DETEKSI DAN PENENTUAN SEROTIPE VIRUS DENGUE TIPE 4
DARI NYAMUK AEDES AEGYPTI DENGAN MENGGUNAKAN
METODE REVERSE TRANSCRIPTASE-POLYMERASE CHAIN
REACTION (RT-PCR) DI KOTA MEDAN
TESIS
Oleh
ANDI MULIA TJAHJASARI 067027001/KT
SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
DETEKSI DAN PENENTUAN SEROTIPE VIRUS DENGUE TIPE 4
DARI NYAMUK AEDES AEGYPTI DENGAN MENGGUNAKAN
METODE REVERSE TRANSCRIPTASE-POLYMERASE CHAIN
REACTION (RT-PCR) DI KOTA MEDAN
TESIS
Untuk Memperoleh Gelar Magister Kedokteran Tropis dalam
Program Studi Ilmu Kedokteran Tropis pada Sekolah Pascasarjana
Universitas Sumatera Utara
Oleh
ANDI MULIA TJAHJASARI 067027001/KT
SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
ABSTRAK
Infeksi oleh virus Dengue (DENV) masih tetap menjadi masalah kesehatan yang serius di banyak daerah tropis dan subtropis di dunia. Penyakit yang ditimbulkannya merupakan hiperendemis di Asia Tenggara, dengan bentuk yang paling berbahaya berupa Demam Berdarah Dengue (DBD) dan Sindrom Syok Dengue (SSD) yang biasanya bersifat fatal, terutama pada anak-anak. Penularan virus Dengue dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain keberadaan virus, vektor, lingkungan fisik diantaranya adalah tersedianya habitat perkembang biakan, curah hujan (fisik) dan sosial budaya. Di Indonesia, karena suhu udara dan kelembaban tidak sama di setiap tempat, maka pola waktu terjadinya penyakit agak berbeda untuk setiap tempat.
Penyakit DBD disebabkan oleh virus Dengue dengan serotipe 1, DEN-2, DEN-3, DEN-4. Virus Dengue ditransmisikan melalui siklus hidup nyamuk, terutama anggota dari genus Aedes, dan primata yang tingkatnya lebih tinggi, terutama manusia. Jenis nyamuk ini terdapat hampir di seluruh pelosok Indonesia. Uji berdasarkan reverse transcriptase (RT) PCR (RT-PCR) dapat secara cepat, sensitif, dan spesifik mendeteksi tipe-tipe virus. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui adanya virus Dengue serotipe DEN-4 pada nyamuk Aedes aegypti betina di kota Medan. Manfaat penelitian ini adalah Untuk mengetahui frekuensi virus Dengue serotipe DEN-4 dari nyamuk Aedes aegypti betina di kota Medan. Latar belakang penelitian karena belum diketahui bagaimana frekuensi virus Dengue serotipe DEN-4 pada nyamuk Aedes aegypti betina di kota Medan. Penelitian dilakukan secara deskriptif dengan mengumpulkan sampel dari bulan September-November 2008. Nyamuk ditangkap dari habitat istirahat di dalam rumah, terutama di tempat-tempat yang lembab, gelap di rumah penderita atau mantan penderita DBD menurut data Dinas Kesehatan oleh 4 kolektor pada pagi hari (pukul 09.00wib - pukul 11.00 wib) dan sore hari (pukul 16.00 wib – pukul 18.00 wib).
Dari keseluruhan 100 sampel nyamuk A. aegypti betina yang dikumpulkan dari 5 Kecamatan yang berbeda di kota Medan, yaitu Medan Helvetia, Medan Amplas, Medan Selayang, Medan Baru dan Medan Sunggal, dimana sampel diekstraksi, dilakukan RT-PCR, dielektroforesis, dan difoto, tidak ditemukan adanya virus Dengue serotipe DEN-4.
ABSTRACT
Infection by Dengue virus (DENV) is still becomes serious health problems in many tropical and subtropical region in the world. The disease occured hyperendemic in South East Asia, with the most danger form Dengue Haemorrhagic Syndrome (DHF) and Dengue Shock Syndrome (DSS) which are usually fatal, especially in children. The transmission of the disease influenced by several factors such as the appearance of the virus, vector, physic environment like the availibility of habitat proliferation, rainfall (physic) and social culture. In Indonesia, due to different temperature and humidity in every places, the time pattern of the disease is slight different for each place.
DHF caused by Dengue virus which consists of 4 serotypes DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4. Dengue virus transmitted by mosquito’s life cycle, especially the family from Aedes subgenus, and a higher level of primata, essentially human. This kind of mosquito available in almost all area of Indonesia. Laboratoy test using reverse transcriptase (RT) PCR (RT-PCR) can immediately, sensitively, and specificly detect the type of viruses. The aim of this research is to find out the existancy of Dengue virus serotype DEN-4 in female Aedes aeypti in Medan. The benefit of this research is to find out the frequency of Dengue virus serotype DEN-4 in female Aedes aegypti in Medan. The background of this research is because there is no frequency of Dengue virus serotype DEN-4 in female Aedes aegypti in Medan. This research was done descriptively by collecting samples during September to November 2008 from its habitat in resting places of this mosquito, especially in humid and dark places at the residents of patient or expatient according to data from Health Service by 4 collectors in the morning (9.00-11.00 am) and in the afternoon (4.00-6.00 pm)
From all 100 sampels of female A.aegypti collected from 5 subdistrict endemic DHF in Medan; Medan Helvetia, Medan Amplas, Medan Selayang, Medan Baru, and Medan Sunggal. The samples were extracted, electroforezised, photos, the result is no Dengue virus serotype DEN-4 were found.
KATA PENGANTAR
Ucapan syukur yang sebesar-besarnya penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segara rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini.
Penulisan tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Kedokteran Tropis di Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara.
Selama masa kuliah sampai masa penyelesaian tesis ini penulis banyak memperoleh bimbingan dan bantuan dari berbagai pihak. Untuk itu dengan ketulusan hati penulis mengucapkan terima kasih kepada :
Koordinator Kopertis Wil. I beserta seluruh stafnya atas izin yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti pendidikan program Magister.
1. Rektor Universitas Sumatera Utara, Prof.Chairuddin P. Lubis,DTM&H,Sp.A(K) atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan
untuk mengikuti dan menyelesaikan pendidikan program Magister.
2. Direktur Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara, Prof.Dr.Ir.T.Chairun Nisa B,M.Sc atas kesempatan menjadi mahasiswa pada Program Ilmu Kedokteran Tropis Universitas Sumatera Utara.
Terima kasih yang tak terhingga dan penghargaan setinggi-tingginya kepada : 1. Prof.Dr.A.A.P.Depari,DTM&H,SpPark,dr.R.Lia Kusumawati,MS,SpMK
dan dr.Dewi Masyitah Darlan,DTM&E,MPH, selaku pembimbing yang dengan penuh perhatian telah memberikan dorongan,bimbingan dan saran untuk penyelesaian tesis ini.
2. Dr.dr.Rosihan Anwar,DMM,MS,Sp.MK,M.Pd,DR dan dr. Endang Haryanti Gani,Sp.Park selaku dosen pembanding dan penguji tesis, atas masukan dan koreksi yang diberikan untuk penyempurnaan tesis ini. 3. Orang tua penulis, ibunda Eliwaty Ramali yang tak henti-hentinya
mendoakan dan menasehati dengan penuh kasih sayang.
4. Istri penulis, Dr.Ameliana Safitri Purba, yang selalu memberi motivasi dan dukungan dalam suka dan duka kepada penulis selama menjalani pendidikan. Demikian juga anak-anak penulis, Agatha Ruth Tjahjasari. Semoga menjadi anak-anak yang pandai,serta berguna bagi agama, keluarga, nusa dan bangsa.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna, banyak kekurangan baik dari segi isi maupun susunan bahasanya. Saran dan kritik diharapkan dengan tujuan menyempurnakan dan mengembangkan tesis ini.
