Penentuan Komponen Propolis Dengan Metode Gas Chromatography-Mass Spectrometry(Gc-Ms)

(1)

PENENTUAN KOMPONEN PROPOLIS DENGAN METODE

GAS CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY

(GC-MS)

SKRIPSI

OLEH:

GRACE MARGARETA SIMANGUNSONG

NIM 101501067

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

(2)

PENENTUAN KOMPONEN PROPOLIS DENGAN METODE

GAS CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY

(GC-MS)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara

OLEH:

GRACE MARGARETA SIMANGUNSONG

NIM 101501067

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

(3)

PENGESAHAN SKRIPSI

Dipertahankan dihadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara

Pada Tanggal: 23 Maret 2015

Disetujui oleh : Pembimbing I,

Prof. Dr.rer.nat. E. De Lux Putra, S.U., Apt. NIP 195306191983031001

Drs. Nahitma Ginting, M.Si., Apt. NIP 195406281983031002

(4)

iv

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa, karena limpahan rahmat

kasih dan karuniaNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini yang

berjudul ”Penentuan Komponen Propolis dengan metode Gas

Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)”. Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat

untuk memperoleh gelar sarjana farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas

Sumatera Utara.

Pada kesempatan ini, dengan segala kerendahan hati penulis

menyampaikan ucapan terima kasih kepada Bapak Prof. Dr. Sumadio

Hadisahputra, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara

yang telah memberikan fasilitas selama masa pendidikan. Bapak Prof. Dr.rer.nat.

Effendy De Lux Putra, S.U., Apt., dan Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si., Apt.,

selaku pembimbing yang telah memberikan waktu, bimbingan dan nasehat selama

penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini. Bapak Prof. Dr. Ginda Haro,

M.Sc., Apt., Bapak Drs. Nahitma Ginting, M.Si., Apt., dan Ibu Dra. Tuty Pardede,

M.Si., Apt., selaku dosen penguji yang memberikan masukan, kritik, arahan dan

saran dalam penyusunan skripsi ini. Ibu Dra., Lely Sari Lubis, M.Si., Apt., selaku

dosen penasehat akademik yang telah banyak membimbing penulis selama masa

perkuliahan hingga selesai serta Bapak dan Ibu staf pengajar Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara yang telah mendidik selama perkuliahan. Penulis juga

menyampaikan ucapan terima kasih kepada Bapak Prof. Dr. Aznan Lelo, PhD,

Sp.F yang telah berkontribusi dalam menyediakan sampel sediaan Propoelix HDI,

(5)

v

Penulis juga ingin mempersembahkan rasa terima kasih yang tak terhingga

kepada keluarga terkasih Ayahanda German Simangunsong dan Ibunda Martha

Siahaan, untuk kakak tersayang Febrina Simangunsong dan adik-adik tersayang

Grico Simangunsong dan Naomi Simangunsong, atas doa, dorongan semangat

dan pengorbanannya dengan tulus dan ikhlas, kelompok kecil the winners,

adik-adikku terkasih yang dipercayakanNya yaitu kelompok kecil Christall,

teman-teman pelayanan kebaktian muda-mudi kampung susuk (KMKS), Ayu Q,

Selpiana, Veronika, Kristiani, Rani, Prima, serta teman – teman Sains dan

Teknologi Farmasi 2010 yang selalu setia memberi doa, dorongan dan semangat.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak kekurangannya, oleh

karena itu sangat diharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari

semua pihak guna perbaikan skripsi ini. Akhir kata penulis berharap semoga

skripsi ini bermanfaat bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang farmasi.

Medan, Maret 2015 Penulis,

(6)

vi

PENENTUAN KOMPONEN PROPOLIS DENGAN METODE

GAS CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY (GC-MS)

ABSTRAK

Propolis adalah zat alami yang dikumpulkan oleh lebah madu dari berbagai getah, tunas pepohonan dan tanaman yang kemudian dicampur dengan air liur lebah untuk melindungi sarangnya dari gangguan binatang lain. Komponen kimia propolis sangat kompleks yang terdiri dari lilin, getah, minyak atsiri, asam amino, gula, dan berbagai senyawa metabolit sekunder tergantung oleh sumber tanaman yang tersedia untuk lebah madu tersebut. Kuantitas dan kualitas komponen kimia propolis dipengaruhi oleh ekosistem dan asal tanaman resin. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui komponen-komponen apa saja yang terkandung dari beberapa jenis propolis dan mengetahui perbedaan kandungan dari komponennya.

Komponen-komponen propolis ditentukan dengan metode GC-MS setelah diderivatisasi dengan sililasi. Kromatografi kolom yang digunakan yaitu kolom kapiler HP5MS dengan tipe alat GC-MS QP 2010 S. Jenis propolis dikumpulkan dari beberapa merek berbeda yaitu, Melia propolis, Platinum propolis, Propoelix® HDI, Propoelix® PlusHDI, HD Bee Propolis, dan propolis mentah yang diperoleh dari daerah Sragen, jawa tengah.

Hasil analisis dari keenam jenis propolis yang ditentukan mengandung komponen senyawa kimia yang bervariasi. Kandungan propolis yang bervariasi dari keenam jenis propolis menunjukkan bahwa propolis berasal dari lebah madu dari tumbuhan yang berbeda dan tergantung dengan lokasi geografisnya. Komponen senyawa yang teridentifikasi dalam propolis tersebut adalah senyawa alifatis yang terdiri dari berbagai turunan senyawa asam lemak, senyawa gula dan gula alkohol serta senyawa aromatis dan terpen.

(7)

vii

DETERMINATION OF COMPONENTS OF PROPOLIS

SAMPLES BY GAS CHROMATOGRAPHY-MASS

SPECTROMETRY (GC-MS) METHOD

ABSTRACT

Propolis is a natural product collected by honeybees from various resin, buds of trees and plants were then mixed with saliva to protect the nests of other animal disorders. Propolis is complex product and its chemical constituens include waxes, resins, balsams, essential oils, amino acids, sugars and various secondary metabolites, the composition depending on the botanical sources available to the honeybees. Quantity and quality of the chemical components is affected by geographic origin and the ecosystem (plant source). This study was purpose to identify the chemical composition of several different propolis.

The component in propolis were analysed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) after prepared for GC-MS by derivatization using silylation reaction. The chromatographic column for the analysis was done by the HP5MS capillary column with GC-MS type QP 2010 S. Propolis samples collected from several different brands, namely, Melia propolis, Platinum propolis, Propoelix® HDI, Propoelix® Plus HDI, HD Bee Propolis and raw propolis obtained from Sragen, Central Java.

The result of GC-MS analysis of six types propolis contains chemical compounds varying component. Propolis contains compounds beneficial to the body. The variability of constituents of propolis in six samples showed that they were collected by the honeybee from different plants depending on the geographic location. The following component compounds were identified in the propolis sample are aliphatic compounds consisting of various compounds derived fatty acids , sugars and sugar alcohols and aromatic compounds and terpene.

(8)

iv

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Propolis ... 5

2.1.1 Kenali fisik propolis ... 5

2.1.2 Komposisi dan Nutrisi Propolis ... 6

2.1.3 Kriteria Mutu Propolis mentah ... 7

2.2 Madu ... 8

(9)

v

2.4 Senyawa Fenol ... 8

2.4.1 Flavonoid ... 9

2.5 Gula dan gula alkohol ... 10

2.6 Teknologi Ekstraksi ... 12

2.7 Kromatografi Gas – Spektrometri Massa ... 13

2.7.1 Sistem peralatan ... 14

2.7.2 Prisnsip Kromatografi Gas-Spektrometri Massa ... 14

2.7.3 Instrumentasi Alat ... 15

2.7.3.5.1 Spektrometri massa sebagai detektor ... 18

2.8 Derivatisasi pada Kromatografi Gas ... 19

BAB III METODE PENELITIAN ... 22

(10)

vi

4.2.1 Spektrometri Massa Komponen Ekstrak Etanol Propolis (EEP) mentah sragen ... 41

4.2.2 Spektrometri Massa Komponen Sediaan Propolis Melia... 42

4.2.3 Spektrometri Massa Komponen Sediaan Propolis Platinum ... 42

4.2.4 Spektrometri Massa Komponen Sediaan Propoelix HDI ... 43

4.2.5 Spektrometri Massa Komponen Sediaan Propoelix Plus ... HDI ... 44

(11)

vii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 Komposisi Kimia Propolis ... 6

Tabel 2.2 Klasifikasi senyawa fenolik berdasarkan jumlah atom

karbon ... 9

Tabel 2.3 Monosakarida dan turunannya gula alkohol ... 11

Tabel 4.1 Komposisi kimia, waktu tambat, SI dan kadar komponen Ektrak etanol propolis yang dianalisis dengan GC-MS ... 29

