AKTIVITAS XILANASE BEBERAPA
Pleurotus ostreatus
MENGGUNAKAN SUBSTRAT PELEPAH DAN
TANDAN KOSONG KELAPA SAWIT
ANASTASIA NOENG
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul Aktivitas Xilanase Beberapa Pleurotus ostreatus Menggunakan Substrat Pelepah dan Tandan Kosong Kelapa Sawit adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Anastasia Noeng
ABSTRAK
ANASTASIA NOENG. Aktivitas Xilanase Beberapa Pleurotus ostreatus
Menggunakan Substrat Pelepah dan Tandan Kosong Kelapa Sawit. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan SUHARYANTO.
Enzim xilanase merupakan salah satu enzim yang unik yang dapat dihasilkan oleh bakteri dan jamur. Xilanase memiliki pH dan suhu optimum yang bervariasi, sehingga enzim ini dapat diaplikasikan pada berbagai industri.
Pleurotus ostreatus merupakan jenis jamur yang paling banyak dibudidayakan dan diduga dapat menghasilkan enzim xilanase. P. ostreatus dikenal oleh masyarakat sebagai jamur tiram. Selama ini budidaya jamur tiram hanya menggunakan media serbuk gergaji saja, padahal ada banyak limbah pertanian dan perkebunan yang dapat digunakan. Limbah perkebunan seperti pelepah kelapa sawit dan tandan kosong kelapa sawit (TKKS) dapat digunakan sebagai substrat bagi jamur tiram. Penelitian ini dilakukan untuk menyeleksi P. ostreatus dari berbagai tempat yang mensekresikan enzim xilanase dengan memanfaatkan pelepah kelapa sawit dan TKKS sebagai media substrat. Isolat BIOTROP dan Gadog merupakan isolat jamur yang menghasilkan enzim xilanase juga dapat menghasilkan enzim selulase dan enzim lignolitik. Penyusutan bobot basah media setelah 30 hari masa inkubasi berkisar antara 9.17% sampai 40.69% dari bobot awal. Terjadi peningkatan pH pada media pelepah kelapa sawit dan terjadi penurunan pH media TKKS setelah masa inkubasi 30 hari. Uji rasio C/N yang dilakukan juga menunjukkan adanya perubahan kadar karbon dan nitrogen sesudah masa inkubasi 30 hari. Aktivitas enzim xilanase tertinggi diperoleh dari isolat Gadog pada media pelepah kelapa sawit yaitu sebesar 0.584 UI/mL dicapai pada hari ke-37. Perolehan konsentrasi protein diperoleh dari isolat Gadog pada media TKKS sebanyak 35.6 mg/mL yang dicapai pada hari ke-42.
Kata kunci: Pelepah Kelapa Sawit, Pleurotus ostreatus, TKKS, Xilanase.
ABSTRACT
ANASTASIA NOENG. Xylanase Activity from Pleurotus ostreatus Cultivated
on Palm Oil’s Frond and Empty Fruit Bunch as a Substrat. Supervised by ANJA MERYANDINI and SUHARYANTO.
and EFB as a substrat. Isolate BIOTROP and Gadog were fungi which produced xylanase and also celullase and lignolytic enzymes. After 30 days, weight media decrease between 9.17% until 40.69% from weight media before 30 days incubate. There was a different pH in palm oil’s frond and EFB media. The ratio of C : N showed change of carbon and nitrogen content before and after 30 days of incubation. The highest activity of xylanase enzyme was 0.584 IU/mL reached after 37 days of incubation. It was achieved from P. ostreatus Gadog strain using
palm oil’s frond as a substrate. The highest protein concentrate was 35.6 mg/mL reached after 42 days of incubation. It was achieved from P.ostraetus Gadog strain using EFB as a substrate.
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
AKTIVITAS XILANASE BEBERAPA
Pleurotus ostreatus
MENGGUNAKAN SUBSTRAT PELEPAH DAN
TANDAN KOSONG KELAPA SAWIT
ANASTASIA NOENG
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Skripsi : Aktivitas Xilanase Beberapa Pleurotus ostreatus Menggunakan Substrat Pelepah dan Tandan Kosong Kelapa Sawit
Nama : Anastasia Noeng NIM : G34100083
Disetujui oleh
Prof Dr Anja Meryandini, MS Pembimbing I
Ir Suharyanto, MSi Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi Ketua Departemen
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian ini ialah enzim xilanase. Penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari 2014 sampai dengan April 2014 berjudul Aktivitas Xilanase Beberapa Pleurotus ostreatus Menggunakan Substrat Pelepah dan Tandan Kosong Kelapa Sawit.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Anja Meryandini, MS selaku pembimbing pertama dan Ir Suharyanto, MSi selaku pembimbing kedua atas arahan, kesabaran, waktu dan ilmu yang telah diberikan. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr Berry Juliandi, MSi yang telah bersedia menjadi dosen penguji sidang serta pemberian saran dalam penyusunan karya ilmiah ini. Ungkapan terima kasih yang tak terhingga penulis sampaikan untuk Ibunda tercinta Enah dan ayahanda tersayang Edmundus Efrain serta kakakku tersayang Selvina Bura SS, Tanteku Mimi, keponakan kecilku Jakaria Nur Ramadhan, sepupu tersayang Irma Ilmiasari, AMd Kep, dan Ita Maysi Raptiyandari atas do’a, kasih sayang, dan dukungan yang tiada henti. Terima kasih dan penghargaan penulis sampaikan kepada seluruh staf Laboratorium Mikrobiologi dan Bioproses Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, khususnya kepada Bu Happy, Kak Prita, Mba Eka, Kak Muti, Bu Ning, Bu Irma dan Kak Syarif yang telah banyak membantu dalam pengerjaan penelitian. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada sahabat – sahabat terbaik penulis Farizul Fadiyah, Rizky Apriyani, dan Ika Suciati serta teman seperjuangan Biologi 47. Terima kasih untuk Internal BFKFB, JakPus 2013, dan rekan – rekan Wisma Adinda Mba Vinda, Arny, dan Indah. Akhir kata penulis berharap semoga karya ilmiah ini bermanfaat dan dapat memberikan informasi bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, Agustus 2014
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vi
DAFTAR GAMBAR vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
PENDAHULUAN 5
Latar Belakang 5
Perumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 2
Manfaat Penelitian 2
BAHAN DAN METODE 2
Bahan 2
Alat 3
Prosedur Percobaan 3
Isolasi Pleurotus ostreatus 3
Peremajaan Isolat 3
Uji Enzim Lignolitik 3
Pembuatan Starter 3
Pembuatan Media Pelepah Kelapa Sawit 4
Pengukuran Bobot Media 4
Pengukuran pH Media 4
Uji Aktivitas Enzim Xilanase 4
Uji Konsentrasi Protein 5
Uji Zona Bening Selulosa 5
Uji Zona Bening Xilan 5
Uji Kadar Karbon 6
Uji Kadar Nitrogen 6
HASIL DAN PEMBAHASAN 6
Hasil 6
Pembahasan 12
SIMPULAN DAN SARAN 15
Simpulan 15
Saran 15
DAFTAR PUSTAKA 15
LAMPIRAN 17
DAFTAR TABEL
1 Bobot basah dan bobot kering media tumbuh Pleurotus ostreatus 8 2 Nilai pH media hari ke – 0 dan hari ke – 30 8 3 Nilai indeks xilanolitik (NIX) Plerotus ostreatus pada media xilan 9 4 Nilai indeks selulolitik (NIS) Pleurotus ostreatus pada media CMC 9 5 Pengukuran konsentrasi protein pada enzim ekstrak kasar 11 6 Pengukuran kadar karbon, nitrogen, dan rasio C/N 11
DAFTAR GAMBAR
1 Jamur penghasil enzim lignolitik 7
2 Struktur media pelepah. 7
3 Struktur media TKKS. 8
4 Pembentukan zona bening isolat P. ostreatus pada media CMC. 9 5 Pembentukan zona bening isolat P. ostreatus pada media xilan 1% 10
6 Pengukuran aktivitas enzim xilanase. 10
DAFTAR LAMPIRAN
1. Kurva standar uji aktivitas enzim 17
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia menjadi negara penghasil minyak kelapa sawit terbesar di dunia melampaui Malaysia pada tahun 2008 hingga 2013 (GAPKI 2014). Hal ini dinilai wajar karena adanya penambahan areal baru tanaman kelapa sawit yang didukung oleh pemerintah sejak tahun 2006 (Pahan 2006). Produksi crude palm oil (CPO) di Indonesia sebesar 26 juta ton pada tahun 2013 (GAPKI 2014). Jumlah produksi CPO yang tinggi diiringi juga dengan tingginya jumlah produksi limbah pengolahan kelapa sawit. Limbah pengolahan kelapa sawit contohnya tandan kosong kelapa sawit (TKKS) dan pelepah kelapa sawit. Jumlah TKKS mencapai 30% – 35% dari berat tandan buah segar setiap pemanenan. TKKS mengandung 6.04% abu, 36.81% selulosa, 27.01% hemiselulosa dan lignin sebesar 15.70% (Hambali et al. 2007). Pelepah kelapa sawit merupakan bagian dari pohon kelapa sawit yang pemanfaatannya masih belum maksimal. Menurut Pahan (2006) bagian pelepah kelapa sawit terdiri atas komponen selulosa, hemiselulosa, lignin dan bahan organik berupa mineral atau silikat pada bagian epidermisnya.
Salah satu penyusun pelepah kelapa sawit dan TKKS adalah hemiselulosa. Sebagian besar komponen utama hemiselulosa terdiri atas xilan. Xilan memiliki rangka 1,4 D-Xylopyranose dan beberapa variasi rantai samping (Dumitriu 1998). Enzim xilanase merupakan enzim yang dapat mendegradasi xilan. Salah satu kegunaan xilanase yaitu untuk mendegradasi limbah perkebunan seperti pelepah kelapa sawit dan TKKS. Setelah banyak dilakukan penelitian, enzim xilanase memiliki spektrum pH dan suhu optimum yang luas. Penelitian yang dilakukan oleh Kumar et al. (2004) menunjukkan bahwa enzim xilanase yang diperoleh memiliki pH optimum dalam suasana basa dan dapat diaplikasikan untuk meningkatkan manfaat sabun cuci. Dari penelitian Wong dan Saddler (1993) ditunjukkan bahwa xilanase yang memiliki pH optimum asam dapat digunakan untuk menjernihkan jus, ekstrak kopi, minyak nabati, dan pati. Penelitian Viikari
et al. (1994) menunjukkan bahwa xilanase yang bekerja optimum pada pH alkali dengan suhu optimum diatas 50oC juga dapat digunakan sebagai pemutih kertas yang lebih ramah lingkungan untuk mengganti klorin. Menurut Biely (1985) xilanase dapat digunakan untuk memproduksi gula xilosa. Gula xilosa ini sedang dikembangkan sebagai alternatif pemanis untuk dikonsumsi penderita diabetes melitus.