Akhir kata, penulis berharap semoga tesis ini dapat berguna dan memberikan sumbangan ilmu pengetahuan kepada kita semua.
Medan, Februari 2009
RIWAYAT HIDUP
Nama Lengkap : Andi Mulia Tjahjasari Tempat/Tanggal Lahir : Medan, 09 Desember 1978
Sebagai anak ke tiga dari Bapak Burhan Tjahjasari (Alm) dan Ibu Eliwaty Ramali.
Alamat : Jl. Menggala No.2EE/10 Medan
Riwayat Pendidikan :
1. Sekolah Dasar : SD Budi Murni 3 Medan, tahun 1985 - 1991 2. Sekolah Menengah Pertama : SMP W.R.Supratman Medan, tahun 1991 -1994 3. Sekolah Menengah Atas : SMU W.R.Supratman Medan, tahun 1994 -1997 4. Universitas : Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan, tahun 1997 -2003
5. Pendidikan/latihan lain : Advance Trauma Life Support (ATLS) tahun 2003
Riwayat pekerjaan :
1. Dokter PTT di Deli Tua tahun 2003.
BAB I PENDAHULUAN I.1. Latar Belakang
Infeksi oleh virus Dengue (DENV) masih tetap menjadi masalah kesehatan yang serius di banyak daerah tropis dan subtropis di dunia. Penyakit yang ditimbulkannya merupakan hiperendemis di Asia Tenggara, dengan bentuk yang paling berbahaya berupa Demam Berdarah Dengue (DBD) dan Sindrom Syok Dengue (SSD) yang biasanya bersifat fatal, terutama pada anak-anak. Diperkirakan lebih kurang 100 juta kasus demam Dengue dan 500 ribu kasus DBD terjadi tiap tahunnya di seluruh dunia, 90% dari kasus-kasus tersebut menyerang anak-anak di bawah 15 tahun (Yulfi, 2006).
dengan infeksi penyakit lain, seperti flu atau demam tifoid. Penyakit DBD disebabkan oleh virus Dengue dengan serotipe DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4 (Depkes RI, 2004). Virus Dengue ditransmisikan melalui siklus hidup nyamuk, terutama anggota dari subgenus Aedes betina, dan primata yang tingkatnya lebih tinggi, terutama manusia (Savage et al, 1998). Nyamuk Aedes sp. tersebar luas di seluruh tanah air, oleh karena itu seluruh wilayah Indonesia mempunyai resiko penularan DD dan DBD (Hadinegoro dkk, 2004).
Virus Dengue serotipe 4 pertama kali dilaporkan di Amerika pada tahun 1981, di mana virus ini mengakibatkan epidemi demam Dengue pada seluruh wilayah tersebut (Carrington et al., 2005). Virus ini termasuk dalam kelompok B Arthropod Borne Viruses (Arboviruses) yang sekarang dikenal sebagai genus Flavivirus, famili
Flaviviridae (Depkes RI, 2004). Aedes aegypti adalah vektor epidemi terutama dari virus Dengue di daerah pedesaan di Asia selama abad-abad terakhir, dan vektor epidemi terakhir di Afrika, Amerika Tengah dan Selatan, dan Pasifik (Savage et al., 1998). Keempat serotipe virus tersebut telah ditemukan di berbagai daerah di Indonesia, antara lain Jakarta dan Yogyakarta (Depskes RI, 2004). Keempat serotipe dari virus Dengue telah dikenal, dan telah tercatat 40-100 juta kasus demam Dengue dan beberapa ratus juta kasus demam berdarah Dengue setiap tahun sejak tahun 1990 (Savage et al., 1998).
Dari tanggal 1 Januari hingga 30 April 2004, terjadi total 58.301 kasus demam Dengue dan demam berdarah Dengue dan 658 kematian terdaftar oleh Kementerian Kesehatan Indonesia. Case fatality rate 1,1%. Ledakan dengan angka yang sangat tinggi dan kasus-kasus telah dilaporkan dari 293 kota-kota dan kabupaten-kabupaten di 17 propinsi. Selama pandemi tahun 1998, di mana lebih dari 1,2 juta kasus demam Dengue dan demam berdarah Dengue dilaporkan oleh WHO dari 56 negara, Indonesia dilaporkan memiliki angka tahunan 72.133 kasus dan 1.414 kematian dengan secara keseluruhan case fatality rate 2,0%. Seperti di tahun 1998, DEN-3 kelihatannya mendominasi sirkulasi serotipe virus (37%) di Indonesia tahun ini, tetapi DEN-4 (19%), DEN-2 dan DEN-1 juga dijumpai. Pada akhir April situasi telah kembali ke normal dengan seluruh propinsi dilaporkan kasus-kasus dengan tingkat yang rendah. Jakarta, Bali dan Nusa Tenggara Timur, diantara keseluruhan propinsi yang terinfeksi, masih terus dimonitor (WHO, 2004).
transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) dapat secara cepat, sensitif, dan
spesifik mendeteksi tipe-tipe virus (Harris dkk, 1998).
Pada siklus musiman, peningkatan infeksi virus Dengue terjadi pada musim penghujan, yakni pada saat tersedianya habitat perkembangbiakan bagi nyamuk, bertambahnya umur nyamuk dan meningkatnya kelembaban sehingga memungkinkan terjadinya peningkatan resiko penularan. Penularan virus Dengue dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain keberadaan virus, vektor, lingkungan fisik diantaranya adalah tersedianya habitat perkembang biakan, curah hujan (fisik) dan sosial budaya .
Karena begitu banyaknya faktor-faktor pendukung penyebaran virus Dengue di Indonesia pada umumnya dan di kota Medan pada khususnya, salah satunya adalah virus Dengue serotipe DEN-4 yang belum pernah diteliti di Medan, maka dilakukanlah penelitian ini pada nyamuk Aedes aegypti dengan menggunakan metode RT-PCR (RT-PCR).
informasi peta data kasus DBD dari segi jumlah, gejala/karakteristik penyakit, tempat/lokasi, serotipe RNA DENV dan waktu kejadian di Kotamadya Medan, sehingga dapat mengamplifikasi Early Warning Outbreak Recognition System (EWORS) dalam masalah DBD (Depkes RI, 2004).
I.2. Perumusan Masalah
Berdasarkan uraian latar belakang tersebut, maka dapat dirumuskan masalah sebagai berikut yaitu, belum diketahui bagaimana frekuensi virus Dengue serotipe DEN-4 pada nyamuk Aedes aegypti betina di kota Medan.
I.3. Tujuan Penelitian I.3.1. Tujuan umum
Untuk mengetahui adanya virus Dengue serotipe DEN-4 pada nyamuk Aedes aegypti betina di kota Medan.
I.3.2. Tujuan khusus
1. Untuk mengetahui keberadaan virus Dengue serotipe DEN-4 dari nyamuk Aedes aegypti betina di kota Medan.
2. Untuk mengetahui perkembangan virus Dengue serotipe DEN-4 dari nyamuk Aedes aegypti betina pada masyarakat di kota Medan dengan menggunakan
Dengue melalui metode Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).
I.4. Manfaat Penelitian
1. Untuk memperoeh data frekuensi virus Dengue serotipe DEN-4 dari nyamuk Aedes aegypti betina di kota Medan.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1. Virus Dengue Serotipe DEN-4
Virus Dengue merupakan salah satu virus yang termasuk dalam famili Flaviviridae. Virion Dengue merupakan partikel sferis dengan diameter nukleokapsid
Virus Dengue adalah virus dengan untaian tunggal, virus RNA (famili Flaviviridae) yang muncul dengan empat serotipe antigen yang berbeda. Setiap
serotipe secara genetik memiliki perbedaan. Meskipun infeksi secara umum (terutama infeksi primer) simtomatik sama, seluruh tipe virus ini berhubungan dengan demam Dengue, dan demam adalah gejala minor. Infeksi primer menghasilkan imunitas jangka panjang terhadap infeksi sekunder dengan serotipe lainnya. Hal ini meningkatkan dalam resiko kebanyakan hasil dari reaksi silang antibodi dan sel T yang meningkatkan tingkat infeksi dan secara langsung melibatkan patofisiologi demam berdarah Dengue (Carrington et al., 2005).