Tabel 4.2 Komposisi kimia, waktu tambat, SI dan kadar komponen sediaan propolis Melia yang dianalisis dengan GC-MS ... 31

Tabel 4.3 Komposisi kimia, waktu tambat, SI dan kadar komponen sediaan propolis Platinum yang dianalisis dengan GC-MS. .. 33

Tabel 4.4 Komposisi kimia, waktu tambat, SI dan kadar komponen sediaan HDI Propoelix® yang dianalisis dengan GC-MS ... 35

Tabel 4.5 Komposisi kimia, waktu tambat, SI dan kadar komponen sediaan HDI Propoelix® Plus yang dianalisis dengan GC-MS ... 37

Tabel 4.6 Komposisi kimia, waktu tambat, SI dan kadar komponen sediaan HD Bee Propolis yang dianalisis dengan GC-MS ... 39

Tabel 4.7 Komposisi kimia dari Sampel propolis mentah asal Sragen

(12)

viii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Diagram Blok Kromatografi Gas-Spektrometry Massa ... 14

Gambar 2.2 Struktur BSTFA dan reaksi sililasi ... 21

Gambar 4.1 Kromatogram komponen ekstrak etanol propolis asal sragen ... 28

Gambar 4.2 Kromatogram komponen Melia Propolis ... 30

Gambar4.3 Kromatogram komponen propolis platinum ... 32

Gambar 4.4 Kromatogram komponen Propoelix HDI ... 34

Gambar 4.5 Kromatogram komponen Propoelix plus HDI ... 36

Gambar 4.6 Kromatogram komponen Bee Propolis HD ... 38

Gambar 4.7 Rumus bangun senyawa Eritritol tms ... 46

Gambar 4.8 Spektrum massa puncak sampel dengan Rt 5,054 ... 47

Gambar 4.9 Spektrum massa puncak data library Eritritol per tms ... 47

Gambar 4.10 Rumus bangun dari senyawa asam pentadekanoat ... 48

Gambar 4.12 Spektrum massa puncak data library asam pentadekanoat . 48 Gambar 4.13 Rumus bangun senyawa metil oleat ... 49

Gambar 4.15 Spektrum massa puncak data library metil ester metil oleat 49

Gambar 4.16 Rumus bangun senyawa maltosa-oktatms ... 50

Gambar 4.18 Spektrum massa puncak data library maltosa ... 52

Gambar 4.19 Rumus bangun senyawa xylitol pentatms ... 53

(13)

ix

Gambar 4.21 Spektrum massa puncak data library xylitol 5tms ... 53

Gambar 4.22 Rumus bangun senyawa Sukrosa-oktatms ... 54

(14)

x

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Gambar kromatogram dari ekstrak etanol propolis Sragen ... 66

Lampiran 2. Spektrum massa dari puncak dengan waktu tambat 5,054 .. menit ... 67

Lampiran 5. Spektrum massa dari puncak dengan waktu tambat 10,170 menit ... 68

Lampiran 6. Spektrum massa dari puncak dengan waktu tambat 10,479. menit ... 68

(15)

xi

menit ... 71

Lampiran 19. Gambar kromatogram dari propolis Melia ... 73

Lampiran 26. Gambar Kromatogram dari propolis Platinum ... 76

(16)

xii

Lampiran 32. Gambar kromatogram dari sediaan HDI Propoelix®Plus ... 79

Lampiran 34. Spektrum massa dari puncak dengan waktu tambat 5,248 menit ... .... 80

Lampiran 44. Gambar kromatogram dari sediaan HDI ... 84

Lampiran 45. Spektrum massa dari puncak dengan waktu tambat 3,478

menit ... 85

(17)

xiii

Lampiran 53. Gambar kromatogram dari sediaan Bee Propolis HD ... 88

(18)

xiv

menit ... 92

Lampiran 66. Sertifikat analisis BSTFA termasuk 1% TMCS ... 93

Lampiran 67. Alat Gas Chromatography – Mass Spectra ... 94

Lampiran 68. Preparasi sampel analisis ... 94

Lampiran 69. Vial berwarna gelap untuk pemanasan sampel saat ... preparasi ... 95

Lampiran 70. Pelarut BSTFA termasuk 1% TMCS ... 95

Lampiran 71. Propolis mentah ... 96

Lampiran 72. Propolis mentah yang telah diiris tipis ... 96

Lampiran 73. Ekstrak Etanol Propolis asal Sragen ... 97

Lampiran 74. Penguapan filtrat menggunakan Rotary evaporator vakum 97

Lampiran 75. Freeze dryer ... 98

Lampiran 76. Ekstrak etanol propolis (EEP) pekat ... 98

Lampiran 77. Sediaan-sediaan propolis bermerek yang digunakan ... 100

(19)

vi

PENENTUAN KOMPONEN PROPOLIS DENGAN METODE

GAS CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY (GC-MS)

ABSTRAK

Propolis adalah zat alami yang dikumpulkan oleh lebah madu dari berbagai getah, tunas pepohonan dan tanaman yang kemudian dicampur dengan air liur lebah untuk melindungi sarangnya dari gangguan binatang lain. Komponen kimia propolis sangat kompleks yang terdiri dari lilin, getah, minyak atsiri, asam amino, gula, dan berbagai senyawa metabolit sekunder tergantung oleh sumber tanaman yang tersedia untuk lebah madu tersebut. Kuantitas dan kualitas komponen kimia propolis dipengaruhi oleh ekosistem dan asal tanaman resin. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui komponen-komponen apa saja yang terkandung dari beberapa jenis propolis dan mengetahui perbedaan kandungan dari komponennya.

Komponen-komponen propolis ditentukan dengan metode GC-MS setelah diderivatisasi dengan sililasi. Kromatografi kolom yang digunakan yaitu kolom kapiler HP5MS dengan tipe alat GC-MS QP 2010 S. Jenis propolis dikumpulkan dari beberapa merek berbeda yaitu, Melia propolis, Platinum propolis, Propoelix® HDI, Propoelix® PlusHDI, HD Bee Propolis, dan propolis mentah yang diperoleh dari daerah Sragen, jawa tengah.

Hasil analisis dari keenam jenis propolis yang ditentukan mengandung komponen senyawa kimia yang bervariasi. Kandungan propolis yang bervariasi dari keenam jenis propolis menunjukkan bahwa propolis berasal dari lebah madu dari tumbuhan yang berbeda dan tergantung dengan lokasi geografisnya. Komponen senyawa yang teridentifikasi dalam propolis tersebut adalah senyawa alifatis yang terdiri dari berbagai turunan senyawa asam lemak, senyawa gula dan gula alkohol serta senyawa aromatis dan terpen.

(20)

vii

DETERMINATION OF COMPONENTS OF PROPOLIS

SAMPLES BY GAS CHROMATOGRAPHY-MASS

SPECTROMETRY (GC-MS) METHOD

ABSTRACT

Propolis is a natural product collected by honeybees from various resin, buds of trees and plants were then mixed with saliva to protect the nests of other animal disorders. Propolis is complex product and its chemical constituens include waxes, resins, balsams, essential oils, amino acids, sugars and various secondary metabolites, the composition depending on the botanical sources available to the honeybees. Quantity and quality of the chemical components is affected by geographic origin and the ecosystem (plant source). This study was purpose to identify the chemical composition of several different propolis.

The component in propolis were analysed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) after prepared for GC-MS by derivatization using silylation reaction. The chromatographic column for the analysis was done by the HP5MS capillary column with GC-MS type QP 2010 S. Propolis samples collected from several different brands, namely, Melia propolis, Platinum propolis, Propoelix® HDI, Propoelix® Plus HDI, HD Bee Propolis and raw propolis obtained from Sragen, Central Java.

The result of GC-MS analysis of six types propolis contains chemical compounds varying component. Propolis contains compounds beneficial to the body. The variability of constituents of propolis in six samples showed that they were collected by the honeybee from different plants depending on the geographic location. The following component compounds were identified in the propolis sample are aliphatic compounds consisting of various compounds derived fatty acids , sugars and sugar alcohols and aromatic compounds and terpene.

(21)

1 BAB I

PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang

Menurut Zulkifli, et al., (2013), beberapa tahun terakhir propolis menjadi

perbincangan baik dikalangan peneliti maupun masyarakat umum, karena

manfaatnya yang mulai tereksplorasi dengan baik. Penelitian yang semakin luas

terhadap propolis menunjukkan betapa produk lebah ini menyimpan potensi yang

luar biasa sebagai bahan obat alami.

