Pemilihan dan karakterisasi bakteri penghasil enzim proteolik dari terasi medan

(1)

PEMILAHAN DAN PENCIRIAN BAKTERI PENGHASIL

ENZIM PROTEOLITIK DARI TERASI MEDAN

DIAN KRISTIANA

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(2)

PEMILAHAN DAN KARAKTERISASI BAKTERI PENGHASIL

ENZIM PROTEOLITIK DARI TERASI MEDAN

DIAN KRISTIANA

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada

Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(3)

DIAN KRISTIANA. Pemilahan dan Pencirian Bakteri Penghasil Enzim Proteolitik dari Terasi Medan. Dibimbing oleh DONDIN SAJUTHI danYANTI. Enzim protease yang diproduksi oleh isolat bakteri D1T2 diisolasi dari Terasi medan makanan fermentasi tradisonal Indonesia, menunjukkan aktivitas fibrinolitik. Penelitian bertujuan memperoleh isolat yang berpotensi memproduksi enzim protease dari isolat Terasi Medan dan mengkaji karakterisasi enzim tersebut.

Ekstrak enzim protease dilakukan beberapa tahapan pemurnian dengan presipitasi ammonium sulfat 55%, dialisis menggunakan kantung dialisis (cut off

10 kD) dan pemekatan dengan polietilenglikol (PEG). Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas spesifik dialisat adalah 4.6461 U/mg dengan tingkat kemurnian 3.01 kali dibandingkan dengan ekstrak enzim kasar (1.5434 U/mg). Analisis SDS-PAGE 10% menunjukkan bahwa ekstrak kasar protease mempunyai 2 buah pita protein (34.70 kD dan 9.62 kD) dan dialisat dengan 1 buah pita (23.86 kD). Uji zimografi 10 % menunjukkan bahwa enzim protease ini mempunyai aktivitas kaseinolitik, fibrinolitik, dan gelatinolitik. Aktivitas protease meningkat dengan penambahan ion Ca2+ 1mM. Protease ini dihambat spesifik oleh TLCK (N-p-tosil-L-lisinklorometil keton), PMSF (Fenil Metil Sulfonil Fluorida), dan STI (Soybean Trypsin Inhibitor) sehingga digolongkan kedalam kelompok protease serin.

ABSTRACT

DIAN KRISTIANA. Selection and Characterization of Bacteria Produced Proteolytic from Terasi Medan. Under the direction of DONDIN SAJUTHI and YANTI.

Protease which produced by bacteria D1T2 isolated from Terasi Medan an Indonesian traditional fermented food, showed fibrinolytic activity. Therefore, the purpose of the research was to get bacteria which potential of protease produced from Terasi Medan and explained of Characterization that enzyme.

The extract of protease went through several steps of purification using ammonium sulfate 55% saturation, dialyzed (cut-off 10 kD), and concentrated with polyethylene glycol (PEG). The result of the study showed specific activity of this dialyzed 4.6461 U/mg. Compared to the crude extract it has 3.01 fold higher purification. Analysis of the SDS-PAGE 10% showed that crude extract protease have two bands (34.70 kD dan 9.62 kD) and the dialyzed just has one protein band (23.86 kD). Zimografi test 10% showed that of protease have fibrinolytic, caseinolytic, and gelatinolytic activity. The protease enzyme activity increased by the addition of ion Ca 2+ (1mM). This enzyme was inhibited strongly by N-p-tosil-L-lisin chloromethyl ketone, phenylmethylsulphonylfluoride, and soybean trypsin inhibitor. Therefore this enzyme that purified from Terasi Medan can be classified as serin protease.

(4)

PRAKATA

Alhamdulillaahirobbilaalamiin, penulis panjatkan kepada Allah SWT, karena berkat kasih sayang dan cinta-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan karya ilmiah dengan judul Pemilahan dan Pencirian Bakteri Penghasil Enzim Proteolitik dari Terasi Medan.

Karya ilmiah ini merupakam hasil penelitian yang dilakukan penulis sejak bulan Juni sampai Desember 2005, di Fakultas Teknobiologi, Universitas Katolik Atmajaya, Jakarta.

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. drh. Dondin Sajuthi, MST.,PhD. dan Yanti, S.Si., M.Si. selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan, saran, dan pengarahan kepada penulis dalam menyelesaikan karya ilmiah ini.

Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan untuk keluarga tercinta, Ayah, Ibu, Kakak, dan Adik yang telah memberikan dukungan baik moril maupun materiil, serta doa dan kasih sayangnya. Disamping itu, terima kasih juga kepada teman seperjuanganku mbak Wiwit, mbak Soli, Santi, Selvi, Peris dan sahabat-sahabatku Rokme, Dyah, Ekong, Atik, seluruh dosen dan staf Laboratorium Biokimia dan Teknologi Enzim, Mas Yudi, dan Mas Bambang yang telah membantu selama penelitian. Tak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada Mas Heri, teman-teman Kimia 38 dan seluruh penghuni C-8 atas bantuan dan kebersamaannya. Serta semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.

Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.

Bogor, Maret 2006

(5)

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Pati-Jateng pada tanggal 29 Juni 1983 dari ayah Waluyo dan ibu Endang Wiryanti. Penulis merupakan putri ketiga dari lima bersaudara.

Tahun 2001 penulis lulus dari SMU Negeri 2 PATI dan pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis diterima di Program Studi Kimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.

(6)

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL... ix

DAFTAR GAMBAR ... ix

DAFTAR LAMPIRAN... x

PENDAHULUAN TINJAUAN PUSTAKA Terasi... 1

Protase fibrinolitik... 3

Karakteristik Biokimia Enzim Protease ... 3

Elektroforesis dan Zimografi ... 5

BAHAN DAN METODE Alat dan bahan ... 6

Screening... 6

Analisis Aktivitas Protease ... 7

Analisis Kadar Protein ... 7

Presipitasi ... 7

Dialisis ... 7

Karaktersasi Protease Ekstrak Kasar... 7

Analisis SDS-PAGE dan zimografi ... 8

HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi Bakteri Terasi ... 9

Produksi Enzim Protease ... 9

Pemurnian Enzim ... 10

Penentuan Suhu Optimum ... 11

Penentuan pH Optimum ... 12

Pengaruh Waktu Inkubasi ... 12

Pengaruh Konsentrasi Substrat ... 13

Pengaruh Ion Logam ... 14

Pengaruh Inhibitor... 15

Penentuan Bobot Molekul ... 16

(7)

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Komposisi kimia terasi... 2

2 Makanan yang difermentasikan oleh bakteri ... 3

3 Sumber-sumber enzim fibrinolitik ... 3

4 Komposisi gel pemisah dan gel penahan ... 8

5 Karakterisasi enzim protease isolat... 18

DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Terasi medan ... 2

2 Isolat D1T2 dari terasi medan ... 9

3 Pengaruh konsentrasi ammonium ... 11

4 Pengaruh suhu terhadap aktivitas... 11

5 Pengaruh pH terhadap aktivitas ... 12

6 Pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas ... 13

7 Kurva Michaelis-Menten ... 14

8 Kurva pengaruh ion logam ekstrak ... 14

9 Kurva pengaruh ion logam dialisat ... 15

10 Kurva pengaruh inhibitor ... 15

11 Analisis SDS-PAGE ... 16

12 Zimogram fibrin, kasein... 17

(8)

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Aktivitas enzim dari seleksi isolat bakteri ... 21

2 Data pengaruh suhu, pH ekstrak ... 22

3 Data pengaruh ion logam ekstrak... 23

4 Data pengaruh suhu, pH dialisat ... 24

5 Data pengaruh ion logam dialisat... 25

6 Kurva Lineweaver-Burk ... 26

7 Kurva standart Bradford... 27

8 Kurva standart SDS-PAGE ... 28

9 Diagram alir penelitian... 29

10 Komposisi media pertumbuhan dan produksi... 30

11 Prosedur pembuatan pereaksi kimia... 31

(9)

(10)

Lampiran 1 Aktivitas enzim dari seleksi isolat bakteri Terasi Medan dan ringkasan hasil pemurnian protease

Aktivitas enzim isolat bakteri dari Terasi Medan Isolat Aktivitas Enzim (U/ml)

D1T1 0.1959

Ringkasan tahap pemurnian protease Terasi Medan

(11)

Lampiran 2 Data pengaruh suhu, pH dan waktu inkubasi terhadap aktivitas enzim protease dari ekstrak kasar isolat D1T2

Pengaruh suhu Suhu

(oC)

Asampel Ablanko Astandart AE(U/ml) AS

(U/mg)

pH Asampel Ablanko Astandart AE(U/ml) AS

(U/mg)