Genus Flavivirus (famili Flaviviridae) terdiri dari lebih kurang mendekati 70 untaian tunngal, virus RNA. Virion berukuran mendekati 50 nm dan memiliki 3 struktur protein, yang lebih besar berukuran 49 dan 16,5 kDa protein yang mengalami glikosidasi dan berhubungan dengan envelop, di mana yang lebih kecil berukuran 13 kDa protein yang berhubungan dengan virus RNA. Meskipun demikian, envelop protein yang berukuran 16,5 kDa lebih besar dari yang terlihat secara khusus pada Flavivirus (Carrington et al., 2006).
dari 2004-2005 menunjukkan DEN-4, tetapi kluster yang berbeda dibandingkan strain yang diisolasi dari tahun 1993-1995 (Cesaire et al.,2005).
II.2. Nyamuk Aedes aegypti
Genus Nyamuk Aedes termasuk kelas Insecta (Hexapoda) dari famili Culicidae. Terdistribusi secara kosmopolit dari daerah tropik sampai kedua kutub. Nyamuk Aedes sp. bentuk dewasa betina menghisap darah Vertebrata, baik yang berdarah dingin maupun yang berdarah panas. Darah diperlukan selain sebagai makanan, juga sebagai persediaan protein untuk mematangkan telurnya. Bentuk dewasa jantan tidak menghisap darah. Makanannya cukup dengan menghisap cairan madu atau air gula saja. Biasanya bentuk dewasa jantan pergi jauh dari tempat habitatnya dan berkumpul pada waktu senja menunggu nyamuk betina yang datang satu persatu memilih pasangannya, kemudian akan pergi bersama-sama untuk kopulasi. Sisa kelompok jantan berkumpul lagi hari berikutnya sampai mendapat pasangan. Dalam dunia nyamuk, tidak dikenal kawin campuran antara spesies (Husaini, 2003; Roberts et al, 2005).
II.3. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Dewasa ini telah dikembangkan beberapa metode untuk mengamplifikasi asam nukleat in vitro. Tujuan utama teknik ini adalah untuk memperbaiki sensitivitas uji yang berdasar pada asam nukleat dan untuk menyederhanakan prosedur kerjanya melalui automatisasi dan bentuk deteksi non isotopik. Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan salah satu teknik amplifikasi asam nukleat in vitro yang paling banyak dipelajari dan digunakan secara luas (Purwanta, 1999). Metode ini pertama dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis, seorang peneliti di perusahaan CETUS corporation (Ginanjar, 2008). Dalam waktu 9 tahun sejak pertama kali
dikemukakan oleh ilmuwan dari Cetus Corporation, PCR telah berkembang menjadi teknik utama dalam laboratorium biologi molekuler. PCR adalah suatu metode untuk mengamplifikasi sekwens gen target secara eksponensial in vitro. Pada reaksi ini dibutuhkan DNA target, sepasang primer, polimerase DNA yang termostabil, buffer reaksi dan alat thermal cycler (Purwanta, 1999).
memperoleh segmen molekul DNA yang banyak. Pendeteksian ini dilakukan dengan metode pemisahan molekul berdasarkan bobot molekulnya, yang disebut elektroforesis menggunakan gel agarose (agarose gel electrophoresis) dan setelah dilakukan reaksi pewarnaan menggunakan bahan kimia syber safe gel, dapat dilihat adanya pita molekul pada gel agarose (Sudjadi, 2008). Pita molekul ini menandakan adanya segmen DNA atau dengan kata lain DNA terdeteksi. Pertama kali komplementer DNA (cDNA) yang dibuat dari messenger cetakan RNA menggunakan dNTPs dan enzim reverse transcriptase melalui proses reverse transcription (Wikipedia, 2008). Kemudian proses pelipatgandaan PCR ini meliputi 3 proses utama, yaitu pertama, melepaskan utas ganda DNA menjadi 2 utas tunggal DNA melalui proses yang disebut dengan denaturasi (denaturation). Proses pelepasan rantai ganda DNA ini memerlukan suhu lingkungan optimum yang saat ini diketahui sebesar 920C.
Proses ketiga disebut perpanjangan (extension). Pada proses ini keberadaan deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP), yang sebelumnya telah ditambahkan ke
dalam pereaksi, menyebabkan primer yang tadinya hanya 18 hingga 24 deret basa nukleotida akan memperoleh tambahan basa nukleotida yang terdapat di dNTP dan kemudian menjadi sepanjang segmen DNA yang dilipatgandakan itu. Pada proses ini reaksi tersebut terbantu oleh adanya enzim DNA polimerase dan enzim ini bekerja secara optimum terjadi pada suhu 720C. dNTP sendiri merupakan kumpulan 4 jenis basa nukleotida (A, G, C, dan T) yang terikat pada 3 gugus fosfat dan masing-masing berdiri bebas sampai keberadaan DNA polimerase mengkatalis pengikatannya pada primer. Ketiga proses ini dilakukan berputar-putar atau berulang-ulang sampai jumlah kelipatan segmen DNA sesuai dengan kebutuhannya (Sopian, 2006). RT-PCR secara luas digunakan dalam mendiagnosa penyakit-penyakit genetik dan secara kuantitatif digunakan dalam menentukan perbedaan molekul RNA spesifik di dalam sel atau jaringan yang diperiksa untuk menentukan tampilan gen (Wikipedia, 2008).
Dalam biologi molekuler, dua nukleotida dalam DNA atau RNA yang saling komplementer yang terhubung oleh ikatan hidrogen disebut pasangan basa. Dalam pasangan basa Watson-Crick, adenin (A) membentuk pasangan basa dengan Timin (T) dalam DNA, sementara guanin (G) dengan sitosin (C). Pada RNA, timin (T) digantikan oleh uracil (U) (Wikipedia, 2004).
Untaian DNA A. aegypti serotipe DEN-4:
II.4. Epidemiologi DBD
Memasuki awal tahun 2004 di Indonesia, jumlah kasus DBD mengalami peningkatan yang cukup bermakna. Sejak tanggal 1 Januari 2004 sampai dengan 5 Maret 2005 secara kumulatif, jumlah kasus DBD yang dilaporkan dan telah ditangani sebanyak 26.015 kasus, dengan kematian mencapai 389 (CFR=1,53%). Sedangkan KLB DBD pada tahun 1998 jumlah penderita 71.776 orang dengan kematian 2.441 jiwa (CFR=3,4%). Pada tahun 1998 perhatian masyarakat tertuju pada euforia reformasi sehingga perhatian terhadap KLB DBD kurang. Saat ini, peningkatan kasus DBD hanya terjadi di beberapa wilayah seperti DKI Jakarta, Jawa Barat dan Sulawesi. Beberapa daerah sudah dapat dikendalikan, namun berbagai upaya masih perlu lebih ditingkatkan untuk menanggulangi meningkatnya kasus DBD. Gambaran tentang kasus yang terjadi di beberapa propinsi di Indonesia dapat terlihat dari 30 propinsi se Indonesia, propinsi yang dilaporkan adanya KLB DBD sebanyak 12 propinsi yang meliputi : Nangroe Aceh Darussalam, Banten, DKI Jakarta, Jawa Barat, Jawa Tengah, DI Yogyakarta, Jawa Timur, Kalimantan Selatan, Sulawesi Selatan, Bali, NTB dan NTT (Depkes RI, 2004).
pada tahun 1970. DBD pada orang dewasa dilaporkan pertama kali oleh Swandana (1970) yang kemudian secara drastis meningkat dan menyebar ke seluruh daerah tingkat I di Indonesia (Hendarwanto, 1999).