Kata propolis berasal dari bahasa Yunani, yaitu pro berarti pertahanan dan

polis berarti kota, sehingga propolis bermakna pertahanan kota (atau sarang

lebah). Propolis atau lem lebah adalah nama umum yang diberikan untuk bahan

resin yang dikumpulkan oleh lebah madu dari berbagai macam jenis tumbuhan,

terutama dari bagian kuncup dan daun tumbuhan tersebut. Lebah kemudian

mencampur bahan resin ini dengan saliva dan berbagai enzim dalam lebah

sehingga menghasilkan resin baru yang disebut propolis. Bahan tersebut

kemudian digunakan lebah untuk melindungi sarangnya dari gangguan binatang

lain (Haile dan Dekebo, 2013; Greenway, et al., 1988).

Propolis sudah digunakan sejak 300 sebelum masehi sebagai obat untuk

menyembuhkan kulit yang luka karena mempunyai efek antiinflamasi. Propolis

juga saat ini telah banyak digunakan di berbagai bidang termasuk industri

kosmetik. Penelitian secara intensif untuk propolis ini sebenarnya telah dimulai

sejak tahun 1980-an. Masyarakat pada umumnya menganggap propolis sebagai

suplemen karena kandungan zat gizi mikro yang kompleks didalamnya, namun

(22)

2

dimanfaatkan sebagai terapi farmakologis karena mengandung antibiotik alami

dan zat-zat lain yang bermanfaat bagi pengobatan (Lofty, 2006; Zulkifli, et al.,

2013).

Banyak penemuan yang telah mengungkapkan sifat propolis, yakni

sebagai bahan antibakteri, antivirus, dan antifungi dan pengobatan untuk berbagai

jenis penyakit yang lain. Propolis dinyatakan memiliki sifat desinfektan

(antibakteri) yang berperan membunuh semua kuman yang masuk ke sarang

lebah, dan melindungi semua yang ada didalam sarang tersebut dari serbuan

kuman, virus, atau bakteri. Sifat desinfektan ini terbukti, ketika pada tahun 1963,

ditemukan seekor tikus dalam sarang lebah dan dalam keadaan tidak membusuk,

meskipun telah mati selama kurang lebih 5 tahun dan mummy lebah didalam

sarangnya selama ribuan tahun yang dan tidak membusuk atau hancur (Kariim,

2006).

Propolis merupakan salah satu sumber zat gizi alami dan nutraseutikal.

Berdasarkan literatur, propolis mengandung resin, flavonoid, mineral dan vitamin,

pollen, asam amino, aromatic ester, terpen, CAPE (caffeic acid phenylethyl ester).

Propolis merupakan senyawa kompleks yang terdiri dari 55% resin, 30% lilin

lebah, 10% minyak aromatic dan 5% bee pollen. Propolis mengandung semua

vitamin kecuali vitamin K, semua mineral yang dibutuhkan kecuali sulfur, enam

belas asam amino esensial yang dibutuhkan untuk regenerasi sel, bioflavonoid

yaitu zat antioksidan sebagai suplemen sel (Sarsono, et al., 2012).

Selain propolis yang diambil langsung dari sarang lebahnya, kini propolis

(23)

3

propolis dalam bentuk cair. Beberapa jenis propolis juga dikombinasi dengan

madu (Sarsono, et al., 2012).

Gas Chromatography-Mass Spectrometry atau yang disingkat dengan

GC-MS merupakan metode pemisahan senyawa organik yang menggunakan dua

metode analisis senyawa yaitu kromatografi gas (GC) untuk menganalisis jumlah

senyawa secara kuantitatif dan spektrometri massa (MS) untuk menganalisis

struktur molekul dan fragmentasi senyawa analit. Paduan keduanya dapat

menghasilkan data yang lebih akurat dalam pengidentifikasian senyawa yang

dilengkapi dengan struktur molekulnya. Dengan hadirnya teknik modern GC-MS,

banyak senyawa kimia telah diidentifikasi dan diisolasi dalam propolis (Haile dan

Dekebo, 2013).

Berdasarkan hal tersebut diatas, peneliti tertarik untuk mengetahui

senyawa-senyawa yang terkandung dalam propolis bermerek maupun propolis

mentah yang diambil langsung dari sarang lebahnya. Peneliti melakukan

pemeriksaan yang meliputi penentuan komponen yang terdapat dalam propolis

mentah maupun propolis bermerek yang beredar dipasaran secara GC-MS.

1.2 Perumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang diatas, maka perumusan masalah pada

penelitian ini adalah:

1. Komponen-komponen senyawa apakah yang terkandung dalam beberapa

jenis propolis?

2. Apakah terdapat perbedaan jumlah kandungan maupun komponen dari

(24)

4 1.3 Hipotesis

Berdasarkan perumusan masalah diatas maka hipotesisnya adalah:

1. Propolis mengandung komponen-komponen senyawa yang kompleks.

2. Terdapat perbedaan komponen maupun jumlah kandungan dalam beberapa

jenis propolis.

1.4 Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah:

1. Untuk mengetahui komponen senyawa yang terkandung dalam beberapa

jenis propolis.

2. Untuk mengetahui perbedaan komponen maupun jumlah kandungan

senyawa dalam beberapa jenis propolis.

1.5 Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang

komponen senyawa-senyawa yang terkandung dalam propolis dan meningkatkan

pengetahuan masyarakat tentang sediaan propolis bermerek yang dijual dipasaran,

membandingkan isinya serta mengetahui kandungan propolis tersebut yang

(25)

5 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Propolis

Propolis adalah senyawa kompleks yang digunakan lebah untuk

melindungi sarangnya. Lebah menggunakan bahan propolis untuk pertahanan

sarang, mengkilatkan bagian dalam sarang dan menjaga suhu lingkungan sarang.

Zat-zat yang ada pada propolis dikumpulkan oleh lebah dari pucuk dan berbagai

tanaman yang ada dihutan tempat tinggalnya (Zulkifli, et al., 2013).

2.1.1 Kenali fisik propolis

Propolis tersusun dari bahan resin yang diambil lebah dari pohon yang

mengandung getah. Lebah trigona kemudian mengolahnya sehingga membentuk

propolis, benda berwarna hitam, kuning, atau cokelat tua disarang. Warna itu

tergantung pada pohon asal resin. Di Indonesia, umumnya yang dijumpai hanya

hitam, cokelat, dan krem. Di Brazil dan Argentina dijumpai propolis hijau dan

merah tetapi rasanya sama seperti yang lokal. Pada suhu 25oC - 40oC propolis

berbentuk padat yang lembut, lentur, dan sangat lengket. Karena itulah ia

dimanfaatkan trigona sebagai bahan perekat disarang. Bila suhu kurang dari 15oC,

ia akan menjadi padat tetapi rapuh. Benda ini tetap rapuh bahkan setelah suhu

ditingkatkan diatas 45oC. Namun, sifatnya menjadi semakin lengket dan bergetah.

Biasanya propolis akan menjadi cair pada suhu 60oC - 70oC, meski kadang

(26)

6 2.1.2 Komposisi dan nutrisi propolis

Kandungan nutrisi propolis yang lebih detail diungkapkan Prof Dr

Mustofa Mkes Apt. Kepala Bagian Farmakologi dan Toksikologi Fakultas

Kedokteran Universitas Gadjah Mada membuktikan propolis memiliki banyak

khasiat karena ia mengandung lebih dari 180 unsur fitokimia. Beberapa

diantaranya adalah flavonoid dan berbagai turunan asam orbanat, fitosterol, dan

terpenoids. Zat-zat itu terbukti memiliki sifat anti infalamantori, antimikrobial,

antihistamin, antimutagenik, dan antialergi. Flavonoid bersifat antioksidan yang

dapat mencegah infeksi serta turut menumbuhkan jaringan (Trubus, 2010).

Propolis dapat dimanfaatkan sebagai bahan kosmetik dan obat-obatan.

Menurut Wade (2005), propolis mengandung senyawa kompleks, vitamin,

mineral, enzim, senyawa fenolik dan flavonoid. Tabel 2.1 di bawah ini

menjelaskan mengenai komposisi kimia propolis.

Tabel 2.1 Komposisi Kimia Propolis (Krell, 1996).

Komponen Konsentrasi Grup komponen

Resin 45-55% Flavonoid, asam fenolat dan esternya

Lilin dan asam lemak 25-35% Sebagian besar dari lilin lebah

Minyak esensial 10% Senyawa volatile

Protein 5% Protein kemungkinan berasal dari

pollen dan amino bebas

Senyawa organik lain dan mineral

5% 14 macam mineral yang paling

terkenal adalah Fe dan Zn, sisanya seperti Au, Ag, Hg.

(27)

7

Menurut penelitian propolis mengandung bioflavanoid yaitu zat

antioksidan sebagai suplemen sel, kandungan bioflavanoid pada satu tetes

propolis setara dengan bioflavanoid yang dihasilkan 500 buah jeruk. Oleh

Lembaga Riset Kanker Columbia, 1991: dalam propolis terdapat zat CAPE

(caffeic acid phenylethyl ester) yang berfungsi untuk membantu mematikan sel

kanker, dengan pemakaian secara teratur selama 6 bulan dapat mereduksi sel

kanker sebanyak 50% .