Enzim xilanase dapat dihasilkan oleh bakteri dan jamur. Pleurotus ostreatus
merupakan anggota kingdom Fungi dan dapat menghasilkan enzim xilanase. Jamur ini sendiri banyak diminati oleh masyarakat di Indonesia. Konsumsi P. ostreatus mulai meningkat sejak tahun 1991 (Gunawan 2007). Menurut Jaelani (2008), P. ostreatus diminati masyarakat Indonesia karena memiliki rasa yang lezat, memiliki nilai gizi yang tinggi, dan dapat digunakan sebagai obat. Budidaya
2
sementara produksi jamur tiram menggunakan media serbuk gergaji terus dilakukan. Ketersediaan pelepah kelapa sawit dan TKKS yang melimpah serta pemanfaatannya pun masih sangat sedikit, diharapkan dapat menjadi alternatif media tumbuh jamur tiram.
Perumusan Masalah
Organisme penghasil enzim xilanase tidak hanya bakteri melainkan juga dapat diproduksi oleh kelompok Jamur. Adanya perbedaan organisme penghasil enzim ini dapat menyebabkan enzim yang dihasilkan pun menambah keragaman. Penambahan keragaman ini membuat enzim xilanase dapat diaplikasikan ke sektor yang belum bisa dijangkau oleh enzim xilanase yang sudah pernah ditemukan sebelumnya. Pleurotus ostreatus merupakan kelas Basidiomycetes yang diketahui memiliki enzim lignolitik. Limbah perkebunan yang digunakan mengandung lignin yang dapat didegradasi oleh enzim lignolitik. Penggunaan P. otreatus dalam skala besar memiliki keuntungan selain mengurangi limbah perkebunan, tubuh buah yang terbentuk dapat dikonsumsi, serta enzim xilanase yang dihasilkan dapat diaplikasikan di industri.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan melakukan seleksi Pleurotus ostreatus dari berbagai daerah yang mensekresikan enzim xilanase dengan memanfaatkan pelepah sawit dan TKKS sebagai media tumbuh.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat untuk mendapatkan isolat
Pleurotus ostreatus yang menghasilkan enzim xilanse serta memaksimalkan penggunaan pelepah kelapa sawit dan TKKS sebagai alternatif media tanam.
BAHAN DAN METODE
Penelitian ini telah dilaksanakan sejak bulan Februari hingga bulan Juni 2014 di Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis PPSHB IPB, Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, FMIPA IPB, Laboratorium Mikrobiologi dan Bioproses, Laboratorium Kimia Pangan, dan Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia.
Bahan
3
beechwood, merah kongo, NaCl 2 M, pelepah kelapa sawit, TKKS, kapur, dedak, dan gypsum, bufer fosfat 0.05 M, DNS (Dinitrosalisilat); Bovine Serum Albumin
(BSA), larutan Bradford, K2Cr2O7 1N, H2SO4 1 N, H2SO4 0.05 N, asam borat 1%,
larutan conway, dan NaOH 40%.
Alat
Alat-alat yang digunakan meliputi laminar biosafety cabinet, spektrofotometer, sentrifusa, vortex, pipet mikro, labu enlenmeyer, tabung eppendorf, penangas air, dan peralatan laboratorium lainnya.
Prosedur Percobaan
Isolasi Pleurotus ostreatus
Isolasi dilakukan dengan mengambil sedikit bagian miselium yang telah tumbuh pada media serbuk gergaji. Miselium yang diambil kemudian ditumbuhkan pada media PDA (9.75 g dalam 250 mL air dalam 250 mL enlemeyer). Kemudian, hasil isolasi diinkubasi pada suhu ruang (27oC) selama 5 hari.
Peremajaan Isolat
Isolat diremajakan pada media agar miring yang berisi PDA. Kemudian, isolat diinkubasi pada suhu ruang selama 5 hari.
Uji Enzim Lignolitik
Isolat hasil pemurnian kemudian ditumbuhkan pada media alkali lignin. Isolat diinkubasi pada suhu ruang selama 4 hari. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya zona merah disekitar koloni P.ostreatus.
Pembuatan Starter
4
Pembuatan Media Pelepah Kelapa Sawit
Pelepah kelapa sawit yang telah dipisahkan dari bagian luarnya dipotong menyerupai batang korek api. Pelepah kelapa sawit dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 70oC selama 48 jam. Pelepah kelapa sawit yang telah kering digiling hingga berukuran 50 mesh. Sebanyak 1700 gram pelepah kelapa sawit dicampurkan dengan 311.1 gram dedak, 31.11 gram gipsum, dan 31.11 gram kapur,. Pembuatan media TKKS menggunakan sebanyak 1700 gram TKKS, 622.2 gram dedak, 62.22 gram gipsum, dan 62.22 gram kapur. Campuran media dimasukkan ke dalam botol jam, kemudian disterilisasi dengan autoklaf sebanyak 2 kali dengan suhu 121oC dan tekanan 1 atm. Pelepah kelapa sawit dalam botol jam didiamkan selama 3 hari. Sebanyak 5 butir jagung yang telah ditumbuhi miselium P. ostreatus dimasukkan ke dalam media pelepah kelapa sawit dan TKKS. Media pelepah kelapa sawit dan TKKS dalam botol jam yang telah ditanam dengan isolat, kemudian inkubasi selama 30 hari pada suhu 27oC di ruang gelap.
Pengukuran Bobot Media
Bobot media pelepah kelapa sawit maupun TKKS diukur sebelum dan sesudah inkubasi 30 hari. Pengukuran dilakukan untuk bobot basah dan bobot kering media. Media yang tidak diinkubasi diukur menggunakan neraca analitik digital dan dihitung sebagai bobot basah media. Media yang telah diukur sebagai bobot basah kemudian dikeringkan pada suhu 70oC selama 24 jam dalam oven. Kemudian, media diukur dengan neraca analitik digital dan terhitung sebagai bobot kering media. Metode ini juga dilakukan untuk mengukur bobot basah dan bobot kering media setelah masa inkubasi 30 hari.
