Identifikasi Bakteri Endofit Isolat Biogen CC-E76 dengan Teknik 16S rRNA

(1)

IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT ISOLAT BIOGEN

CC-E76 DENGAN TEKNIK PCR 16S rRNA

RIZKI MUHAMMAD PERCEKA

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(2)

(3)

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Bakteri Endofit Isolat Biogen CC-E76 dengan Teknik PCR 16S rRNAadalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Februari 2014

(4)

ABSTRAK

RIZKI MUHAMMAD PERCEKA. Identifikasi Bakteri Endofit Isolat Biogen CC-E76 dengan Teknik PCR 16S rRNA. Dibimbing oleh SURYANI dan TRI PUJI PRIYATNO.

Bakteri endofit merupakan bakteri yang mampu bersimbiosis dengan organisme lain secara mutualisme untuk memenuhi kebutuhan nutrisinya. Bakteri endofit bermanfaat dalam bidang pertanian, terkait dengan perlawanan terhadap patogen atau kemampuan untuk membentuk metabolit yang dapat ditranspor satu sama lain pada bakteri endofit dan jaringan tanaman. Salah satu isolat bakteri endofit yang berhasil dikoleksi adalah isolat Biogen CC-E76. Penentuan strain bakteri endofit ini belum dilakukan. Tujuan penelitian adalah melakukan identifikasi strain bakteri endofit menggunakan teknik PCR 16S rRNA, yaitu teknik identifikasi yang mengacu pada tingkat homologi sekuen RNA subunit kecil yang berukuran 16S pada beragam bakteri. Analisis dilakukan dengan Hasil penyejajaran (blast) sekuen DNA menunjukkan bahwa isolat Biogen CC-E76 merupakan strain bakteri Burkholderia sp. bB24 dengan tingkat homologi sebesar 97%.

Kata kunci: Blast, Burkholderia sp. bB24, Isolat Biogen CC-E76, PCR 16S rRNA.

ABSTRACT

RIZKI MUHAMMAD PERCEKA. Indentification of EndophyticBacteria Biogen CC-E76 Isolate by 16S rRNA PCR Technique. Supervised by SURYANI and TRI PUJI PRIYATNO.

Endophytic bacteria is bacteria, which is capable to symbiosis with other organisms mutualistically to fulfill nutrition needs. Endophytic bacteria is useful in the fields of agriculture, associated with resistance to pathogens or the ability to form a metabolite that can be transported to each other on endophytic bacteria and plant tissues. One of the endophytic bacterial isolate that successfully collected was Biogen CC-E76 isolate. Strain determination of the endophytic bacteria

hasn’t been done. The purpose of this research was to identify endophytic bacteria strain by using 16S rRNA PCR technique, the identifying technique depended on the degree of sequence homology of the small subunit RNA size 16S in diverse bacteria. DNA sequence alignment result (blast) showed that the Biogen CC-E76 isolate is a strain of the bacterium Burkholderia sp. bB24 with homology level of 97%.

(5)

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains

pada

Departemen Biokimia

IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT ISOLAT BIOGEN

CC-E76 DENGAN TEKNIK PCR 16S rRNA

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2014

(6)

(7)

Judul Skripsi : Identifikasi Bakteri Endofit Isolat Biogen CC-E76 dengan Teknik 16S rRNA

Nama : Rizki Muhammad Perceka NIM : G84090039

Disetujui oleh

Dr Suryani, SP, MSc Pembimbing I

Dr Tri Puji Priyatno, MSc Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Ir I Made Artika, MAppSc Ketua Departemen

(8)

PRAKATA

Bismillahirrahmaanirrahiim

Puji serta syukur penulis ucapkan pada Allah, Tuhan semesta alam yang telah mencurahkan nikmat dan kemudahan dalam hidup, hingga penulis mampu menyelesaikan penelitian ini dengan lancar. Tak lupa pula shalawat serta salam kepada Nabi besar penyampai risalah Allah, penerus ajaran Ibrahim dan penutup para nabi yaitu Nabi Muhammad Sallallahu ‘Alaih Wasallam, yang berkat jasa beliau manusia bisa mengenal Allah lewat Islam.