2.1.3 Kriteria mutu propolis mentah

Hingga kini, Standar Nasional Indonesia (SNI) belum mengeluarkan

standar mutu propolis mentah yang diperdagangkan di Indonesia. Namun

berdasarkan transaksi di lapangan, kriteria mutu propolis mentah sangat

sederhana, itupun belum ada kesepakatan tingkatan mutunya. Biasanya,

penampung atau perusahaan pembeli propolis mentah memiliki kriteria tersendiri

dalam penentuan mutu propolis. Termasuk soal harganya. Namun, untuk

memperoleh propolis mentah yang murni dari Trigona sangat sulit. Pasti

tercampur dengan bahan lainnya (Mahani, et al., 2011).

2.1.4 Sediaan propolis di pasaran

Propolis di pasaran telah tersedia dalam berbagai bentuk formula berupa

kapsul, bubuk, dan propolis dalam bentuk cair. Beberapa jenis propolis juga

dibuat dikombinasikan dengan madu. Sediaan propolis tersedia dalam bentuk cair

6 mL dan 10 mL dengan berbagai merek yang telah dilengkapi dosis yang ada

pada buku petunjuk penggunaan. Kehalalan dan keamanan propolis bisa

dibuktikan dengan adanya izin yang tercantum dari Balai Pengawasan Obat dan

(28)

8

2.2 Madu

Madu adalah sekresi yang dihasilkan oleh lebah Apis mellifera L. Selain

menghasilkan madu, lebah juga dapat menghasilkan malam. Nektar bunga

mengandung banyak sukrosa. Sukrosa diubah menjadi gula invert dengan bantuan

enzim yang terdapat pada saliva. Bila madu dilihat dibawah mikroskop masih

diketemukan butir-butir serbuk sari. Madu merupakan campuran ekuimolar antara

dekstrosa dan fruktosa yang dikenal sebagai gula invert sebanyak 50-90% dan air.

Madu juga mengandung 0,1-10% sukrosa dan sejumlah kecil karbohidrat, minyak

atsiri, pigmen, serta bagian tanaman terutama serbuk sari (Sirait, 2007).

2.3 Resin

Nama resin/harsa dipakai secara tidak seragam. Kadang-kadang dipakai

untuk campuran senyawa yang tidak dapat diidentifikasi, tidak dapat

diekstraksi,yang tertinggal hanya massa yang lengket ketika bahan penyari

diuapkan (sisa seperti resin yang lengket). Resin yang sebenarnya adalah hasil

ekstraksi tanaman yang secara kimia merupakan campuran asam organik, ester,

dan alkohol yang amorf atau sukar dikristalkan. Sifat selanjutnya adalah tidak

larutnya resin dalam air, kelarutannya yang baik dalam pelarut organik, dan

meleleh pada suhu yang relatif rendah (Sirait, 2007).

2.4 Senyawa Fenol

Senyawa fenolik merupakan senyawa yang banyak ditemukan pada

tumbuhan. Fenolik memiliki cincin aromatik satu atau lebih gugus hidroksi (OH−)

(29)

9

senyawa induknya, fenol. Senyawa fenol kebanyakan memiliki gugus hidroksil

lebih dari satu sehingga disebut polifenol (Anonim, 2012).

Senyawa fenolik meliputi aneka ragam senyawa yang berasal dari

tumbuhan yang mempunyai ciri sama, yaitu cincin aromatik yang mengandung

satu atau dua gugus OH−. Senyawa fenolik di alam terdapat sangat luas,

mempunyai variasi struktur yang luas, mudah ditemukan di semua

tanaman, daun, bunga dan buah. Ribuan senyawa fenolik alam telah diketahui

strukturnya, antara lain flavonoid, fenol monosiklik sederhana, fenil

propana, polifenol (lignin, melanin, tannin), dan kuinon fenolik (Anonim, 2012).

Tabel 2.2 Klasifikasi senyawa fenolik berdasarkan jumlah atom karbon

Struktur Kelas

C6 Fenolik sederhana

C6 - C1 Asam fenolat dan senyawa yang berhubungan lainnya

C6 – C2 Asetofenon dan asam fenilasetat

C6 – C3 Asam sinamat, sinamil aldehid, sinamil alkohol

C6 – C3 Koumarin, Isokoumarin, dan kromon

C15 Kalkon,Auron, dihidrokalkon

C15 Flavan

Lignan, neolignan Dimer atau oligomer

Lignin Polimer

Tanin Oligomer atau Polimer Phlobaphene Polimer

(30)

10 2.4.1 Flavonoid

Golongan flavonoid dapat digambarkan sebagai deretan senyawa C6-C3

-C6. Artinya, kerangka karbonnya terdiri atas dua gugus C6 (cincin benzena

tersubstitusi) disambungkan oleh rantai alifatik tiga karbon (Sirait, 2007;

Robinson, 1995).

Beberapa kemungkinan fungsi flavonoid untuk tumbuhan yang

mengandungnya ialah pengaturan tumbuh, pengaturan fotosintesis, kerja

antimikroba dan antivirus, dan kerja terhadap serangga. Efek flavonoid terhadap

berbagai macam organisme sangat banyak macamnya dan dapat menjelaskan

mengapa tumbuhan yang mengandung flavonoid dipakai dalam pengobatan

tradisional. Flavonoid merupakan senyawa pereduksi yang menghambat banyak

reaksi oksidasi (sebagai antioksidan) (Robinson, 1995).

2.5 Gula dan gula alkohol

Gula alkohol atau poliol didefinisikan sebagai turunan sakarida yang

gugus keton atau aldehidnya diganti dengan gugus hidroksil. Poliol adalah

pemanis bebas gula. Poliol adalah karbohidrat tetapi bukan gula. Secara kimia,

poliol disebut alkohol polihidrat atau gula alkohol karena bagian dari struktur

poliol mernyerupai gula dan bagian ini mirip dengan alkohol. Tetapi pemanis

bebas gula ini bukan gula dan juga bukan alkohol. Poliol diturunkan dari

karbohidrat yang gugus karbonilnya (aldehid atau keton, gula pereduksi) direduksi

menjadi gugus hidroksi primer atau sekunder. Poliol mempunyai rasa dan

kemanisan hampir sama dengan gula tebu (sukrosa), bahkan beberapa jenis lebih

manis. Poliol diturunkan dari gula tetapi tidak dimetabolisme seperti halnya

(31)

11

1. Makanan yang ditambahkan poliol kalorinya lebih rendah dan bebas gula

daripada makanan yang tidak ditambah poliol

2. Rasa poliol seperti gula pada umumnya (gula tebu atau sukrosa)

3. Kalorinya lebih rendah daripada gula

4. Tidak menyebabkan kerusakan gigi

5. Menurunkan respon insulin

Gula alkohol diklasifikasikan berdasarkan jumlan unit sakarida yang terdapat

ndalam molekul. Berikut adalah gula alkohol turunan monosakarida.

Tabel 2.3 Monosakarida dan turunanny gula alkohol

Gula Gula alkohol

D-Gliseraldehida Gliserol

D-eritrosa Eritritol

D-xylulosa dan L-xylulose Xylitol D-xylulosa dan D-ribulosa D-arabitol

L-ribulosa dan D-ribulosa Ribitol (adonitol) D-glukosa, L-sorbose, dan D-fruktosa D-sorbitol (D-glucitol)

L-sorbose L-iditol

D-fruktosa D-mannitol

D-Sorbitol digunakan oleh penderita diabetes sebagai pengganti gula.

Xylitol meningkatkan aktivitas neutrofil (sel darah putih) untuk melawan infeksi.

Myo-inositol disebut juga vitamin B8 dan memilik banyak manfat kesehatan.

Yaitu untuk transduksi sinyal insulin, penggabungan cytoskeleton, pengendalian

syaraf, pengendalian konsentrasi kalsium dalam sel, pemeliharaan membran sel,

modulasi aktivitas serotonin, penghancur lemak, mengurangi kadar kolesterol

dalam darah, penanda plasma sifat keturunan, pencegah bulimia, kepanikan dan

(32)

12

manfaat penghancur lemak dan penurun kolesterol darah tersebut, inositol

menjadi bagian penting dalam diet (Luckner, 1984).

2.6 Teknologi Ekstraksi

Propolis dalam bentuk mentah (raw propolis) belum bisa dimanfaatkan

khasiatnya karena masih terselimuti dengan berbagai bahan. Komponen aktifnya

harus dipisahkan dan dikeluarkan dengan cara ekstraksi. Hingga kini belum ada

standarisasi tentang konsentrasi, metode ekstraksi, dan jenis pelarut yang akan

dipakai. Cara ekstraksi yang paling umum adalah menggunakan pelarut organik

(Mahani, et al., 2011).