Pengaruh waktu inkubasi Waktu

Inkubasi (menit)

Asampel Ablanko Astandart AE(U/ml) AS

(12)

Lampiran 3 Data pengaruh ion logam, inhibitor dan konsentrasi substrat terhadap

KCl 0.260 0.170 0.456 0.1890 40.90 NaCl 0.162 0.136 0.699 0.0278 6.02 CaCl2 1.298 0.905 1.408 0.4688 101.45 MgCl2 0.925 0.591 1.405 0.2462 53.28

FeCl3 0.843 0.728 1.292 0.1223 26.47 Kontrol 1.296 0.914 1.410 0.4621 100

Pengaruh ion logam (1mM) Logam

(1mM)

Asampel Ablanko Astandart AE (U/ml) AE

residu (%)

FeCl3 0.901 0.629 1.413 0.2082 45.06 Kontrol 1.296 0.914 1.410 0.4621 100

Pengaruh inhibitor

Inhibitor Asampel Ablanko Astandart AE (U/ml) AE

residu (%)

PMSF 0.178 0.158 0.734 0.0208 4.50 STI 0.189 0.164 0.667 0.0298 6.45

Sampel Blanko Standart AE (U/ml)

(13)

Lampiran 4 Data pengaruh suhu, pH dan waktu inkubasi terhadap aktivitas enzim protease dari dialisat isolat D1T2

Pengaruh suhu Suhu

(oC)

Asampel Ablanko Astandart AE(U/ml) AS(U/mg) AE

Relatif

PH Asampel Ablanko Astandart AE(U/ml) AS(U/mg) AE

Relatif

Pengaruh waktu inkubasi Waktu

Inkubasi (menit)

Asampel Ablanko Astandart AE(U/ml) AS(U/mg) AE

(14)

Lampiran 5 Data pengaruh ion logam, inhibitor dan konsentrasi substrat terhadap

FeCl3 0.607 0.310 0.860 0.3240 48.87 Kontrol 1.047 0.605 1.005 0.6630 100

Pengaruh ion logam (1mM) Logam

(1mM)

Asampel Ablanko Astandart AE (U/ml) AE

residu (%)

FeCl3 0.639 0.322 0.782 0.4135 62.37 Kontrol 1.047 0.605 1.005 0.6630 100

Pengaruh inhibitor

Inhibitor Asampel Ablanko Astandart AE (U/ml) AE

residu

Sampel Blanko Standart AE (U/ml)

(15)

Lampiran 6 Kurva Lineweaver-Burk pada protease isolat D1T2

(16)

(17)

Lampiran 8 Kurva standart SDS-PAGE 10%

Pita Rf (cm) BM (kDa) Log BM

1 0.1731 66 1.8195

2 0.2500 45 1.6533

3 0.3077 36 1.5563

4 0.4231 29 1.4624

5 0.4808 24 1.3802

6 0.6154 20 1.3010

7 0.7885 14.20 1.1523

8 0.8654 6.5 0.8129

y = -1.2073x + 1.9814

R2 = 0.9407

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Rf (cm)

Log B

(18)

Lampiran 9 Diagram alir penelitian

Sampling

Screening dan isolasi dari bakteri penghasil

enzim fibrinolitik

Produksi enzim kasar

Presipitasi ammonium sulfat (kejenuhan 30-90%)

Elektroforesis SDS-PAGE dan Zimografi Dialisis dan pemekatan dengan kantung dialisis

(cut-of 10kD)

Analisa aktivitas protease dan kadar protein Karakterisasi

(19)

Lampiran 10 komposisi media pertumbuhan dan media produksi • Media Luria Bertani Broth (LB 10%), pH 7

Yeast ekstrak 0.05 g

Tripton 0.1 g

NaCl 0.05 g

Akuadest 100 ml

• Media Skim Milk Agar (SMA), pH 7

Agar 4.5 g

Susu skim milk 100 ml

Akuadest 200 ml

(20)

Lampiran 11 Prosedur pembuatan pereaksi kimia

Pereaksi untuk Analisis Akvitas Enzim dan Kadar Protein

• Kasein 2% b/v

Sebanyak 2 gram kasein Hammarsten atau kasein taknis dilarutkan dalam

buffer universal (tambahkan sedikit-sedikit) sambil distirer dan dipanaskan

(50-60oC) supaya mudah larut, lalu ditera hingga volume total 100ml.

