pat menjaga kelestariannya.

Salah satu upaya yang sangat penting untuk menjaga kelelestanan satwa prirnata adalah dengan penerapan bioteknologi reproduksi seperti fertilisasi in vitro (FIV). untuk memperoleh embrio yang lebi h banyak di bandingkan dengan produksi embrio secara in

vivo yang jumlahnya sangat terbatas. Dengan tekm

k

FIV dirnungk~nkan pengembangan

bioteknologi reproduksi yang lainnya. Salah satu t e h k yang mendukung keberhasilan program biteknololog~ reprduksi adalah teknik pembuatan kuitur jaringan atau kultur sel yang akan menghasilkan sekelompk sel yang dihiakkan dil uar tubuh yaitu ko-kultur.

Sel-ss! epitel tuba Fallopi I szri ng digunakan sebagai ko-hultur unruk nlernbanru rnaturas~ ban perkembangan embrio karena sekresi yang dihasi lkannya dapat memberi lingkungan yang optimum bagi penyatuan garnet jantan dan betina serta perkerr bangan

embno dini. Lingkungan tersebut berupa penyediaan makanan dan perlindungan b a a

sFnnatoroa, sel telur dan embrio dini.

Pembiakan dan kultur sel-sel epitel tuba secara in vill-u ~nernungkinkan

penyediaan dan produksi embrio &lam jum !ah banyak serta member1 kemudahan- kemudahan dalam Iiegiatan manipulasi embrio dan rekayasa genetik untuk

pengembangan bioteknologi reproduksi yang sangat bennanfaat bagi pengembangbiakan hewcn pada umumnya dan ternak pada khususnya.

ELasil penelitian ini juga akan memberikan banyak intbrmasi il~niah untuk

penel itian serupa pada satwa primata sehingga penambahan populasi s m v a primata

langka dan sahva yang terancam punah dapat diterapkan dengan rneriggunakan teknik

FIV pada manusia.

II.TUJUAN DAN MANFAAT PENELITTIAN TAHUN

JCl3

2

Ped? tabu9 kedua iui pcnrlltiitn bert'~jual~ vntuk mznpkaji basil yang diperclleh pada

penelitian tahun pertama sebagai kelanl utan dari serangkaian peneliiim yang mempunyal tujuan untuk: ( I ) rnendapatkan tehik pembuatan biakan set eprtel tuba Fallopii dengan menumbubkan sel-cet tersebut dalam medium khusus dalam inkubator C02, (2).

Mempe~ ~ l e h sekresi sel epitel tuba Falopii yang dapat digunakan untuk perkembangan

sel telur dan embric dm (3) mendapatkan teknik pembekuan kultur sel tuba Falopii dan

supernatannya.

Manfaat yang diharapkan dari hasil penelitian ini adalah : ( ! ) meningkatkan produksi

embrio baik kuantitas maupun kditasnya melalui pcnarnhahan ko-kultur sel tuba fallopii pada medium yang digunakan daIarn propm FIV, ( 2 ) menyedsakan biakan sel tuba