Proses ekstraksi yang baik adalah polaritas pelarut sesuai dengan polaritas

propolis, pelarut mudah diuapkan/dipisahkan, suhu penguapan/pemisahan tidak

merusak propolis dan kedap udara untuk menghindari kerusakan akibat oksidasi.

Pelarut yang bersifat semi polar yang populer adalah etanol. Pelarut ini paling

umum digunakan untuk mengekstrak komponen aktif dari bahan alam, termasuk

untuk mengekstrak propolis. Pelarut ini memiliki sejumlah kelebihan yaitu

komponen yang terbawa berasal dari golongan polar dan non polar sekaligus

sehingga komponen yang terbawa lebih banyak dan beragam. Selain itu, potensi

khasiat propolis yang dihasilkan lebih baik. Pelarut ini juga mudah diuapkan

sehingga kemungkinan masih tertinggal sangat kecil. Artinya, propolis yang

dihasilkan benar-benar bebas pelarut (Mahani, et al., 2011).

Beberapa metode ekstraksi dengan menggunakan pelarut yaitu cara dingin

(maserasi, perkolasi) dan cara panas (refluks, digesti, sokletasi dan infundasi).

Untuk ekstraksi propolis, pada umumnya menggunakan cara dingin karena

(33)

13

etanol dan air dilakukan dengan cara maserasi atau perkolasi. Metode maserasi

adalah proses penyarian simplisia dengan cara perendaman menggunakan pelarut

dengan sesekali pengadukan pada temperatur kamar. Maserasi yang dilakukan

dengan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan terhadap

maserat pertama dan seterusnya disebut remaserasi (Depkes, 2000; Ditjen POM,

1979).

2.7 Kromatografi Gas – Spektrometri Massa

Kromatografi gas (KG) merupakan teknik instrumental yang dikenalkan

pertama kali pada tahun 1950-an. Dalam metode kromatografi gas , yang sangat

menentukan kehandalan metode ini adalah instrumennya sendiri yang dikenal

sebagai kromatografi gas. KG merupakan metode yang dinamis untuk pemisahan

dan deteksi senyawa organik yang mudah menguap dan

senyawa-senyawa gas anorganik dalam suatu campuran. Perkembangan teknologi yang

signifikan dalam bidang elektronik, komputer, dan kolom telah menghasilkan

batas deteksi yang lebih rendah serta identifikasi senyawa menjadi lebih akurat

melalui teknik analisis dengan resolusi yang meningkat (Rohman, 2009).

Spektrometri massa adalah alur kelimpahan (abundance) jumlah relatif

fragmen bermuatan positif berlainan versus massa per muatan (m/z atau m/e) dari

fragmen tersebut. Muatan ion dari kebanyakan partikel yang dideteksi dalam

spektrometer massa adalah +1; maka nilai m/z sama dengan massa molekulnya

(M). Bagaimana suatu molekul atau ion pecah menjadi fragmen - fragmennya

bergantung pada kerangka karbon dan gugus fungsional yang ada. Oleh karena

(34)

14

induknya. Juga seringkali untuk menentukan bobot molekul suatu senyawa dari

spektrum massanya (Supratman, 2010).

2.7.1 Sistem peralatan kromatografi gas–spektrometri massa

Bagian-bagian yang terpenting dari sebuah kromatografi Gas–

Spektrometri Massa, menurut meliputi :

Gambar 2.1_{Diagram Blok}_{Kromatografi Gas–Spektrometri Massa}

(Sumber: Anonim, 2011).

2.7.2 Prinsip Kromatografi Gas–Spektrometri Massa

Menurut Watson (2005), prinsip-prinsip alat Kromatografi Gas–

Spektrometri Massa tersebut yaitu:

- Injeksi sampel dapat dilakukan secara manual atau menggunakan pengambil

sampel otomatis melalui sekat karet yang dapat tertutup kembali.

- Sampel tersebut diuapkan pada bagian portal injeksi yang dipanaskan dan

mengalami kondensasi pada bagian atas kolom

- Kolom dapat berupa kolom kapiler atau kolom terkemas, yang akan dibahas

lebih mendalam. Fase gerak yang digunakan untuk membawa sampel

(35)

15

- Kolom ditutup dalam suatu oven yang dapat diatur pada suhu antara suhu

kamar dan lebih kurang 400oC

- Detektor yang digunakan adalah spektrometri massa (MS)

- Sampel dimasukkan kedalam sumber instrumen dengan memanaskannya pada

akhir suatu sensor sampai menguap airnya, dibantu dengan keadaan sangat

hampa dalam instrumen tersebut

- Jika berada dalam fase uap, analit dibombardir dengan elektron-elektron yang

dihasilkan oleh filamen rhenium atau tungsten, yang diakselerasi menuju suatu

target positif dengan energi sebesar 70 eV.

- Dua jenis sistem biasanya digunakan untuk memisahkan ion-ion berdasarkan

perbandingan muatan terhadap massanya.

Prinsip dasar kromatografi Gas melibatkan volatilisasi atau penguapan

sampel dalam inlet injektor, pemisahan komponen-komponen dalam campuran,

dan deteksi tiap komponen dengan detektor. Pemisahan pada kromatografi gas

didasarkan pada titik didih suatu senyawa dikurangi dengan semua interaksi yang

mungkin terjadi antara solut dan fase diam. Fase gerak yang berupa gas akan

mengelusi solut dari ujung kolom lalu menghantarkannya ke detektor.

Penggunaan suhu yang meningkat (biasanya pada kisaran 50oC - 350oC) bertujuan

untuk menjamin bahwa solut akan menguap dan karenanya akan cepat terelusi

(Gandjar dan Rohman, 2007).

2.7.3 Instrumentasi alat

2.7.3.1 Fase gerak

Fase gerak pada kromatografi gas juga disebut dengan gas pembawa

(36)

16

pembawa tidak berpengaruh pada selektifitas. Syarat gas pembawa adalah: tidak

reaktif, murni/kering karena kalau tidak murni akan berpengaruh pada detektor,

dan dapat disimpan dalam tangki tekanan tinggi (Rohman, 2009).

2.7.3.2 Ruang suntik sampel

Lubang suntik didesain untuk memasukkan sampel secara cepat dan

efisien. Desain yang populer terdiri atas saluran gelas yang kecil atau tabung

logam yang dilengkapi dengan septum karet pada satu ujung untuk

mengakomodasi injeksi dengan syringe. Karena Helium (gas pembawa) mengalir

melalui tabung, sejumlah volume yang diinjeksikan akan segera menguap untuk

selanjutnya dibawa menuju kolom (Rohman, 2009).

2.7.3.3 Kolom

Kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan karena di

dalamnya terdapat fase diam. Oleh karena itu, kolom merupakan komponen

sentral pada kromatografi gas. Ada 3 jenis kolom pada kromatografi gas yaitu

kolom kemas (packing column) dan kolom kapiler (capillary column); serta

kolom preparative (preparative column). Kolom kemas terbuat dari gelas atau

logam yang tahan karat atau dari tembaga dan aluminium. Fase diam yang

digunakan pada kolom kapiler dapat bersifat non polar, polar, atau semi polar.

Fase diam non polar yang paling banyak digunakan adalah metil polisiloksan

(HP-1; DB-1; SE-30; CPSIL-5) dan fenil 5%-metilpolisiloksan 95% (HP-5; DB-5;

SE-52; CPSIL-8). Fase diam semi polar adalah seperti fenil 50% -

metilpolisiloksan 50% (HP-17; DB-17; CPSIL-19), sementara itu fase diam yang

polar adalah seperti polietilen glikol (HP-20M; DB-WAX; CP-WAX;

(37)

17 2.7.3.4 Oven

Oven KG menggabungkan suatu kipas, yang memastikan distribusi panas

yang merata diseluruh oven. Oven-oven ini dapat diprogram untuk menghasilkan

suhu yang tetap, kondisi isotermal, atau peningkatan suhu secara

berangsur-angsur. Kecepatan pemrograman oven dapat berkisar dari 1oC/menit sampai 40oC

/menit. Program suhu yang kompleks dapat dihasilkan dengan melibatkan

sejumlah peningkatan suhu berselang-seling dengan periode-periode kondisi

isotermal, misalnya 60oC(1menit)/5oC/menit sampai 100oC(5menit)/10oC/menit

sampai 200oC (5menit). Keuntungan dari program-program suhu adalah bahwa

bahan-bahan yang keatsiriannya sangat berbeda dapat dipisahkan dalam waktu

yang rasional dan juga injeksi sampel dapat dilakukan pada suhu rendah, ketika

sampel akan diperangkap pada bagian atas kolom dan kemudian suhu dapat

dinaikkan sampai sampel berelusi (Watson, 2005).