Pengukuran pH Media
Sebanyak 10 gram media dilarutkan dalam 100 mL aquades. Kemudian larutan media diukur menggunakan pH meter. Pengukuran pH dilakukan pada media sebelum dan setelah masa inkubasi 30 hari.
Uji Aktivitas Enzim Xilanase
5 Uji aktivitas enzim dilakukan dengan mengukur sampel, kontrol dan blanko. Sebanyak 10 gram media yang sudah ditumbuhi miselium dicampurkan dengan menggunakan 25 mL bufer fosfat 0.05 M pH 7, kemudian diekstrak menggunakan mortar. Hasil enzim ekstrak kasar disentrifuse pada kecepatan 8000 rpm selama 10 menit. Hasil enzim ekstrak kasar kemudian dipindahkan ke dalam tabung lain. Tabung eppendorf sampel diisi dengan enzim ekstrak kasar sebanyak 300 μL
ditambah 300 μL substrat beechwood 1% dan segera diinkubasi pada suhu 27oC
selama 20 menit. Tabung eppendorf kontrol diisi dengan 300 μL substrat
beechwood 1% ditambah 300 μL hasil enzim ekstrak kasar tanpa diinkubasi. Tabung eppendorf blanko diisi dengan 300 μL substrat beechwood 1% ditambah
300 μL aquades. Sebanyak 600 μL DNS ditambahkan ke dalam setiap tabung,
kemudian dihomogenasikan dengan vortex lalu diinkubasi pada suhu 100oC selama 15 menit. Seluruh sampel diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm (Miller 1959).
Uji Konsentrasi Protein
Standar protein pada uji konsentrasi protein menggunakan bovine serum albumin (BSA). Sebanyak 0.1 gram BSA dilarutkan dengan aquades 100 mL. Kemudian larutan distirer agar homogen. Larutan BSA ditambahkan aquades hingga membentuk konsentrasi 0; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; dan 1.0 mg/mL. Setiap larutan kemudian ditambah larutan Bradford sebanyak 4 mL, kemudian divortex agar homogen. Selanjutnya, sebelum diukur dengan panjang gelombang 595 nm dengan spektrofotometer larutan diinkubasi selama 15 menit. Data yang didapat kemudian dikonversikan menjadi kurva garis hingga didapatkan nilai R sebesar 0.98 – 0.99. Data ini kemudian digunakan sebagai standar uji konsentrasi protein.
Sebanyak 200 μL enzim ekstrak kasar ditambahkan dengan 2 ml pereaksi Bradford kemudian dihomegenasikan menggunakan vortex. Larutan diinkubasi pada suhu 27oC selama 15 menit kemudian diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm (Bradford 1976).
Uji Zona Bening Selulosa
Sebanyak 1 lup isolat ditanam dalam media CMC. Isolat diinkubasi selama 3x24 jam pada suhu 27oC. Media CMC diberi merah kongo hingga seluruh permukaan tertutupi, kemudian didiamkan selama 15 menit. Selanjutnya, media dicuci dengan NaCl 2 M, media didiamkan selama 24 jam pada suhu 4oC. Zona bening yang terbentuk kemudian dihitung untuk menentukan nilai indeks selulolitik (NIS).
Nilai indeks selulolitik = diameter total zona – diameter koloni diameter koloni
Uji Zona Bening Xilan
6
dicuci dengan NaCl 2 M dan didiamkan selama 24 jam pada suhu 4oC. Zona bening yang terbentuk kemudian dihitung untuk menentukan nilai indeks xilan (NIX).
Nilai indeks xilanolitik = diameter total zona – diameter koloni diameter koloni
Uji Kadar Karbon
Sebanyak 0.05 gram sampel yang telah dikeringkan dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL. Sampel diberi 7 mL K2Cr2O7 1 N dan 5 mL H2SO4 1 N (s)
inkubasi pada suhu 100oC selama 2 jam. Larutan berisi sampel dalam labu takar ditera dengan aquades kemudian didiamkan selama 12 jam. Tahap akhir, sampel diukur dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 561 nm. Data yang didapat kemudian dihitung untuk menentukan kadar karbon sampel.
%C = ppm x100% mg sampel x mL H2SO4
Uji Kadar Nitrogen
Sebanyak 0.5 gram sampel yang telah dikeringkan dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL ditambahkan selenium sebanyak 1 gram sebagai katalis dan ditambahkan 20 mL H2SO4 1 N. Sampel ditambahkan larutan H2SO4 1 N
kemudian didiamkan selama ± 12 jam. Tahap selanjutnya yaitu sampel didestruksi dengan suhu bertingkat hingga 350oC . Hasil destruksi didiamkan selama ± 12 jam setelah itu sampel dapat didestilasi. Campuran sampel dibilas dengan aquades sebanyak 3 kali dan ditambahkan NaOH 40%. Campuran yang terdestilasi ditampung dalam enlemeyer yang telah diberi asam borat 1% 20 mL dan ditambahkan dua tetes larutan conway. Hasil destilasi selanjutnya dititrasi dengan H2SO4 0.05 N. Data yang didapat kemudian dihitung untuk menentukan kadar
nitrogen pada sampel.
%N = (mL titran x N H2SO4 x 14) x 100%
mg sampel
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
7 alkali lignin. Isolat yang memiliki enzim lignolitik yaitu isolat BIOTROP dan isolat Gadog. Kedua isolat ini yang selanjutnya diuji aktivitas enzim xilanase yang dihasilkan pada media pelepah kelapa sawit dan media TKKS.