II.5. Diagnosis Demam Dengue (DD), Demam Berdarah Dengue (DBD) dan Sindrom Syok Dengue (SSD)
Infeksi virus Dengue tergantung dari faktor yang mempengaruhi daya tahan tubuh dengan faktor-faktor yang mempengaruhi virulensi virus. Dengan demikian infeksi virus Dengue dapat menyebabkan keadaan yang bermacam-macam, mulai dari tanpa gejala (asimtomatik), demam ringan yang tidak spesifik (undifferentiated febrile illness), Demam Dengue, atau bentuk yang lebih berat Demam Berdarah
Dengue (DBD) dan Sindrom Syok Dengue (SSD) (Hadinegoro dkk, 2004; Levinson et al, 2000).
II.5.1. Definisi kasus DD/DBD secara laboratoris 1. Presumtif positif (kemungkinan Dengue) :
Apabila ditemukan demam akut disertai dua atau lebih manifestasi klinis berikut: nyeri belakang mata, mialgia, artralgia, ruam, manifestasi perdarahan, leukopenia, uji HI 1280 dan IgM anti Dengue positif, atau pasien berasal dari daerah yang pada saat yang sama ditemukan kasus confirmed Dengue infection. 2. Confirmed DBD (pasti DBD) :
Kasus dengan konfirmasi laboratorium sebagai berikut :
deteksi antigen Dengue, peningkatan titer antibodi > 4 kali pada pasangan serum akut dan serum konvalesens, dan atau isolasi virus (Hadinegoro dkk, 2004; Peters, 2001).
II.5.2. Definisi kasus DD/DBD secara klinis
Kasus DBD :
1. Demam akut 2-7 hari, bersifat bifasik.
2. Manifestasi perdarahan yang biasanya berupa : a. Uji tourniquet positif, petekia, ekimosis atau purpura
b. Perdarahan mukosa, saluran cerna, dan tempat bkas suntikan. c. Hematemesis atau melena.
4. Kebocoran plasma yang ditandai dengan :
a. Peningkatan nilai hematokrit ≥ 20% dari nilai baku sesuai umur dan jenis kelamin.
b. Penurunan nilai hematokrit ≥ 20% setelah pemberian cairan yang adekuat. Nilai Ht normal diasumsikan sesuai nilai setelah pemberian cairan.
c. Efusi pleura, asites, hipoproteinemi (Hadinegoro dkk, 2004; Suhendro dkk, 2006).
Kasus SSD :
Diagnosis DBD ditegakkan berdasarkan kriteria diagnosis menurut WHO tahun 1997 terdiri dari kriteria klinis dan laboratoris. Penggunaan kriteria ini dimaksudkan untuk mengurangi diagnosis yang berlebihan (overdiagnosis).
Kriteria Klinis DBD :
a. Demam tinggi mendadak, tanpa sebab jelas, berlangsung terus-menerus selama 2-7 hari.
b. Terdapat manifestasi perdarahan ditandai dengan : 1. Uji tourniquet positif.
2. Petekia, ekimosis, purpura.
3. Perdarahan mukosa, epistaksis, perdarahan gusi. 4. Hematemesis dan atau melena.
c. Pembesaran hati.
Kriteria Laboratoris :
a. Trombositopenia (100.000/µl atau kurang)
b. Hemokonsentrasi, dapat dilihat dari peningkatan hematokrit 20% atau lebih. Dua kriteria pertama ditambah trombositopenia dan hemokonsentrasi atau peningkatan hematokrit cukup untuk menegakkan diagnosis klinis DBD. Efusi pleura dan atau hipoalbuminemia dapat mengamplifikasi diagnosis terutama pada pasien anemi dan atau terjadi perdarahan. Pada kasus syok, peningkatan hematokrit dan adanya trombositopenia mendukung diagnosis DBD (Hadinegoro dkk, 2004; Suhendro dkk, 2006).
Derajat penyakit DBD/SSD diklasifikasikan dalam 4 derajat (WHO, 1997): Derajat I : Demam disertai gejala tidak khas dan satu-satunya manifestasi
perdarahan ialah uji tourniquet.
Derajat II : Seperti derajat I, disertai perdarahan spontan di kulit dan atau perdarahan lain.
Derajat III : Didapatkan kegagalan sirkulasi, yaitu nadi cepat dan lambat, tekanan nadi menurun (20 mmHg atau kurang) atau hipotensi, sianosis di sekitar mulut, kulit dingin dan lembab, dan anak tampak gelisah.
BAB III
METODE PENELITIAN
III.1. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan dengan mengambil sampel A.aegypti dari rumah-rumah pasien di 5 kecamatan endemis DBD di wilayah Medan, Sumatera Utara, yaitu Medan Helvetia, Medan Amplas, Medan Selayang, Medan Baru dan Medan Sunggal dari bulan September sampai dengan November 2008. Sampel-sampel tersebut diperiksa dengan menggunakan metode reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) di laboratorium Mikrobiologi Klinik RS H.Adam Malik Medan.
III.2. Subjek Penelitian
Nyamuk Aedes aegypti betina dari rumah-rumah pasien di 5 kecamatan di kota Medan, yakni Medan Helvetia, Medan Selayang, Medan Sunggal, Medan Baru dan Medan Amplas.
III.3. Rancangan Penelitian
Penelitian dilakukan secara deskriptif terhadap 100 sampel nyamuk Aedes aegypti betina di SMF laboratorium Mikrobiologi Klinik RS H. Adam Malik Medan
Puskesmas atau Dinas Kesehatan kota Medan. Kebutuhan 100 sampel nyamuk A.aegypti betina dalam penelitian ini didasarkan pada rumus :
n ≥ z2.(0,5- /2).p.q e2
Keterangan : : 0,05
z : 0,5- /2 = 1,96
e : tingkat ketepatan yang diinginkan (10%) p : proporsi = 0,5
q = 1-0,5= 0,5
n ≥ 1,962.0,5.0,5
(10/100)2
n ≥ 96,04
Kesimpulan : Sampel minimal yang masih cukup representatif yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah sebesar 96 sampel (Arman, 2006).
Kebutuhan 100 sampel dalam penelitian ini dilakukan dengan ke atas dari 96 sampel minimal yang masih representatif yang dibutuhkan. Populasi nyamuk A.aegypti betina yang berasal dari 100 rumah-rumah penduduk yang sedang dan atau
III.4. Kerangka Kerja
Nyamuk A.aegypti betina dikumpulkan
Ekstraksi RNA virus Dengue
RT-PCR menggunakan primer D4
Elektroforesis
Visualisasi dengan gel imaging
Jadwal rencana pelaksanaan keseluruhan penelitian dapat dilihat pada lampiran 1.
III.5. Pelaksanaan Penelitian III.5.1. Alat dan bahan
Alat :
1. Tip 25 µL 2. Tip 200 µL
3. Pipet merek Bio Rad ukuran 0,5-10µl, 2-10µl, 10-100µl, 20-200µl, 100-1000µl
7. Homogeniser steril 8. Microcentrifuge 9. Microwave 10. Beaker glass 11. Penggerus 12. Ice bath
13. Collection tube (2ml)
14. Parafil film merek American National Can. 15. Tabung eppendorf
16. Tabung erlenmeyer
17. Tabung kultur dengan C6/36 cell line 18. Tabung kultur 12 ml (plastik screw cap) 19. Api bunsen
20. Aspirator 21. Inkubator 22. Baki steril
23. Freezer -20ºC merek Panasonic
24. Freezer/refregerator -700 C merek Sanyo VIP Series 860 C MDF-U53V 25. Mesin elektroforesis merek Bio Rad Power Pac Basic
26. Tangki elektroforesis
29. Mesin PCR (thermal cycler) merek Bio Rad, Cycler 30. Mixer Tipe 37600
31. Centrifuge merek Sorvall Biofuge Primo R 32. Lampu ultraviolet
33. Polaroid
34. Mesin pencitraan/imaging merek Bio Rad
35. Biosafety Cabinet kelas II merek ESCO Class II Type A2 Lab Culture
Bahan :
1. Medium pertumbuhan MEM dengan 5% FBS (Foetal Bovinus Serum)
2. QIAamp® Viral RNA Mini Kit dari qiagen (QIAamp MinElute Columns, buffer AL, buffer AW 1, buffer AW 2, RNA-se free water atau buffer AVE, qiagen protease, carrier RNA, protease resuspension buffer)
3. MgSO4
4. Superscript III RT 5. Etanol 96-100% 6. Buffer TAE 50 ml
7. DMEM (Drainage Enrich Medium) 8. Aquadest 100 Ml
9. Free water nucleus
10. Agarose 1 gram
12. Blue juice
13. Gel imaging (Bio Rad)
III.5.2. Isolasi virus
Nyamuk akan dicairkan (defrost) pada suhu yang diinginkan untuk proses isolasi, setelah itu diletakkan dalam ice bath. Nyamuk dihancurkan dan diletakkan dalam tabung eppendorf dengan 1,5 ml medium pertumbuhan (MEM dengan 5% FBS). Suspensi nyamuk diputar dengan kecepatan 14000 rpm pada suhu 4°C dan supernatannya akan siap digunakan untuk isolasi virus di dalam tabung kultur dengan C6/36 cell line. Seluruh proses pemeriksaan sampel nyamuk dilakukan per individu dan dicatat berdasarkan lokasi dan waktu penangkapan.