• Tirosin 5mM

Sebanyak 0.091 gram tirosin dilarutkan dalam akuadest (tambahkan

sedikit-sedikit) sambil distirer, lalu ditera hingga volume total 100ml.

• TCA 0.1M

Sebanyak 1.634 gram TCA dilarutkan dalam akuadest (tambahkan

sedikit-sedikit) sambil distirer, lalu di tera hingga volume total 100ml (gunakan

sarung tangan!)

• Na2CO3 0.4M

Sebanyak 4.2404 gram Na2CO3 dilarutkan dalam 100ml akuadest, lalu

diaduk dengan pengaduk magnetic hingga larut.

• Pereaksi Folin-Ciocalteau

Sebanyak 25 ml pereaksi Folin-Ciocalteau diencerkan dengan akuadest

hingga volume 50 ml dan diaduk dengan stirrer hingga homogen.

• Pereaksi Bradford

Stok larutan Bradford dibuat dengan cara melarutkan 0.1 gram

Coomasssie Brilliant Blue R-250 dalam 50 ml etanol 95% v/v dan 100 ml

asam fosfat 85% v/v, lalu ditera dengan akuadest hingga volume 200 ml.

Larutan kerja Bradford dibuat dengan cara mengencerkan 5 ml larutan

(21)

Lampiran 12 Pereaksi untuk analisis SDS-PAGE dan Zimografi • Larutan A ( 30% b/v akrilamida; 0.8% b/v bis-akrilamida)

Sebanyak 14.6 gram akrilamida dan 0.4 gram bis-akrilamida dilarutkan

dalam 50 ml akuadest dan diaduk dengan pengaduk magnetic hingga larut

homogen.

• Larutan B (buffer gel pemisah, Tris-HCl 2M pH 8.8)

Sebanyak 75 ml larutan Tris-HCl 2M pH 8.8 dan 4 ml larutan SDS 10%

(b/v) ditambahkan dengan akuadest hingga volume total 100ml.

• Larutan C (buffer gel penahan, Tris-HCl 1M pH 6.8)

Sebanyak 6.8 Tris-HCl 1M pH 6.8 dan 4 ml larutan SDS 10% (b/v)

ditambahkan dengan akuadest hingga volume total100ml.

• Ammonium persulfat 10% (b/v)

Sebanyak 0.1 gram ammonium persulfat dilarutkan dalam satu ml

akuadest.

• Buffer Elektroforesis

Sebanyak 1.803 gram Tris, 8.648 gram glisin, dan 0.6 gram SDS

dilarutkan dalam 600 ml akuadest, lalu ditera hingga pH 8.3 dengan HCl

1M.

• Buffer Sampel

Komposisi buffer sampel untuk SDS-PAGE terdiri dari 0.3 ml Tris-HCl

1M pH 6.8, 2.5 ml gliserol 50% (v/v), 1.0 ml SDS 10% (b/v), 0.25 ml

2-merkaptoetanol, 0.5 ml bromfenol blue 1% (b/v), dan 0.45 ml akuadest

dengan volume total 5.0 ml. Sementara komposisi buffer sample untuk

zimografi terdiri dari 0.5 gram SDS, 1ml gliserol 50 % (v/v), 1ml

bromfenol blue, 0.625 ml Tris-HCl 1M pH 6.8, dan 2.375 ml akuadest

dengan volume total 5.0 ml.

• Larutan Pewarna

Sebanyak 0.5 gram Coomasssie Brilliant Blue R-250 dalrutkan dalam

camopuran 225 ml methanol, 50 ml asam asetat glacial, dan 225 akudest

(22)

• Larutan peluntur

Komposisi larutan terdiri dari 50 ml methanol, 50 ml asam asetat glacial,

dan 400 ml akuadest dengan volume total 500 ml.

• TritonX-1002.5 % (v/v)

Sebanyak 2.5 ml larutan Triton X-100 dilarutkan dalam akuadest hingga

volume total 500ml.

Larutan berbagai buffer

Larutan kerja buffer dibuat dengan cara mengencerkan 25 ml larutan stok

buffer 0.2M dengan akuadest hingga volume total 100 ml. Buffer yang digunakan

dalam penelitian ini adalah buffer buffer universal (pH 4-10), glisin-HCl (pH 8.3),