Gambar 1 Jamur penghasil enzim lignolitik. (a) Isolat BIOTROP dan (b) Isolat Gadog yang ditanam pada media alkali lignin.
Setelah masa inkubasi 30 hari, terdapat perbedaan penampilan pada media pelepah kelapa sawit yang tidak ditanami P. ostreatus dan media pelepah kelapa sawit yang ditanami P. ostreatus yaitu adanya perubahan warna dan struktur. Warna media pelepah kelapa sawit berubah dari cokelat kehitaman menjadi cokelat muda. Struktur media pelepah kelapa sawit yang tidak ditanami P. ostreatus memiliki struktur serbuk, tidak menggumpal, dan berukuran 50 mesh. Struktur media pelepah kelapa sawit yang ditanami P. ostreatus memiliki struktur serbuk yang berukuran lebih kecil dari 50 mesh dan menggumpal akibat pertumbuhan miselium. Perubahan yang terjadi seperti yang terlihat pada Gambar 2.
Gambar 2 Struktur media pelepah. (a) Penampakan media sebelum inokulasi (b) penampakan media setelah diinokulasi dengan isolat P. ostreatus
BIOTROP dan (c) penampakan media setelah dinokulasi dengan isolat P. ostreatus Gadog.
Setelah masa inkubasi 30 hari, terdapat perbedaan pada media TKKS yang tidak ditanami P. ostreatus dan media TKKS yang ditanami P. ostreatus yaitu adanya perubahan warna dan struktur. Warna media TKKS berubah dari cokelat kehitaman menjadi cokelat muda. Struktur media TKKS yang tidak ditanami P. ostreatus memiliki serabut lebih kasar, tidak menggumpal, dan sulit diuraikan. Struktur media TKKS yang ditanami P. ostreatus memiliki struktur serabut lebih
a b c
8
mudah diuraikan, lebih halus dan menggumpal akibat pertumbuhan miselium. Perubahan yang terjadi terlihat seperti pada Gambar 3.
Gambar 3 Struktur media TKKS. (a) Penampakan media sebelum inokulasi (b) penampakan media setelah diinokulasi dengan isolat P. ostreatus
BIOTROP dan (c) penampakan media setelah dinokulasi dengan isolat P. ostreatus Gadog.
Perubahan struktur media juga diikuti dengan adanya penurunan bobot media sebesar 9.17% hingga 40.69% pada media pelepah kelapa sawit dan media TKKS. Hal ini berkaitan dengan adanya penurunan nutrisi dan kadar karbon yang terdapat pada media. Kadar karbon yang menurun dapat terlihat pada Tabel 6. Penurunan bobot media terbesar terlihat pada media TKKS yang ditanami isolat BIOTROP yaitu sebesar 40.69%. Penurunan bobot media terkecil yaitu isolat Gadog pada media pelepah kelapa sawit yaitu sebesar 9.17%.
Tabel 1 Bobot basah dan bobot kering media tumbuh Pleurotus ostreatus setelah masa inkubasi 30 hari kering ; W : selisih bobot basah dan bobot kering.
Tabel 2 Nilai pH media hari ke – 0 dan hari ke – 30 Isolat Media Pelepah Kelapa Sawit Media TKKS
9 Media pelepah kelapa sawit mengalami peningkatan pH setelah masa inkubasi 30 hari. Media TKKS mengalami penurunan pH setelah masa inkubasi 30 hari. Adanya perbedaan penurunan dan peningkatan pH media terjadi akibat adanya akumulasi hasil metabolisme yang berbeda dari P. ostreatus dan perbedaan komposisi media pelepah dan TKKS.
Tabel 3 Nilai indeks xilanolitik (NIX) Plerotus ostreatus pada media xilan Isolat Lingkar total zona
(cm)
Lingkar koloni
(cm) Nilai Indeks Xilan
BIOTROP 1.00 0.85 0.18
Gadog 1.05 0.70 0.50
Gambar 4 Pembentukan zona bening isolat P. ostreatus pada media xilan 1%. (a) Isolat BIOTROP dan (b) isolat Gadog pada media xilan setelah inkubasi 24 jam dan diwarnai dengan pewarna merah kongo 1%. Penguraian xilan pada media ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening. Uji zona bening xilanolitik menunjukkan bahwa isolat Gadog maupun isolat BIOTROP menghasilkan enzim xilanase. Isolat Gadog memiliki nilai indeks xilanolitik yang lebih besar daripada nilai indeks xilanolitik isolat BIOTROP sebesar 0.50.
Tabel 4 Nilai indeks selulolitik (NIS) Pleurotus ostreatus pada media CMC Isolat Lingkar total zona
(cm)
Lingkar koloni
(cm) Nilai Indeks Selulolitik
BIOTROP 0.80 0.60 0.33
Gadog 1.20 0.90 0.33
a
10
Gambar 5 Pembentukan zona bening isolat P. ostreatus pada media CMC. (a) Isolat BIOTROP dan (b) isolat Gadog pada media CMC setelah inkubasi 24 jam dan diwarnai dengan pewarna merah kongo 1%. Adanya aktivitas enzim selulolitik terlihat ketika terbentuknya zona bening pada media CMC. Zona bening yang terbentuk terdapat pada media CMC yang ditanami isolat Gadog maupun isolat BIOTROP. Nilai indeks selulolitik (NIS) pada isolat Gadog maupun BIOTROP memiliki nilai yang sama yaitu 0.33.