III.5.3. Ekstraksi virus
III.5.4. Persiapan bahan
III.5.4.1. Mempersiapkan qiagen protease
Sebanyak ditambahkan ke dalam qiagen protease dengan di campurkan dan tidak menggunakan vortex. Hasil campuran dipisahkan ke dalam 5-6 tabung eppendorf di mana masing-masing berukuran 250 µl (untuk 10 reaksi), kemudian disimpan ke dalam kulkas pada suhu -20ºC.
III.5.4.2. Mempersiapkan buffer A
Sebanyak 310 µl buffer AVE ditambahkan ke dalam tabung berisi ’carrier RNA’ (310 µg). Kemudian pisahkan ke dalam 5 tabung eppendorf di mana
masing-masing tabung berisi 62 µl (untuk 10 reaksi), dan disimpan pada suhu -20ºC.
III.5.4.3. Mempersiapkan buffer AW 1
Sebanyak 30 ml etanol 96-100% ditambahkan ke dalam buffer AW 1, lalu disimpan pada suhu ruangan.
III.5.4.4. Mempersiapkan buffer AW 2
III.5.5. Pelaksanaan ekstraksi virus
Campuran buffer AL 1100 µL ditambahkan ke dalam 31 µl carrier RNA (yang sudah bercampur buffer AVE). Sediaan medium terdiri dari MEM+5% FBS, di mana 1 ekor nyamuk mengandung 300 µl medium (285 µL MEM+15 µL FBS). Dengan menggunakan pinset steril, diambil 1 ekor nyamuk dan dimasukkan ke dalam eppendorf, lalu ditambahkan 300 µl medium. Nyamuk digerus dengan alat homogeniser steril.
Setelah 10 sampel selesai digerus, sampel-sampel dimasukkan ke dalam centrifuge dan diputar dengan 14000 rpm pada suhu 4ºC selama 10 menit. Setelah itu diambil 200 µL dari supernatant dan dimasukkan ke dalam 25 µl Qiagen Protease di dalam microcentrifuge atau eppendorf yang berukuran 1,5 ml.Lalu ditambahkan dengan 200 µl buffer AL dan carrier RNA. Semuanya diinkubasi pada suhu 56ºC selama 15 menit, lalu di briefly centrifuge dengan 8000 rpm selama 1 menit. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam kolum dan ditutup, lalu kembali disentrifugasi dengan 8000 rpm selama 1 menit. Collection tube yang mengandung filtrat dibuang dan kolum dimasukkan ke dalam
kolum dimasukkan ke dalam collection tube yang baru. Hasilnya dicuci dengan etanol dengan cara menambahkan 500 µl etanol 96-100%, lalu disentrifugasi dengan 8000 rpm selama 1 menit. Collection tube yang mengandung filtrat kembali dibuang dan kolum dimasukkan ke dalam collection tube yang baru. Hasilnya disentrifugasi dengan 14000 rpm selama 3 menit untuk mengeringkan (dry spin).
Kolum dimasukkan ke dalam collection tube yang baru dengan tutup terbuka, lalu diinkubasi dengan 56ºC selama 3 menit. Kemudian collection tube dibuang, dan kolum ditempatkan pada microcentrifuge 1,5 ml. Buffer AVE sebanyak 20-150 µl (±50 µl ) atau RNA-se free water dimasukkan ke tengah-tengah membran, lid ditutup dan diinkubasi selama 1 menit dalam suhu ruangan. Lalu disentrifugasi dengan 14000 rpm selama 1 menit. Dari hasil sentrifugasi, kolum dibuang dan RNA yang telah diekstraksi disimpan dalam freezer dengan suhu -70°C.
III.5.6. RT-PCR
Yang merupakan urutan program PCR adalah :
1. cDNA-sintesis, dengan suhu 60°C selama 30 menit.
2. Pemanasan awal (hot start), dengan suhu 92°C selama 3 menit. 3. Denaturasi (denaturation), dengan suhu 92°C selama 30 detik. 4. Pendinginan (annealing), dengan suhu 53°C selama 30 detik. 5. Perluasan (extension), dengan suhu 72°C selama 1 menit.
6. Perluasan akhir (final extension), dengan suhu 72°C selama 5 menit.
Langkah RT dilakukan pada 60°C selama 30 menit untuk menghasilkan cDNA, kemudian amplifikasi dengan step PCR berikut : 92°C selama 3 menit untuk permulaan denaturasi, 92°C selama 30 detik untuk denaturasi, 53°C selama 30 detik untuk pendinginan dan 72°C selama 1 menit untuk perluasan. Siklus ini diulangi sebanyak 40 kali sebelum perluasan akhir 72°C selama 5 menit. Produk PCR ini disimpan pada 4°C sebelum digunakan.
ditambahkan ke dalam master mix, kemudian brief centrifuge dengan kecepatan 8000 rpm.
III.5.7. Elektroforesis
Cetakan gel agarose disiapkan dengan jumlah sumuran sesuai kebutuhan. Agarose 1-2% dalam 1X TAE buffer dipanaskan dalam microwave, kemudian ditambahkan 1:10000 syber safe-TM sebanyak 7 µl, dan dituang ke dalam cetakan yang telah disediakan. Setelah gel agarose mengeras, dimasukkan dalam tangki elektroforesis yang berisi 1X TAE buffer. Sebanyak 5-10 µl hasil PCR (yang telah dicampur blue juice 2X) dimuat ke dalam sumuran. Sebanyak 10 µl marker dimuat juga pada sumur nomor 1 atau sumur terakhir. Elektroforesis dijalankan 80-100 Volt (DNA akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif). Hentikan elektroforesis jika tanda biru mencapai seperempat bagian bawah (jangan sampai tanda biru hilang karena kemungkinan hasil PCR ikut terlepas dari gel. Lihat gel agarose di atas lampu ultraviolet. Dokumentasi hasil PCR dengan polaroid atau kamera digital.
III.5.8. Imaging
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1. Hasil
Dalam penelitian ini, secara keseluruhan terkumpul 341 ekor nyamuk A.aegypti dari rumah-rumah penduduk yang sedang dan atau pernah menderita DBD
menurut data Puskesmas setempat atau Dinas Kesehatan kota Medan dari 5 Kecamatan yang endemis DBD di kota Medan, yaitu Medan Helvetia, Medan Amplas, Medan Selayang, Medan Baru dan Medan Sunggal. Dari keseluruhan nyamuk A.aegypti, diambil masing-masing 20 ekor nyamuk A.aegypti betina dari masing-masing Kecamatan sebagai sampel dengan total 100 sampel nyamuk A.aegypti betina. Perincian proporsi jumlah nyamuk A.aegypti betina dari masing-masing Kecamatan dapat dilihat dalam tabel berikut.