2.7.3.5 Detektor

Detektor adalah gawai yang memasok sinyal keluaran sebagai tanggapan

terhadap cuplikan. Alat ini disambungkan dengan keluaran kolom untuk

memantau efluen kolom dalam waktu sebenarnya. Fungsi detektor adalah untuk

mendeteksi dan mengukur sejumlah kecil komponen yang terpisahkan pada aliran

gas yang meninggalkan kolom. Keluaran dari detektor direkam oleh sebuah

recorder yang akan mengahasilkan sebuah kromatogram (Jeffery, et al., 1989;

Johnson dan Stevenson, 1978).

Kromatogram yang merupakan hasil pemisahan fisik

komponen-komponen oleh KG disajikan oleh detektor sebagai deretan luas puncak terhadap

(38)

18

kualitatif, sedangkan luas puncak dalam kromatogram dapat dipakai sebagai data

kuantitatif yang keduanya telah dikonfirmasikan dengan senyawa baku. Akan

tetapi apabila kromatografi gas digabung dengan instrumen yang multipleks

misalnya GC/MS atau yang disebut Kromatografi Gas–Spektrometri Massa,

kromatogram disajikan dalam bentuk lain (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.7.3.5.1 Spektrometri massa sebagai detektor

(Sumber: Lee, 2005).

Menurut Lee (2005), terdapat delapan jenis sumber ionisasi yang

digunakan dalam intrumen MS. Pada analisis yang divariasikan dengan GC,

umumnya dan pada penelitian ini yang digunakan adalah elektron impact (EI).

Proses ionisasi dalam elektron impact (EI) yaitu, elektron dilewatkan melalui

sampel fase gas dan bertubrukan dengan molekul analit (M) yang kemudian

menghasilkan ion-ion bermuatan positif atau fragmentasi ion. Umumnya elektron

memiliki energi sebesar 70 eV. Metode ini digunakan untuk semua

senyawa-senyawa yang bersifat volatil.

(39)

19 2.8 Derivatisasi pada Kromatografi Gas

Derivatisasi pada KG merupakan proses kimiawi untuk mengubah suatu

senyawa menjadi senyawa lain yang mempunyai sifat-sifat yang sesuai untuk

dilakukan analisis menggunakan kromatografi gas (menjadi lebih mudah

menguap). Menurut Rohman (2009), alasan dilakukannya derivatisasi adalah:

- Senyawa-senyawa tersebut tidak memungkinkan dilakukan analisis dengan

KG terkait dengan volatilitas dan stabilitasnya.

- Untuk meningkatkan batas deteksi dan bentuk kromatogram. Beberapa

senyawa tidak menghasilkan bentuk kromatogram yang bagus (misal puncak

kromatogram saling tumpang tindih) atau sampel yang dituju tidak terdeteksi,

karenanya diperlukan derivatisasi sebelum dilakukan analisis dengan KG.

- Meningkatkan volatilitas, misal senyawa gula. Tujuan utama derivatisasi

adalah untuk meningkatkan volatilitas senyawa-senyawa yang tidak mudah

menguap (non-volatil). Senyawa-senyawa dengan berat molekul rendah

biasanya tidak mudah menguap, karena adanya gaya tarik-menarik inter

molekuler antara gugus-gugus polar karenanya jika gugus-gugus polar ini

ditutup dengan cara derivatisasi akan mampu meningkatkan volatilitas

senyawa tersebut secara dramatis.

- Meningkatkan deteksi, misal untuk kolesterol dan senyawa-senyawa steroid.

- Meningkatkan stabilitas. Beberapa senyawa volatil mengalami dekomposisi

parsial karena panas sehingga diperlukan derivatisasi untuk meningkatkan

stabilitasnya.

- Meningkatkan batas deteksi pada penggunaan detektor tangkap elektron

(40)

20

Beberapa cara derivatisasi yang dilakukan pada kromatografi gas yaitu

esterfikasi, asilasi, alkilasi, sililasi, kondensasi, dan siklisasi (Gandjar dan

Rohman, 2007).

• Sililasi

Derivat silil digunakan untuk menggantikan eter alkil untuk analisis

komponen sampel yang bersifat polar dan tidak mudah menguap. Salah satu

contoh sampel yang menggunakan derivat ini adalah Propolis. Derivat yang

paling sering dibuat adalah trimetilsilil. Urutan reaktifitas pereaksi sililasi

berdasarkan pada kemampuan penyumbang silil adalah sebagai berikut:

Trimetilsililimidazol(TMSIM)>N,O-bis-(trimetilsilil)-trifluoroasetamid (BSTFA)

>N,O-bis-(trimetilsilil)-asetamid(BSA)>N-metil-N-trimetilsililtrifluoroasetamid

(MSTFA) > Trimetilklorosilan (TMCS) > Heksametildisilazan (HMDS) (Gandjar

dan Rohman, 2007).

Urutan reaktivitas gugus-gugus penerima silil adalah sebagai berikut:

alkohol>fenol>asam karboksilat>amina>amida. Faktor sterik sangat penting

dalam hal penentuan kecepatan reaksi derivatisasi. Untuk setiap gugus fungsi,

urutan reaktifitasnya adalah: primer>sekunder>tersier (Gandjar dan Rohman,

2007).

Derivatisasi dengan gugus fungsional yang sukar diderivatisasi seperti

amina sekunder, alkohol tersier, dan amida perlu dilakukan pemanasan pada suhu

antara 60oC-150oC. Laju reaksi derivatisasi juga dapat ditingkatkan dengan

penambahan katalis asam seperti dengan trimetilklorosilan atau dengan katalis

basa seperti piridin. Dilaporkan bahwa 95% derivat trimetilsilil (TMS) dapat

(41)

N,O-bis-21

trimetilsilil)-trifluoroasetamid(BSTFA) yang kadang-kadang ditambah dengan

trimetilklorosilan(TMCS) sebagai katalis. Kedua pereaksi ini menunjukkan

selektifitas. TMSIM tidak bereaksi dengan gugus amino, sedangkan BSTFA

merupakan pereaksi terpilih untuk gugus amino. Pembuatan pereaksi ini pun lebih

reaktif dengan media bebas air (Gandjar dan Rohman, 2007).

Gambar 2.2 Struktur BSTFA dan reaksi Sililasi : Struktur BSTFA:

Reaksi Sililasi :

For BSTFA :

For TMCS: X = Cl

(42)

22 BAB III

METODE PENELITIAN

Metode penelitian yang digunakan adalah metode deskriptif eksploratif

yaitu untuk menentukan komponen propolis dengan membandingkan beberapa

propolis bermerek dan propolis mentah serta analisis komponennya. Penelitian ini

meliputi ekstraksi propolis dengan alkohol 70%, analisis komponen sampel secara

kualitatif dan kuantitatif dilakukan menggunakan GC-MS (Gas

Chromatography-Mass Spectrometry). Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian (LP)

Fakultas Farmasi USU dan di Laboratorium Penelitian PPKS MEDAN.

3.1 Alat-alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas

laboratorium untuk persiapan ekstraksi (beaker glass, gelas ukur, erlenmeyer,

batang pengaduk, spatula, cawan penguap, mortir dan alu, gelas arloji) kertas

whatmann no.1, corong, neraca analitik, rotavapor vakum, freeze dryer, freezer,

syringe perfection 100µl, mikropipet, botol berwarna gelap, vial kaca 5 ml

berwarna gelap, vial 2 ml, karet ptfe, plastik parafilm M, oven, GC-MS (Gas

Chromatography-Mass Spectrometry) model Shimadzu QP 2010 S untuk analisis.

3.2Bahan

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah propolis mentah

yang berasal dari daerah Sragen (Jawa tengah), propolis bermerek dagang (Melia

(43)

23

Propolis), Akuades, Alkohol 70% (etanol), Pyridine, bis-

trimethylsilyltrifluoroacetamide (BSTFA) termasuk 1% trimethylchlorosilane

(TMCS) digunakan sebagai pereaksi sililasi (derivatisasi).

3.3 Pengambilan Sampel

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah propolis mentah yang

diambil dari daerah Sragen (Jawa tengah) dan propolis yang dikumpulkan dari

berbagai merek dagang yang ada dipasaran. Pengambilan sampel dilakukan secara

purposif. Produk propolis yang diuji dalam penelitian ini adalah Sediaan cair

(Melia Propolis, Propolis Platinum) dan sediaan padat dalam bentuk kapsul dan

tablet (HDI Propoelix®, HDI Propoelix®Plus, HD Bee Propolis).

3.4Prosedur Penelitian

3.4.1 Persiapan Ekstraksi Propolis Mentah

Propolis sampel dikumpulkan dari daerah Sragen, Jawa tengah. Propolis

sampel terlebih dahulu dihaluskan menjadi butiran kecil atau bubuk halus.

Propolis tersebut bersifat lengket dalam suhu kamar sehingga sulit dihaluskan.