Terima kasih juga penulis ucapkan pada Ibu Dr Suryani, SP, MSc dan Bapak Dr Tri Puji Priyatno, MSc atas bimbingan, arahan berikut kritik dan sarannya dalam penulisan hasil penelitian ini. Secara khusus juga penulis ucapkan terima kasih kepada kedua orang tua penulis Bapak Dadang Djatnika Sukandar dan Ibu Ika Kartarineka atas doa dan dorongan semangat untuk kesuksesan, kelancaran dan kemudahan jalan hidup bagi penulis. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Kakak Rida Nurbanida Hayyinuriah dan Adik penulis Rifan Muhammad Furqon, peneliti dari biogen Bu Ifa dan Mba Pipit serta teman-teman dari biokimia khususnya Ka Faris, Mba Titi, Nasruddin, Solikers, Jarvis dan teman-teman BEM KM IPB yang dengan kepedulian mereka penulis dapat menyelesaikan penelitian ini.

Semoga hasil penelitian ini berguna bagi ilmu pengetahuan khususnya dalam pengembangan dan penerapan ilmu biokimia dalam bidang pertanian.

Bogor, Februari 2014

(9)

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vi

DAFTAR GAMBAR vi

DAFTAR LAMPIRAN vi

PENDAHULUAN 1

METODE 2

Waktu dan Lokasi Penelitian 2

Bahan dan Alat 2

Metode Penelitian 3

HASIL DAN PEMBAHASAN 6

Hasil 6

Pembahasan 10

SIMPULAN DAN SARAN 12

Simpulan 12

Saran 12

DAFTAR PUSTAKA 13

LAMPIRAN 15

(10)

DAFTAR GAMBAR

1 Elektroforegram gel isolat DNATotal 6

2 Elektroforesis agarosa gel produk PCR 16S rRNA 7 3 Kromatogram hasil sequencing isolat Biogen CC-E76 8

4 Hasil blast sekuen isolat Biogen CC-E76 8

5 Pohon filogeni sekuen 16S rRNA 9

DAFTAR LAMPIRAN

1 Alur Penelitian 15

(11)

PENDAHULUAN

Bakteri endofit adalah bakteri yang bersimbiosis dengan tanaman secara mutualisme. Interaksi ini berperan dalam proses penyediaan bahan baku metabolisme seluler dan peningkatan pertahanan tanaman setelah berintegrasi dengan bakteri endofit. Bakteri endofit memperoleh komponen esensial dari tanaman untuk menghasilkan senyawa organik yang dibutuhkan (Eyberger 2006). Pengetahuan tentang bakteri endofit, sifat, karakteristik dan interaksi yang terbentuk dengan inang berperan penting dalam bidang pertanian. Hal ini dapat digunakan untuk meningkatkan produktivitas dan kualitas komoditi pertanian, seperti sifat resistensi terhadap hama tanaman dan kemampuan pemeliharaan tanaman. Bakteri endofit yang bersifat antogonis berpotensi untuk digunakan sebagai agen biokontrol karena relung ekologinya sama dengan patogen tanaman, sehingga aplikasinya dapat mengenai sasaran yang tepat (Strobel et al. 2004). Bakteri endofit juga dapat menghasilkan fitohormon yang mampu menstimulasi perkecambahan dan pertumbuhan tanaman serta meningkatkan serapan hara (Bacon et al. 2000). Peran menguntungkan lain dari bakteri endofit adalah fiksasi nitrogen, peningkatan ketahanan kekeringan, perlindungan termal, kelangsungan hidup dibawah tekanan osmotik dan potensi mendegradasi beberapa polutan (Ezra et al. 2004).

Salah satu koleksi bakteri endofitik yang tersedia di Balai Penelitian Biogen adalah isolat Biogen CC-E76. Isolat bakteri ini diperoleh dari tanaman padi yang memiliki ketahanan yang baik terhadap hama. Penentuan strain isolat bakteri ini belum dilakukan. Oleh karena itu, identifikasi bakteri isolat endofit perlu dilakukan, agar identitasnya dapat diketahui dengan jelas. Cara memperoleh informasi tentang strain bakteri endofit, sangat beragam, mulai dari pengamatan bentuk sel, habitat, ukuran, sampai ke tingkat molekuler. Pengamatan di tingkat molekuler, yaitu identifikasi materi genetiknya, berupa DNA. Perkembangan teknologi informasi genetika memungkinkan penyediaan sarana identifikasi mikroba mengalami perkembangan yang besar. Salah satunya adalah penemuan asam nukleat sebagai materi genetika (Cole et al. 2013).

(12)

2

mengidentifikasi strain bakteri dan hubungan kekerabatan dengan bakteri lain berdasarkan tingkat homologi sekuen nukleotida.

Bakteri endofit mampu berinteraksi dengan tanaman secara mutualisme. Salah satu jenis bakteri endofit telah berhasil dikoleksi, yaitu isolat Biogen CC-E76. Isolat ini belum diketahui dengan jelas strainnya, sehingga perlu dilakukan identifikasi. Identifikasi strain bakteri isolat Biogen CC-E76 dapat dilakukan dengan membandingkan sekuen nukleotida 16S rRNA isolat tersebut dengan sekuen nukleotida DNA yang tersedia pada database NCBI.