Gambar 6 Pengukuran aktivitas enzim xilanase
Isolat BIOTROP pada media pelepah kelapa sawit mengalami kenaikan aktivitas enzim dari hari ke-32 hingga hari ke-37 kemudian aktivitas enzim menurun pada hari ke-42. Aktivitas enzim xilanase isolat Gadog pada media pelepah kelapa sawit hanya terukur pada hari ke-37, sedangkan pada hari ke-32 dan hari ke-42 tidak terukur adanya aktivitas. Aktivitas enzim isolat BIOTROP pada media TKKS mengalami kenaikan dari hari ke-32 hingga hari ke-37 aktivitas enzim menurun hingga hari ke-42. Isolat Gadog pada media TKKS terlihat memiliki aktivitas pada hari ke- 32 dan hari ke-42, sedangkan pada hari ke-37 tidak terukur aktivitas enzim. Tidak terukurnya aktivitas enzim pada isolat Gadog pada media pelepah dan isolat Gadog pada media TKKS dapat disebabkan rendahnya jumlah enzim xilanase pada hasil enzim ekstrak kasar. Aktivitas enzim xilanase terbesar dihasilkan isolat Gadog pada media pelepah kelapa sawit yaitu pada hari ke-37 sebesar 0.584 IU/mL.
11
Tabel 5 Pengukuran konsentrasi protein pada enzim ekstrak kasar
Hari
Melalui hasil pengukuran konsentrasi protein yang dilakukan diketahui bahwa konsentrasi protein isolat BIOTROP pada media pelepah kelapa sawit terjadi peningkatan dari hari 32 sampai hari 37 dan menurun pada hari ke-42. Konsentrasi protein isolat Gadog pada media pelepah kelapa sawit mengalami penurunan dari hari ke-32 hingga hari ke-42. Konsentrasi protein isolat BIOTROP pada media TKKS mengalami kenaikan dari hari ke-32 hingga hari ke-37 kemudian turun di hari ke-42. Konsentrasi protein isolat Gadog pada media TKKS meningkat dari hari ke-32 hingga hari ke-42. Konsentrasi protein tertinggi diperoleh dari isolat Gadog pada media TKKS yaitu sebesar 35.6 mg/mL pada hari ke-42. Konsentrasi protein terendah didapat dari isolat BIOTROP pada media pelepah kelapa sawit yaitu sebesar 11.9 mg/mL pada hari ke-42.
12
Kadar karbon pada media yang ditanami P. ostreatus yang mendapat perlakuan tanpa dicuci memiliki nilai yang lebih rendah daripada kadar karbon pada media yang tidak ditanami P. ostreatus. Kadar karbon pada media yang ditanami P. ostreatus yang mendapat perlakuan dicuci memiliki nilai yang lebih tinggi bila dibandingkan dengan media yang tidak dicuci, kecuali kadar karbon pada media TKKS yang ditanami isolat Gadog. Penurunan kadar karbon disebabkan oleh dekomposisi komponen seperti hemiselulosa dan lignin dalam media pelepah kelapa sawit dan TKKS oleh aktivitas P. ostreatus. Perbedaan kadar karbon yang terukur dapat disebabkan karena adanya perbedaan pengambilan media. Media yang digunakan untuk dihitung kadar karbonnya pada perlakuan tanpa dicuci diambil dari lapisan paling atas. Lapisan paling atas ini merupakan lapisan pertama yang digunakan untuk pertumbuhan oleh P. ostreatus, sehingga kadar karbon yang terukur jauh lebih sedikit karena digunakan untuk pertumbuhan miselium. Adanya perbedaan kadar karbon pada media TKKS yang tidak ditanami P. ostreatus dapat disebabkan sampel yang digunakan kemungkinan memiliki kadar karbon yang berbeda. Kadar nitrogen pada media yang telah ditanami P. ostreatus memiliki nilai yang lebih tinggi dibandingkan dengan kadar nitrogen pada media yang tidak ditanami P. ostreatus kecuali pada isolat BIOTROP pada media TKKS. Kadar nitrogen yang meningkat pada media ini dapat diakibatkan nitrogen yang terukur tidak hanya berasal dari protein penyusun media akan tetapi juga enzim yang terdapat pada media ikut terukur. berwarna putih dimiliki oleh spesies Scopulariopsis fusca dan Fusarium oxysporum. P. ostreatus merupakan anggota filum Basidiomycetes. Anggota dari kelompok Basidiomycetes merupakan kelompok jamur yang dapat menghasilkan enzim lignolitik. Isolat yang menghasilkan enzim lignolitik yaitu isolat BIOTROP dan Gadog yang membentuk zona merah pada media alkali lignin. Media alkali lignin yang digunakan merupakan media selektif. Menurut Pelczar dan Chan (1986) media selektif adalah media kompleks yang mengandung senyawa tertentu sehingga hanya mikroorganisme tertentu saja yang dapat hidup. Media alkali lignin merupakan media yang hanya cocok ditumbuhi oleh mikroorganisme penghasil enzim lignolitik. Enzim lignolitik yang dikeluarkan oleh jamur akan berikatan dengan guajacol, sehingga membentuk zona merah pada media. Zona merah ini menandakan bahwa P. otreatus yang ditanam menghasilkan enzim lignolitik yang dapat mendegradasi lignin pada media selektif seperti media alkali lignin (Thorn et al. 1996). Berdasarkan informasi ini, P. ostreatus yang berasal dari BIOTROP dan Gadog yang terpilih untuk diuji pada tahap selanjutnya, yaitu ditanam pada media pelepah kelapa sawit dan TKKS.