Tabel 1. Asal dan Jumlah Nyamuk A.aegypti betina dari Masing-Masing Kecamatan di Kota Medan
Asal Nyamuk A.aegypti Persentase Jumlah (Kecamatan) (%)
Medan Helvetia 20 20,0
Medan Amplas 20 20,0
Medan Selayang 20 20,0
Medan Baru 20 20,0
Medan Sunggal 20 20,0
34
Dari tabel 1 di atas, terlihat persentase nyamuk A.aegypti betina untuk masing-masing Kecamatan sama yaitu 20% atau 20 ekor, dengan total 100 ekor. Keseluruhan 100 sampel nyamuk A.aegypti betina, dinomori dari 1 sampai dengan 100 dimulai dari sampel yang berasal dari Kecamatan Medan Helvetia (nomor 1 sampai 20), Medan Amplas (nomor 21 sampai 40), Medan Selayang (nomor 41 sampai 60), Medan Baru (nomor 61 sampai 80), dan Medan Sunggal (nomor 81 sampai 100).
Sampel-sampel tersebut diekstraksi, dan didapatkan RNA virusnya. RNA hasil ekstraksi tersebut dirubah menjadi DNA dan diamplifikasi dengan RT-PCR menggunakan primer DEN-4. Hasil RT-PCR dielektroforesis dan difoto utuk melihat pita untaian DNA. Dikatakan positif bila ditemukan pita berukuran 398 pasangan basa (bp). Sebagai pembanding dari pasangan basa yang dihasilkan, digunakan kontrol positif untuk virus Dengue serotipe DEN-4.
35
memberikan hasil yang kurang baik. Marker yang digunakan dalam penelitian adalah marker universal yang secara keseluruhan memiliki 11 pita yang berbeda-beda pasangan basa, dimulai dari 2072 bp untuk pita pertama sampai dengan 100 bp untuk pita kesebelas. Pasangan basa dari virus Dengue serotipe DEN-4 adalah 398 bp yang terletak antara pita kedelapan 400 bp dan pita kesembilan 300 bp. Berikut gambar 1 ini adalah potongan gambar dari marker 100 bp DNA ladder yang digunakan dalam penelitian.
Gambar 1. Marker 100 bp DNA Ladder
36
bp (marker 100 bp DNA ladder)
400 300
398 (6) 500
200
100
Gambar 2. Hasil Kontrol positif RT-PCR dari Keseluruhan Serotipe Virus Dengue
Keterangan: 1. Kontrol (+) DEN-2 119 bp 2. Kontrol (+) DEN-3 290 bp 3. Kontrol (+) DEN-4 398 bp 4. Kontrol (+) DEN-1 482 bp 5. Marker 100 bp DNA ladder
6. Virus Dengue serotipe DEN-4
37
400 bp 398 bp
Gambar 3. Hasil RT-PCR virus Dengue dari sampel 1 sampai dengan 10 dari Kecamatan Medan Helvetia
Keterangan : 1. Marker 100 bp DNA 7. Sampel 4 : (-) ladder 8. Sampel 5 : (-) 2. Kontrol (-) 9. Sampel 6 : (-) 3. Kontrol (+) 10. Sampel 7 : (-)
4. Sampel 1 : (-) 11. Sampel 8 : (-) 5. Sampel 2 : (-) 12. Sampel 9 : (-) 6. Sampel 3 : (-) 13. Sampel 10 : (-)
38
kedua, dan kontrol positif pada sumur ketiga. Hasil dari foto ini menunjukkan tidak ditemukannya virus Dengue serotipe DEN-4 pada sampel nomor 1 sampai dengan 10 dari Kecamatan Medan Helvetia.
400 bp
39
Gambar 4 menunjukkan hasil RT-PCR sampel virus Dengue dari nomor 11 sampai dengan 20 yang berasal dari Kecamatan Medan Helvetia. Dalam gambar ini, terlihat marker 100 bp DNA ladder pada sumur pertama, kontrol negatif pada sumur kedua, dan kontrol positif pada sumur ketiga. Hasil dari foto ini menunjukkan bahwa tidak ditemukannya virus Dengue tipe DEN-4 pada sampel nomor 11 sampai dengan 20 dari Kecamatan Medan Helvetia.
400 bp
398 bp
Gambar 5. Hasil RT-PCR dari virus Dengue dari sampel 21 sampai dengan 30 dari Kecamatan Medan Amplas
Keterangan : 1. Marker 100 bp DNA ladder
2. Kontrol (-) 3. Kontrol (+)
4. Sampel 21 : (-)
40
10. Sampel 27 : (-) 11. Sampel 28 : (-) 12. Sampel 29 : (-)
13. Sampel 30 : (-)
Gambar 5 menunjukkan hasil RT-PCR sampel virus Dengue dari nomor 21 sampai dengan 30 yang berasal dari Kecamatan Medan Amplas. Dalam gambar ini, terlihat marker 100 bp DNA ladder pada sumur pertama, kontrol negatif pada sumur kedua, dan kontrol positif pada sumur ketiga. Hasil dari foto ini menunjukkan bahwa tidak ditemukannya virus Dengue tipe DEN-4 pada sampel nomor 21 sampai dengan 30 dari Kecamatan Medan Amplas.
Gambar 6. Hasil RT-PCR dari virus Dengue dari sampel 31 sampai dengan 40 dari Kecamatan Medan Amplas
Keterangan : 1. Marker 100 bp DNA
ladder
2. Kontrol (-) 3. Kontrol (+) 400 bp
41
4. Sampel 31 : (-) 5. Sampel 32 : (-) 6. Sampel 33 : (-) 7. Sampel 34 : (-) 8. Sampel 35 : (-)
9. Sampel 36 : (-) 10. Sampel 37 : (-) 11. Sampel 38 : (-) 12. Sampel 39 : (-) 13. Sampel 40 : (-)
Gambar 6 menunjukkan hasil RT-PCR sampel virus Dengue dari nomor 31 sampai dengan 40 yang berasal dari Kecamatan Medan Amplas. Dari gambar ini, terlihat marker 100 bp DNA ladder pada sumur pertama, kontrol negatif pada sumur kedua, dan kontrol positif pada sumur ketiga. Hasil dari foto ini menunjukkan tidak ditemukannya virus Dengue serotipe DEN-4 pada sampel nomor 31 sampai dengan 40 dari Kecamatan Medan Amplas.
400 bp 398 bp
42 Gambar 7 menunjukkan hasil RT-PCR sampel virus Dengue dari nomor 41 sampai dengan 50 yang berasal dari Kecamatan Medan Selayang. Dari gambar ini, terlihat marker 100 bp DNA ladder pada sumur pertama, kontrol negatif pada sumur kedua, dan kontrol positif pada sumur ketiga. Hasil dari foto ini menunjukkan tidak ditemukannya virus Dengue serotipe DEN-4 pada sampel nomor 41 sampai dengan 50 dari Kecamatan Medan Selayang.
Gambar 8. Hasil RT-PCR dari virus Dengue dari sampel 51 sampai dengan 60 dari Kecamatan Medan Selayang
400 bp
43
Keterangan : 1. Marker 100 bp DNA ladder
Gambar 8 menunjukkan hasil RT-PCR sampel virus Dengue dari nomor 51 sampai dengan 60 yang berasal dari Kecamatan Medan Selayang. Dari gambar ini, terlihat marker 100 bp DNA ladder pada sumur pertama, kontrol negatif pada sumur kedua, dan kontrol positif pada sumur ketiga. Hasil dari foto ini menunjukkan tidak ditemukannya virus Dengue serotipe DEN-4 pada sampel nomor 51 sampai dengan 60 dari Kecamatan Medan Selayang.
400 bp
Gambar 9. Hasil RT-PCR dari virus Dengue dari sampel 61 sampai dengan 70 dari Kecamatan Medan Baru
44
Gambar 9 menunjukkan hasil RT-PCR sampel virus Dengue dari nomor 61 sampai dengan 70 yang berasal dari Kecamatan Medan Baru. Dari gambar ini, terlihat marker 100 bp DNA ladder pada sumur pertama, kontrol negatif pada sumur kedua, dan kontrol positif pada sumur ketiga. Hasil dari foto ini menunjukkan tidak ditemukannya virus Dengue serotipe DEN-4 pada sampel nomor 61 sampai dengan 70 dari Kecamatan Medan Baru.