Selanjutnya propolis dimasukkan dalam freezer atau lemari es selama beberapa

jam (5 jam) sehingga menjadi keras dan rapuh. Propolis tersebut kemudian dapat

dipotong setipisnya sambil ditumbuk halus dalam mortir sebanyak 50 gram.

Propolis dibuat dalam potongan tipis dan halus berguna untuk meningkatkan

kontak permukaan antara alkohol dengan propolis, sehingga proses pelarutan

mudah dilakukan. Propolis yang sudah dipotong tipis-tipis, digerus halus dalam

(44)

24

3.4.2 Pembuatan Ekstrak Etanol Propolis (EEP)

a. Propolis mentah

Sampel propolis Sragen yang telah dihaluskan sebanyak 50 gram

tambahkan dengan alkohol 70% sebanyak (75 bagian) 375 ml dalam erlenmeyer

500 ml, diaduk dan disimpan dalam tempat gelap yang terhindar dari kontak

langsung dengan cahaya dan udara (kardus). Digoyang (diaduk) sesekali lalu

didiamkan selama 24 jam. Proses ekstraksi dilakukan selama 1 minggu. Ekstraksi

tahap I dilakukan selama 5 hari pertama. Pada hari kelima, ekstrak dimasukkan

ke dalam freezer selama 24 jam untuk menghapuskan lilin. Selanjutnya, sampel

ekstrak disaring dengan kertas Whatmann No.1. Residu yang tersisa ditambah

etanol 70% sebanyak 125 ml (25 bagian) selama hari keenam dan ketujuh

(Ekstraksi tahap II). Disimpan dalam tempat gelap sambil diaduk sesekali.

Kemudian saring dengan kertas whatmann No.1. Filtrat II dan filtrat I digabung

menjadi filtrat ekstrak etanol propolis (EEP). Filtrat di evaporasi untuk

pengeringan menggunakan rotary evaporator dibawah vakum pada suhu 400C.

Ektrak pekat propolis disimpan dalam cawan penguap yang ditutup rapat dengan

alumunium foil selanjutnya disimpan dalam desikator. Untuk penyimpanan

dalam jangka waktu lama, propolis disimpan dalam freezer. Selanjutnya ekstrak

pekat tersebut dipakai untuk uji laboratorium yang salah satunya adalah analisis

dengan GC-MS (Ditjen POM, 1979; Thirugnanasampandan, et al., 2012).

b. Propolis bermerek

Sediaan propolis bermerek terdiri dari propolis cair dan padat. Sediaan

propolis dipasaran sudah dikemas dalam bentuk ekstrak etanol propolis. Propolis

(45)

25

dengan mereaksikan sebanyak 0,5 ml. Propolis padat terlebih dahulu diekstraksi

kembali dengan pelarut yang sesuai. Propolis dalam bentuk kapsul ialah HDI

Propoelix®, HDI Propoelix®Plus dan propolis dalam bentuk tablet ialah HD Bee

Propolis. Propolis diekstrak dengan metode Harbone (1987). Ekstraksi sampel

dilakukan secara maserasi dengan pelarut alkohol 70%. Masing-masing sampel

kapsul 10 buah dan tablet 5 buah digerus dan dihaluskan dalam lumpang

menggunakan alu. Setelah halus, ditimbang kembali masing-masing sebanyak 5

gram. Sampel propolis yang sudah halus dan ditimbang kemudian dimasukkan

kedalam botol berwarna gelap. Tambahkan pelarut etanol 70% sebanyak 50 ml,

suspensi di simpan dalam tempat gelap selama satu minggu. Sambil diaduk

sesekali selama satu minggu. Kemudian dihomogenkan dengan vortex

menggunakan kecepatan 50 rpm selama 60 menit. Setelah itu, suspensi disaring

menggunakan kertas whatmann no.1 dan filtratnya diambil. Filtrat hasil maserasi,

dievaporasi untuk pengeringan rotary evaporator dibawah vakum pada suhu 400C.

Ekstrak tersebut di freeze dryer sampai pekat. Ektrak pekat propolis disimpan

dalam cawan penguap yang ditutup dengan alumunium foil dan disimpan dalam

desikator. Selanjutnya ekstrak pekat tersebut dipakai untuk uji laboratorium yang

salah satunya adalah analisis dengan GC-MS (Sarsono, et al., 2012).

3.4.3 Persiapan Sampel untuk Analisis

a. Propolis mentah

Sebelum sampel propolis Sragen dianalisis dengan GC-MS, terlebih

dahulu dilakukan derivatisasi dengan cara sililasi, yaitu 5 mg ekstrak etanol

propolis hasil penguapan direaksikan dengan 250 µl pyridine dan ditambahkan

(46)

26

trimethylchlorosilane (TMCS) dalam vial berwarna gelap yang ditutup rapat dan

dilapisi plastik parafilm M. Sampel tersebut kemudian dipanaskan dalam oven

selama 30 menit pada suhu 1000C. Sampel dimasukkan kedalam vial 2 ml dengan

tutup karet ptfe menggunakan spuit syringe perfection. Sampel yang sudah

dipersiapkan, diinjeksikan dan dianalisis dengan GC-MS (Greenway et al., 1988;

Kumar, et al., 2009).

b. Propolis bermerek

Sediaan propolis yang bermerek (Melia Propolis, Propolis Platinum, HDI

Propoelix®, HDI Propoelix®PLUS, HD Bee Propolis) masing-masing dipreparasi.

Sebanyak 5 mg sampel diambil menggunakan spuit lalu direaksikan dengan 250

µl pyridine dan 500 µl bis-(trimethyl-silyl) trifluoroacetamide (BSTFA) yang

mengandung 1% trimethylchlorosilane (TMCS) dalam vial berwarna gelap yang

ditutup rapat dan dilapisi plastik parafilm M. Sampel tersebut kemudian

dipanaskan dalam oven selama 30 menit , pada suhu 1000C. Sampel dimasukkan

dalam vial 2 ml dengan tutup karet ptfe menggunakan spuit syringe perfection

(Greenaway et al., 1988). Volume sampel 1 µl diinjeksikan dan dianalisis dengan

GC-MS (Kumar, et al., 2009; Kartal, et al., 2002).

3.4.4 Analisis komponen dengan GC-MS

Penentuan komponen propolis dilakukan di Laboratorium Penelitian

Fakultas Farmasi USU dan di Laboratorium Penelitian PPKS MEDAN dengan

menggunakan seperangkat alat Gas Chromatography-Mass Spectrometry

(GC-MS) dan kondisi yang disamakan.

Analisis GC-MS dari EEP ditampilkan menggunakan tipe alat Shimadzu QP

(47)

27

HP-5 MS yang terdiri dari 5% phenyl 95% methylpolysiloxane (Panjang kolom 30

m x 0,25 mm diameter internal kolom dilapisi, ketebalan film 0,5 mm). Gas

pembawa (fase gerak) yang digunakan Helium dengan laju aliran 0,7 ml/menit.

Suhu kolom oven terprogram 100oC - 310oC dengan laju aliran 5oC/menit. Suhu

injektor diatur pada suhu 280oC, dengan split ratio perbandingan 1:80. Spektrum

massa di catat dalam ionisasi elektron (EI) mode pada 70 eV dengan scanning dari

m/z 35 sampai m/z 470 Amu dengan sumber massa (ion sumber) 230°C (Kumar,

et al., 2009; Bankova, et al., 2002).

Cara identifikasi komponen propolis adalah dengan membandingkan

spektrum massa dari komponen propolis yang diperoleh (unknown) dengan

spektrum massa dalam data library yang memiliki tingkat kemiripan (similarity

(48)

28 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Identifikasi Komponen Senyawa dalam Propolis

Propolis yang dikumpulkan dari beberapa merek berbeda yang beredar

dipasaran dan propolis mentah asal Sragen dianalisis menggunakan GC-MS

setelah dipreparasi dengan reaksi sililasi. Dari hasil analisis komponen kimiawi

propolis, diperoleh kromatogram GC dan spektrum MS. Dari Gas Chromatograph

(GC) diperoleh puncak yang berbeda pada keenam jenis propolis. Hasil analisis

masing-masing propolis memberi komposisi propolis yang berbeda-beda.

4.1.1 Ekstrak Etanol Propolis Sragen (EEPS)

Analisis GC-MS dari EEP dapat dilihat pada Gambar 4.1. Jumlah puncak

pada Gambar 4.1 yang diberikan sesuai dengan waktu retensi hanya untuk

puncak-puncak tertinggi

(49)

29

Dari hasil kromatogram dalam ekstrak etanol propolis daerah asal Sragen,

diperoleh komponen-komponen teridentifikasi yang data lengkapnya dapat dilihat

pada Lampiran 1, halaman 63. Pada kromatogram EEPS terdapat 17 komponen

tertinggi, yang keseluruhan senyawanya teridentifikasi. Komponen-komponen

tersebut meliputi senyawa gula dan turunannya gula alkohol serta senyawa asam

alifatis seperti senyawa asam lemak. Secara keseluruhan komponen-komponen

propolis yang diidentifikasi dalam EEPS dapat dilihat pada pada Tabel 4.1.