13 sebagai sumber karbon bagi P. ostreatus. Adanya perbedaan media sebelum dan setelah diinokulasikan P. ostreatus BIOTROP dan P. ostreatus Gadog yaitu adanya perubahan warna dan struktur pada media. Perubahan warna yang terjadi akibat selulosa, hemiselulosa, dan lignin pada media yang terurai akibat pertumbuhan miselium. Kandungan lignin yang tinggi menyebabkan warna pulp pada pembuatan kertas menjadi lebih gelap (Fatriasari et al. 2009). Perubahan penampilan media juga diikuti perubahan bobot media. Penurunan bobot yang paling signifikan terjadi pada isolat BIOTROP pada media TKKS. Penurunan bobot media seperti yang tertera pada Tabel 1 diakibatkan oleh adanya penurunan kadar karbon dan nutrisi pada media dan peningkatan kadar nitrogen seperti yang tertera pada Tabel 6.
Pertama, menurunnya kadar karbon pada media dapat menyebabkan perubahan warna media dan bobot media baik media pelepah kelapa sawit maupun media TKKS. Sebelum diinokulasi P. ostreatus media pelepah kelapa sawit memiliki kadar karbon lebih besar dari media TKKS, sedangkan kadar nitrogen pada media TKKS lebih besar daripada pada media pelepah kelapa sawit. Diketahui bahwa kadar karbon dan rasio C/N menurun sementara kadar nitrogen naik pada perlakuan media tanpa dicuci. Menurunnya kadar karbon dan rasio C/N diakibatkan adanya aktivitas pertumbuhan dari P. ostreatus memecah selulosa, hemiselulosa, dan lignin untuk digunakan sebagai sumber karbon. Penguraian hemiselulosa menjadi gula – gula sederhana seperti xilosa dan glukosa yang digunakan untuk pertumbuhan dan metabolisme jamur. Penguraian sempurna lignin akan menghasilkan CO2 dan H2O sehingga secara umum akan menurunkan
berat karbon. Media pelepah kelapa sawit yang tidak ditanami P. ostreatus dan diberi perlakuan dicuci mengalami penurunan kadar karbon bila dibandingkan dengan media pelepah yang tidak dicuci dan tidak ditanami P. ostreatus. Penurunan nilai karbon ini diakibatkan oleh pati sebagai penyusun pelepah kelapa sawit larut dalam air. Isolat BIOTROP pada media TKKS perlakuan tanpa dicuci memiliki konsumsi karbon yang lebih tinggi bila dibandingkan dengan isolat pada media lain. Hal ini terlihat dari nilai kadar karbon yang kecil dibandingkan dengan isolat pada media lainnya. Nilai kadar nitrogen terbesar didapat dari isolat Gadog pada media TKKS perlakuan tanpa dicuci. Nilai nitrogen yang terukur merupakan nilai total nitrogen pada media termasuk unsur nitrogen penyusun dinding sel miselium dan enzim yang dihasilkan untuk pertumbuhan yang terdapat pada media. Menurunnya rasio C/N pada media yang ditanami P. ostreatus terjadi akibat pertumbuhan. Meningkatnya rasio C/N pada media TKKS yang ditanami isolat BIOTROP dapat terjadi karena adanya perbedaan perbedaan aktivitas isolat. Hal ini terlihat dari nilai kadar karbon pada media TKKS setelah ditanami isolat BIOTROP tidak berbeda jauh dengan media TKKS yang tidak ditanami
P.ostreatus. Faktor lain yang mendukung nilai rasio C/N yang meningkat akibat aktivitas isolat BIOTROP yang berbeda tercermin dari kadar nitrogen yang lebih rendah daripada kadar nitrogen pada media yang tidak ditanami P. ostreatus.
14
disebabkan oleh aktivitas P. ostreatus. Sumarsih (2010) menyatakan bahwa selama pertumbuhan miselium, akan terjadi perubahan pH pada media tanam, yaitu dengan adanya proses perombakan lignoselulosa dan senyawa organik lain yang menghasilkan asam – asam organik. Adanya penambahan kapur (CaCO3)
pada media untuk mempertahankan pH tetap pada kondisi pH optimum pertumbuhan P. ostreatus. P.ostreatus memiliki pH optimum untuk pertumbuhan berkisar antara 5.5 – 6.5. Isolat Gadog dan isolat BIOTROP pada media pelepah kelapa sawit telah memasuki tahap perombakan protein yang terdapat pada media. Menurut Dazell et al. (1991) adanya penguraian protein untuk pertumbuhan serta diikuti dengan pelepasan amonia yang ada di media dapat menyebabkan peningkatan pH media. Isolat P. ostreatus pada media TKKS diperkirakan belum menguraikan protein yang ada pada media dan adanya akumulasi dari asam – asam organik, sehingga pH media mengalami penurunan. Penguraian protein pada media pelepah kelapa sawit juga disebabkan jumlah dedak sebagai sumber nitrogen hanya setengah dari jumlah dedak yang ditambahkan pada media TKKS. Isolat yang tumbuh pada media TKKS memiliki sumber nitrogen yang lebih banyak daripada isolat yang tumbuh pada media pelepah kelapa sawit. Hal ini lah yang menyebabkan isolat yang tumbuh pada media pelepah kelapa sawit sudah mencapai fase penguraian protein sedangkan isolat pada media TKKS belum sampai fase penguraian protein.