400 bp
398 bp
45 Gambar 10 menunjukkan hasil RT-PCR sampel virus Dengue dari nomor 71 sampai dengan 80 yang berasal dari Kecamatan Medan Baru. Dari gambar ini, terlihat marker 100 bp DNA ladder pada sumur pertama, kontrol negatif pada sumur kedua, dan kontrol positif pada sumur ketiga. Hasil dari foto ini menunjukkan tidak ditemukannya virus Dengue serotipe DEN-4 pada sampel nomor 71 sampai dengan 80 dari Kecamatan Medan Baru.
Gambar 11. Hasil RT-PCR dari virus Dengue dari sampel 81 sampai dengan 90 dari Kecamatan Medan Sunggal
46
Gambar 11 menunjukkan hasil RT-PCR sampel virus Dengue dari nomor 81 sampai dengan 90 yang berasal dari Kecamatan Medan Sunggal. Dari gambar ini, terlihat marker 100 bp DNA ladder pada sumur pertama, kontrol negatif pada sumur kedua, dan kontrol positif pada sumur ketiga. Hasil dari foto ini menunjukkan tidak ditemukannya virus Dengue serotipe DEN-4 pada sampel nomor 81 sampai dengan 90 dari Kecamatan Medan Sunggal.
Gambar 12. Hasil RT-PCR dari virus Dengue dari sampel 91 sampai dengan 100 dari Kecamatan Medan Sunggal
47
Gambar 12 menunjukkan hasil RT-PCR sampel virus Dengue dari nomor 91 sampai dengan 100 yang berasal dari Kecamatan Medan Sunggal. Dari gambar ini, terlihat marker 100 bp DNA ladder pada sumur pertama, kontrol negatif pada sumur kedua, dan kontrol positif pada sumur ketiga. Hasil dari foto ini menunjukkan tidak ditemukannya virus Dengue serotipe DEN-4 pada sampel nomor 91 sampai dengan 100 dari Kecamatan Medan Sunggal.
Tabel 3. Rangkuman Hasil Penelitian
Kecamatan Jumlah Sampel Sampel (+) Persentase (ekor) DEN-4
Pemeriksaan RT-PCR dalam penelitian ini dengan menggunakan marker 100 bp DNA ditujukan untuk mengetahui berapa pasangan basa yang dihasilkan dari
sampel virus Dengue dengan primer D4 dari nyamuk A.aegypti betina yang dikumpulkan.
Dinamika transmisi virus Dengue dipengaruhi oleh interaksi berbagai faktor lingkungan fisik, biologi, dan sosial. Di dalam interaksi tersebut mencakup aspek virus Dengue, vektor maupun orang. Nyamuk, vektor dan orang bergerak menurut tempat dan waktu, sehingga dinamika transmisi virus Dengue dipengaruhi oleh peran banyak faktor untuk keempat serotipe virus Dengue.
menunjukkan bahwa populasi masing-masing serotipe virus Dengue dapat dominan pada waktu-waktu tertentu dan dipengaruhi kondisi geografis tertentu. Hal ini dapat ditunjukkan dari gambaran grafik yang ada berikut.
Gambar 13. Gambar pola dominansi serotipe virus Dengue dari serum manusia pada periode yang berbeda-beda selama tahun 2004-2007
Dari gambar 13 di atas, terlihat bahwa pola dominansi virus Dengue serotipe DEN-4 pada serum umumnya dijumpai sekitar bulan Januari sampai dengan Februari setiap tahunnya dari tahun 2004 sampai dengan 2007. Namun hal ini belum tentu dapat disamakan dengan pola dominansi virus Dengue serotipe DEN-4 pada nyamuk A.aegypti secara keseluruhan, menimbang salah satu pola perkembangbiakan nyamuk
tergenang, seperti pada sisa-sisa kaleng bekas, tempat penampungan air bersih, ban bekas dan benda-benda lain yang sangat sesuai untuk tempat perindukan nyamuk A.aegypti. Berdasarkan penelitian Soedjoko Hariadhi dkk di Jakarta berdasarkan
gambar 13, dominansi virus Dengue serotipe DEN-4 dari serum penderita DBD terjadi pada bulan Januari sampai dengan Februari. Hal ini mungkin disebabkan oleh pergerakan faktor pejamu, yaitu manusia di Jakarta, terutama anak-anak yang umumnya pada bulan Januari sampai dengan Februari sesudah berakhirnya masa liburan di luar Jakarta akan kembali ke Jakarta untuk memulai masa sekolah. Hal ini menyebabkan banyaknya faktor pejamu sesudah masa perkembangbiakan nyamuk A.aegypti pada penghujung tahun yang sangat berperan dalam dominansi serotipe
Pada tahun 2007 Departemen Kesehatan RI pernah mengeluarkan peta penyebaran keempat serotipe virus Dengue yang berasal dari serum penderita DBD berdasarkan hasil penelitian di 19 kota-kota besar di Indonesia selama tahun 2003 sampai dengan 2005 terlihat pada gambar 14 sebagai berikut.
Sumber : Depkes RI, 2007
Gambar 14. Peta populasi penyebaran serotipe virus Dengue yang berasal dari serum penderita DBD dari 19 kota yang ada di Indonesia (2003- 2005)
penyebaran tersebut, terlihat bahwa virus Dengue serotipe DEN-2 adalah yang paling dominan pada penderita DBD di kota Medan dari tahun 2003 sampai dengan 2005, diikuti oleh DEN-3 dan DEN-4. Hal ini menggambarkan beberapa kemungkinan antara lain virus Dengue serotipe DEN-4 yang sebelumnya ada di kota Medan, namun sekarang memang tidak dijumpai kemungkinan karena adanya pergeseran dominansi distribusi serotipe virus Dengue, di mana virus Dengue serotipe DEN-4 yang populasi sebelumnya memang terkecil di kota Medan dan tidak dijumpai saat ini. Berpedoman pada epidemi DBD yang terjadi 5 tahun sekali, sangat besar kemungkinan virus Dengue serotipe DEN-4 akan dijumpai kembali 5 tahun sesudah tahun 2005, yakni tahun 2010. Hal ini dapat memberikan gambaran bagi perburukan keadaan klinis DBD pada tahun 2010 menimbang serotipe virus Dengue yang bakal muncul akan semakin banyak dengan keberadaan virus Dengue serotipe DEN-4. Berdasarkan teori Halstead, semakin banyak serotipe virus yang ditemukan di suatu daerah akan memperbesar kemungkinan semakin parahnya penyakit DBD atau SSD yang diderita di daerah tersebut. Kemungkinan lain dari tidak ditemukannya virus Dengue serotipe DEN-4 pada nyamuk A.aegypti betina dalam penelitian ini adalah bahwa nyamuk A.aegypti betina yang mengandung virus Dengue serotipe DEN-4 pada tahun 2005
mobilitas manusia sangat tinggi dan fasilitas distribusi yang berkembang sangat pesat memungkinkan tidak seimbangnya arus masuk dan keluar nyamuk A.aegypti betina yang mengandung virus Dengue serotipe DEN-4 yang jumlahnya paling sedikit pada tahun 2005 dari kota Medan. Nyamuk A.aegypti betina yang mengandung virus Dengue serotipe DEN-4 yang terbawa oleh arus distribusi keluar dari kota Medan jumlahnya lebih banyak dari yang masuk ke kota Medan selama rentang waktu tersebut. Dengan jumlah nyamuk A.aegypti betina yang mengandung virus Dengue serotipe DEN-4 yang semakin berkurang memperbesar kemungkinan tidak ditemukan lagi pada saat ini yang tidak terlepas dari pengaruh seleksi alam atau terbawa masuknya nyamuk tersebut ke daerah yang tidak kondusif untuk bertahan hidup. Hal ini tidak menutup kemungkinan bisa saja ditemukan virus Dengue serotipe DEN-4 pada nyamuk A.aegypti jantan akibat pengaruh distribusi manusia. Kemungkinan lain adalah ditemukannya virus Dengue serotipe DEN-4 sebelumnya dan tetap ada sampai saat ini, hanya saja tidak ditemukan dalam penelitian menunjukkan bahwa saat ini hanya nyamuk A.aegypti jantan yang mengandung serotipe DEN-4 yang ada pada populasi di kota Medan. Namun kemungkinan keberadaan nyamuk A.aegypti betina yang mengandung virus Dengue serotipe DEN-4 tetap ada ke depannya terkait oleh masuknya arus distribusi manusia setiap harinya ke kota Medan.