Tabel 4.1 Komposisi kimia, waktu tambat, kadar dan SI komponen ekstrak etanol propolis Sragen yang dianalisis dengan GC-MS.

No. Nama Komponen Waktu tambat

(menit)

13. Beta-D-glukopiranosa 11,896 3,39 98

14. 9-Phenylcarbazole 12,257 4,07 88

15. Asam heksadekanoat

(asam palmitat) 12,320 2,00 92

16. Inositol 13,421 1,70 91

17. Melibiose 16,011 2,03 91

Keseluruhan komponen dalam tabel diatas teridentifikasi dan keseluruhan

kemiripan senyawanya dapat diterima yaitu, SI ≥ 80%. Pendekatan pustaka

(50)

30

kemiripan atau Similarity Index (SI) berada pada rentangan ≥ 80% (Howe and

Williams, 1981).

Kelima senyawa terbesar yang terdapat dalam EEP dari konsentrasi

tertinggi sampai lebih rendah adalah senyawa d-glucitol, asam glukonat, asam

manoonat, eritritol, beta-d-glukopiranosa. Berdasarkan literatur, komposisi

propolis sangat kompleks. Unsur utamanya adalah lilin lebah, resin dan senyawa

volatil. Lebah mensekresikan lilin lebah, sedangkan resin dan senyawa volatil

berasal dari tanaman sekitarnya. Aktivitas biologis propolis ditentukan oleh zat

tanaman ini berasal. Oleh karena itu, meskipun propolis merupakan produk

binatang, proporsi yang cukup besar dari komponen-komponennya yang berperan

dalam menentukan aktivitas biologis berasal dari tanaman (Sarsono, et al., 2012).

4.1.2 Sediaan Propolis Melia

Analisis GC-MS dari propolis Melia dapat dilihat pada Gambar 4.2.

Jumlah puncak pada Gambar 4.2 yang diberikan sesuai dengan waktu retensi

hanya untuk puncak-puncak tertinggi.

(51)

31

Dari hasil kromatogram dalam propolis Melia, diperoleh

komponen-komponen teridentifikasi yang secara lengkap datanya dapat dilihat pada

Lampiran 19, halaman 70. Beberapa komponen tertinggi yang teridentifikasi

dalam kromatogram tersebut adalah senyawa-senyawa asam lemak yang termasuk

golongan senyawa alifatis seperti asam pentadekanoat, asam palmitat

(heksadekanoat), asam stearat (oktadekanoat), senyawa 1-dodekanol dan

golongan asam aromatis seperti asam benzendikarboksilat. Selain beberapa

senyawa diatas, terdapat komponen-komponen lainnya dalam sediaan propolis

Melia. Berdasarkan hasil GC-MS, terdapat 11 komponen propolis Melia yang

diperoleh dan dapat dilihat dalam Tabel 4.2 berikut ini.

Tabel 4.2 Komposisi kimia, waktu tambat, SI dan kadar komponen sediaan propolis melia yang dianalisis dengan GC-MS.

Senyawa nordoxepin, metil oleat, dioktil ester dan silicone grease sulit

diidentifikasi keakuratan senyawanya karena memiliki SI dibawah 80%. Hal itu

dapat disebabkan oleh kurangnya data library untuk spektrum senyawa yang

No. Nama Komponen Waktu tambat 1. Asam 1,2-Benzen-2-karboksilat,

dietil ester (CAS) Etil ftalat 10,954 1,11 68

8. Asam oktadekanoat (asam stearat) 26,659 39,29 89 9. metil 9-oktadekanoat (metil oleat) 28,111 6,70 70 10. Asam 1,2-benzendikarboksilat

bis(2-etilheksil)ester 33,358 20,99 96

(52)

32

sesuai pada perpustakaan komputer alat GC-MS. Dari hasil yang didapat bahwa

tingkat kemiripan dari propolis yang diterima, yaitu senyawa denga SI ≥ 80%.

Pendekatan pustaka terhadap spektrum massa dapat digunakan untuk identifikasi

karena indeks kemiripan atau Similarity Index (SI) berada pada rentangan ≥ 80%

(Howe and Williams, 1981).

Dari 11 komponen propolis melia yang teridentifikasi hanya terdapat 5

senyawa yang memenuhi standar Howe dan Wiliams dengan indeks kemiripan ≥

80%. Kelima senyawa tersebut dari kadar tertinggi sampai terendah adalah asam

oktadekanoat (asam stearat), asam pentadekanoat, Asam 1,2-benzendikarboksilat

bis(2-etilheksil)ester, asam heksadekanoat, 1-dodecanol.

4.1.3 Sediaan Propolis Platinum

Analisis GC-MS dari propolis Platinum dapat dilihat pada Gambar 4.3.

Jumlah puncak pada Gambar 4.3 yang diberikan sesuai dengan waktu retensi

hanya untuk puncak-puncak tertinggi.

(53)

33

Dari hasil kromatogram dalam sediaan propolis Platinum, diperoleh

komponen-komponen teridentifikasi yang secara lengkap datanya dapat dilihat

pada Lampiran 26, halaman 73. Beberapa komponen yang teridentifikasi dalam

kromatogram tersebut adalah golongan senyawa aromatis dan senyawa asam

alifatis yaitu asam lemak seperti metil oleat, metil stearat. Selain beberapa

senyawa diatas, terdapat komponen-komponen lainnya dalam sediaan propolis.

Berdasarkan hasil GC-MS, terdapat 18 komponen propolis Platinum yang

diperoleh dan dapat dilihat dalam Tabel 4.3 berikut ini.

Tabel 4.3 Komposisi kimia, waktu tambat, kadar komponen dan SI sediaan Propolis Platinum yang dianalisis dengan GC-MS.

No. Nama Komponen Waktu tambat

(menit)

Kadar (%)

SI (%) 1. 4-Fluorobenzyloxy-2,3-epoxyoctane 18,534 2,86 74 2. 1-fenil-5-fenil

sulfonil-2epoxypentana 18,977 0,93 68

3. Trolen 19,678 1,59 78

4. Dursban 22,179 2,81 66

5. Cis-myrtanol 24,813 10,10 81

6. Metil 9-oktadekanoat

(metil oleat) 24,952 24,27 93

7. Metil oktadekanoat (metil stearat) 25,533 8,33 89

8. Prothiofos 26,523 17,83 83

9. Prothiofos 27,046 3,48 70

10. 4-hydroxytetradec-2-ynal 30,735 2,28 67

11. Heksametil trisiloksan 30,817 1,36 69

12. Asam oksiraneoktanoat, 3-oktil-metil

ester 31,008 1,76 70

13. Asam oksiraneoktanoat, 3-oktil-metil

ester 31,016 8,66 72

14. Metoksi-4-(1-z-profenil)benzena 32,851 2,76 52

15. Asam fosporodithioat 33,672 3,83 81

16. Asam fosporodithioat 33,759 3,24 65

17. Fenil etil alkohol 33,920 2,30 64

(54)

34

Senyawa 4-Fluorobenzyloxy-2,3-epoxyoctane,

1-fenil-5-fenilsulfonil-2-epoxypentana, Trolen, Dursban, prothiofos (menit ke-27,046),

4-hydroxytetradec-2-ynal, Carpesiolin, asam oksiraneoktanoat, metoksi-4(1-Z-profenil)benzena,

Silane, dan tetradekana sulit diidentifikasi keakuratan senyawanya karena

memiliki SI dibawah 80%. Hal ini dapat disebabkan oleh kurangnya data library

untuk spektrum senyawa yang sesuai pada perpustakaan komputer alat GC-MS.

Dari hasil yang didapat bahwa tingkat kemiripan dari propolis yang diterima,

yaitu senyawa denga SI ≥ 80%. Pendekatan pustaka terhadap spektrum massa

dapat digunakan untuk identifikasi karena indeks kemiripan atau Similarity Index

(SI) berada pada rentangan ≥ 80% (Howe and Williams, 1981).

Berdasarkan komponen senyawa tertinggi yang teridentifikasi dalam

kromatogram propolis Platinum diatas, diperoleh hanya 5 senyawa yang memiliki

SI ≥ 80% dan diterima keakuratan senyawa dalam identifikasinya. Kelima

senyawa tersebut dari kadar tertinggi sampai terendah adalah metil oleat,

Prothiofos, Cis-myrtanol, metil stearat, asam fosporoditioat.

4.1.4 Sediaan Propoelix HDI (High Desert Indonesia)