Tahap selanjutnya yaitu tahap pengukuran nilai index xilan (NIX) dilakukan untuk mengetahui keberadaan produksi enzim xilanase oleh P. ostreatus. Melalui NIX terlihat bahwa kedua isolat memiliki enzim xilanase. Uji ini dilakukan untuk meyakinkan bahwa kedua isolat P. ostreatus memiliki enzim xilanase, walaupun saat pengukuran tidak terlihat adanya aktivitas enzim xilanase. Merah kongo digunakan sebagai indikator, indikator ini tidak dapat mengikat monomer – monomer polisakarida. Menurut Teather dan Wood (1982) merah kongo dapat berikatan dengan polisakarida dengan mengenali ikatan β–(1→4) pada polisakarida yang terbentuk. Interaksi ini yang menyebabkan merah kongo dapat berikatan dengan polisakarida dan membentuk kompleks berwarna merah pada media. Terurainya polisakarida menjadi monomer – monomer akibat aktivitas enzim menyebabkan terputusnya ikatan β–(1→4), sehingga merah kongo tidak dapat berikatan dengan monomer polisakarida yang ada pada media. Ketidakmampuan merah kongo berikatan dengan monomer polisakarida mengakibatkan terbentuk zona bening pada media seperti yang terlihat pada Gambar 4 dan Gambar 5.
Satu unit aktivitas xilanase adalah jumlah µmol xilosa yang dihasilkan setiap volume mililiter enzim dalam waktu satu menit (Miller 1959). Adanya isolat yang memiliki aktivitas enzim tidak terukur dapat disebabkan karena hasil enzim ekstrak kasar mengandung sedikit enzim xilanase. Enzim xilanase diketahui dihasilkan oleh isolat BIOTROP dan isolat Gadog dengan aktivitas tertinggi terukur dari isolat Gadog pada media pelepah sebesar 0.584 IU/mL. Namun, untuk pemanfaatan lebih lanjut perlu untuk dilakukannya karakterisasi enzim agar dapat diketahui suhu dan pH optimum dari enzim yang dihasilkan setiap isolat.
15 disebabkan karena protein yang terukur bukan hanya protein bentuk enzim akan tetapi juga protein yang terdapat pada media yang ikut terekstrak. Protein lain dapat yang terukur saat media diekstrak yaitu protein penyusun dinding sel miselium jamur. Perlu diketahui bahwa pertumbuhan miselium pada isolat yang tumbuh di media TKKS jauh lebih pesat dibandingkan dengan isolat yang tumbuh pada media pelepah kelapa sawit. Hal ini didukung dengan penurunan bobot yaitu sebesar 0.584 IU/mL. Hasil pengukuran konsentrasi protein tertinggi diperoleh dari isolat Gadog pada media TKKS yang dipanen pada hari ke-42, yaitu sebesar 35.6 mg/mL. Aktivitas enzim xilanase tidak berbanding lurus dengan jumlah konsentrasi protein yang dihasilkan oleh tiap – tiap isolat pada media tumbuh. Isolat BIOTROP dan Gadog selain menghasilkan enzim xilanase juga menghasilkan enzim selulase dan enzim lignolitik.
Saran
Karakterisasi enzim merupakan uji yang harus dilakukan untuk melengkapi penelitian ini. Hal ini dilakukan agar enzim yang diperoleh dapat diketahui suhu dan pH optimumnya, untuk memudahkan proses aplikasi. Uji C : N yang dilakukan semestinya dibandingkan dengan substrat serbuk gergaji. Serbuk gergaji merupakan media umum yang digunakan untuk budidaya jamur tiram atau
Pleurotus ostreatus.
DAFTAR PUSTAKA
Bradford M M. 1976. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye-binding. Anal Biochem. 72:234-254.doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3.
Biely. 1985. Microbial xylanolytic systems. Trends in Biotechnology. 3:286-290.doi:10.1016/0167-7799(85)90004-6.
Dazell HW, Biddlestone AJ, Gray KR, Thurairajan K. 1991. Produksi dan Penggunaan Kompos pada Lingkungan Tropis dan Subtropis. Jakatra (ID): Yayasan Obor Indonesia.
Dumitriu S. 1998. Polysaccharides : Structural Diversity and Functional Versatility. New York (US): Marcel Dekker, Inc.
16
Teknologi Bioenergi. Jakarta (ID) : PT Agromedia Pustaka.
[GAPKI] Gabungan Pengusaha Kelapa Sawit Indonesia. 2014. Refleksi Industri Kelapa Sawit 2013 dan Prospek 2014 [Internet]. Jakarta (ID). [diunduh
Jaelani. 2008. Jamur Berkhasiat Obat. Jakarta (ID): Pustaka Obor Populer. Kumar KB, Balakrishnan H, Rele M V. 2004. Compatibility of alkaline xylanase
from an alkaliphilic Bacillus NCL (87-6-10) with comercial detergents and protease. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 31: 83-87.doi:10.1007/s10295-004-0119-8.
Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem. 3(31): 426-428.doi:10.1021/ac60147a030. Pahan I. 2006. Panduan Lengkap Kelapa Sawit Manajemen Agribisnis dari Hulu
hingga Hilir. Depok (ID): PT Penebar Swadaya.
Pelczar MJ, Chan ECS. 1986. Elements of Microbiology. New York (US). McGraw-Hill.
Sumarsih S. 2010. Untung Besar Usaha Bibit Jamur Tiram. Jakarta (ID): PT Penebar Swadaya.
Teather RM, Wood PJ. 1982. Use of Cong red-polysaccharide interactions in eumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl Environ Microbiol. 43(4): 777-780.doi:0099-2240/82/0407777-0402.00/0.
Thorn RG, Reddy CA, Haris D, Paul EA. 1996. Isolation of saprophytic Basidiomycetes from soil. Appl Environ Microbiol. 62(11): 4288-4292.doi:0099-2240/96/04.00.0.
Wong KKY, Saddler JN. 1993. Applications of hemicellulases in the food and pulp and paper industries. Hemicelluloses and Hemicellulases. 4:127-143. Viikari L, Kantelinen A, Sundquist J, Linko M. 1994. Xylanases in bleaching :
17
Lampiran 1 Kurva Standar Uji Aktivitas Enzim
18