virus Dengue serotipe DEN-4 dari 5 Kecamatan di kota Medan yang endemik DBD, menunjukkan bahwa endemik DBD yang ada di kota Medan selama ini kemungkinan besar berasal dari virus Dengue serotipe yang lain, yakni DEN-1 atau DEN-2 atau DEN-3 atau infeksi campuran antara ketida serotipe virus Dengue tersebut. Di samping itu, kemungkinan lainnya adalah sebagian nyamuk A.aegypti betina yang menjadi sampel dalam penelitian merupakan nyamuk yang baru berkembang dari larva menjadi dewasa dan belum menghisap darah, sehingga belum mengandung virus Dengue serotipe apapun. Dengan tidak ditemukannya virus Dengue serotipe DEN-4 pada sampel nyamuk A. aegypti betina di 5 Kecamatan endemik DBD di kota Medan dapat mewakili seluruh Kecamatan di kota Medan karena penelitian ini mencakup lima Kecamatan endemis DBD di kota Medan, sehingga penelitian ini juga dapat dijadikan sebagai awal dari penelitian virus Dengue pada nyamuk A.aegypti di kota Medan.
Dengue serotipe DEN-2 dan DEN-3 harus mendapat perhatian khusus karena umumnya menimbulkan gejala klinis DBD yang berat hingga SSD dan kematian.
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
V.1. Kesimpulan
Dari keseluruhan 100 sampel nyamuk A. aegypti betina yang dikumpulkan dari 5 Kecamatan endemik DBD di kota Medan, yaitu Medan Helvetia, Medan Amplas, Medan Selayang, Medan Baru dan Medan Sunggal dari rumah-rumah penduduk yang sedang dan atau pernah menderita DBD menurut data Puskesmas atau Dinas Kesehatan kota Medan dan telah dilakukan RT-PCR terhadap sampel, tidak ditemukan adanya virus Dengue serotipe DEN-4.
V.2. Saran
Dari hasil penelitian ini dimana tidak ditemukannya virus Dengue serotipe DEN-4 dapat dijadikan sebagai awal bahan masukan untuk perancangan peta penyebaran virus Dengue serotipe DEN-4 dari sampel nyamuk A.aegypti yang ada di Indonesia secara umum dan di kota Medan secara khusus.
DAFTAR PUSTAKA Arman, A.J.A. 2006, Statistika Penelitian Klinik. USU. Hal. 34.
Cesaire, R., Dussart, P., Lacoste, V. 2006, Reemergence of Dengue virus type 4, French Antilles and French Guaina, 2004-2005. Emerging Infectious Diseases. Cook, S., Bennett, S.N., Holmes, E.C. 2006. Isolation of a New Strain of the
Flavivirus Cell Fusing Agent Virus in a Natural Mosquito Population from Puerto Rico. DOI 10. pp 1-28.
Carrington, C.V.F., Foster, J.E., Pybus, O.G., 2005. Invasion and Maintenance of Dengue Virus Type 2 and Type 4 in the Americas. Journal of Virology; 79(23):14680-14687
Dengue Fever in Indonesia-update4, available from : http://www.who.int/csr/don/2004_05_11a/en/ downloaded on 26 September 2008.
de Castrol, M.G., Nogueira, R.M.R., Schatzmayr, H.G., 2004. Dengue Virus Detection by Using Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction in Saliva and Progeny of Experimentally Infected Aedes albopictus from Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, vol.99(8):809-814
Ginanjar, G., 2008. A Survival Guide. Edisi Pertama. Hal. 19-45. Mizan Media Utama. Bandung.
Hadinegoro, S.R.H., Soegijanto, S., Wuryadi, S., 2004. Tata Laksana Demam Berdarah Dengue di Indonesia. Departemen Kesehatan Republik Indonesia Direktorat Jenderal Pemberantasan Penyakit Menular dan Penyehatan Lingkungan. Hal. 1-12.
Hendarwanto, 1996. Dengue dalam : Waspadji, S., Rachman, A.M., Lesmana, L.A. Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam. Jilid I. Edisi Ketiga. Hal. 417-426. Balai Penerbit FKUI, Jakarta.
Harris, E., Roberts, T.G., Smith, L., 1998. Typing of Dengue Viruses in Clinical Specimens and Mosquitoes by Singel-Tube Multiplex Reverse Transcriptase PCR. Journal of Clinical Microbiology; 36(9): 2634-2639
2
Hariadhi, S., Soegijanto, S., 2006. Pola Distribusi Serotipe Virus Dengue pada Beberapa Daerah Endemik di Jawa Timur dengan Kondisi Geografis Berbeda dalam : Demam Berdarah Dengue. Hal. 11-19. Universitas Airlangga, Surabaya.
Kusumawati, L., 2005. Teori Sequential Infection dari Halstead, available from : http://www.library_usu.ac.id/download/fk/mikrobiologi/pdf downloaded on 26 August 2008.
Levinson, W., Jawetz, E., 2000. Medical Microbiology & Immunology. 6th ed. pp 252-256. Lange Medical Books/McGraw-Hill. San Fransisco.
Pasangan Basa, available from : http://en.wikipedia.org/wiki/pasangan_basa downloaded on 3 July 2008.
Purwanta, M., Lusida, M.I., Handajani, R., 1999. Polymerase Chain Reaction dalam : Putra, S.T. Biologi Molekuler Kedokteran. Edisi Pertama. Hal. 150-166. Airlangga University Press, Surabaya.
Peters, C.J., 2001. Infections Caused By Arthropod And Rodent-Borne Viruses In : Braunwald, E., Hauser, S.L., Fauci, A.S. Harrison’s Principles Of Internal Medicine. 15th ed. Vol. 1 pp 1161-1162. McGraw-Hill Inc. New York.
Roberts, L.S., Janovy, J., 2005. Foundations of Parasitology. 7th ed. pp 599-607. McGraw-Hill Inc. New York.
RT-PCR, available from : http://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcriptase_PCR downloaded on 30 April 2008.
Savage, H.M., Fritz, C.L., Rutstein, D., 1998. Epidemic of Dengue-4 Virus In Yap State, Federated States of Micronesia, and Implication of Aedes hensilli As an Epidemic Vector. Am.J.Trop.Med.Hyg; 58(4):519-524
Sopian,T., 2006. Aplikasi Teknologi PCR mendeteksi Flu Burung from : http://64.203.71.11/Kompas-cetak diunduh tanggal 25 April 2008.
Sukri, N.N., Laras, K., Wandra, T., 2003. Transmission of Epidemic Dengue Hemorrhagic Fever in Easternmost Indonesia. Am.J.Trop.Med.Hyg; 68(5):529-535
3
III. Edisi Keempat. Hal. 1731-1735. Pusat Penerbitan Departemen Ilmu Penyakit Dalam FKUI, Jakarta.
Sudjadi, 2008. Teknik Biologi Molekuler dalam : Bioteknologi Kesehatan. Cetakan pertama. Hal. 94-99. Penerbit Kanisius, Jakarta
.
Tim Penanggulangan DBD DepKes RI, 2004. Kasus Demam Berdarah Dengue (DBD) di Indonesia, Buletin Harian Tim Penanggulangan DBD Departemen Kesehatan R.I. Jakarta.
Wahono, T.D., 2004. Kajian Masalah Kesehatan Demam Berdarah Dengue. Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Departemen Kesehatan, Jakarta. Hal. 1-4.