Penelitian ini bertujuan melakukan identifikasi bakteri isolat Biogen CC-E76 melalui teknik PCR16S rRNA. Penelitian ini juga bermanfaat untuk memperoleh informasi tentang strain bakteri endofit Biogen CC-E76, sehingga kajian tentang karakteristiknya dapat diaplikasikan pada bidang pertanian, seperti produksi protein rekombinan yang berperan dalam menginduksi ketahanan tanaman terhadap hama.

METODE

Waktu dan Lokasi Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Maret hingga bulan Desember 2013 di Laboratorium Biokimia, Balai Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Bogor.

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat Biogen CC-E76 yang berasal dari daun padi. 10 gL-1 tripton, 10 gL-1 NaCl, dan 5 gL-1 ekstrak khamir, 100 µL-1larutan I (50 mM glukosa, 10 mM EDTA, 25 mM Tris pH 8.0, 2 mgmL-1 lisozyme, 200 µL larutan II (0.2 M NaOH, 1% SDS), 150 µl larutan III (3 M NaOAc pH 4.8), 300 µL phenol kloroform, etanol absolut 2 x volume, 800 µL etanol 70%, 30 µL buffer TE atau ddH2O,larutan PCI, 0.3 g agarosa, 30 mL TBE 0.5x, 1 L EtBr, bufer TBE 0.5x, 1 L loading buffer,17.5 L MW (Molecular Water), 2.5 L Bufer 10x, 0.75 L MgCl2, 1 L dNTPs, 1 L primer forward, 1 L primer reverse dan 0.25 L Taq polymerase, 3.5 L DNA isolat Biogen CC-E76,250 L larutan resuspensi yang mengandung RNAse, 30 L bufer elusi, media LB, bufer lisis dan PCR mix.

(13)

3

Metode Penelitian

Identifikasi Bakteri Isolat Biogen CC-E76 dilakukan dengan membandingkan sekuen nukleotida 16S rRNA dari isolat tersebut dengan sekuen nukleotida yang tersedia pada database. Tahapan awal yang dilakukan adalah isolasi dan purifikasi bakteri isolat Biogen CC-E76 dari akar tanaman padi. Selanjutnya akar padi dihomogenisasi, kemudian homogenat tersebut diinokulasi ke media Luria Bertani (LB) padat. Selanjutnya bakteri isolat Biogen CC-E76 diregenerasi kembali ke media cair Luria Bertani (LB). DNA total bakteri isolat Biogen CC-E76 diisolasi dengan metode alkalin lisis. Hasil isolasi DNA total bakteri isolat Biogen CC-E76 diamati tingkat kemurniannya menggunakan teknik elektroforesis dan spektrofotometri. Setelah diperoleh DNA total murni, kemudian amplifikasi gen 16S rRNA bakteri isolat Biogen CC-E76 dilakukan dengan teknik PCR. Produk amplifikasi gen 16S rRNA selanjutnya dikonfirmasi melalui elektroforesis. Fragmen DNA atau pita yang terbentuk pada gel agarosa diekstraksi kembali untuk keperluan analisis sekuen DNA. Kemudian hasil purifikasi digunakan untuk analisis sekuen DNA melalui proses pengurutan DNA. Sekuen DNA yang telah diperoleh selanjutnya disejajarkan (blast) dengan sekuen DNA yang terdapat pada database. Hasil blast ini digunakan untuk membuat pohon filogenetik, yang menyatakan hubungan kekerabatan berdasarkan tingkat homologi.

Penyegaran Bakteri

Media Luria-Bertani (LB) dibuat sebanyak 100 mL dengan komposisi 10 g/L tripton, 10 g/L NaCl, dan 5 g/L ekstrak khamir. Campuran komposisi media dilarutkan dengan akuades sampai 100 mL. Media dibagi ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 10 mL, kemudian disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada tekanan 1.5 atm dan suhu 121oC. Satu tabung media diinokulasi dengan satu ose isolat Biogen CC-E76 dari stok agar miring. Kultur diinkubasi dalam suhu ruang selama 16 jam sambil digoyang dengan kecepatan 75 rpm (Gozan 2007).

Isolasi DNA Total Bakteri dengan Metode Alkalin Lisis

(14)

4

5 menit. Supernatannya kemudian dibuang, pelet dikering-anginkan lalu diresuspensi dengan 30 µL buffer TE atau ddH2O (Adams 2004).

Elektroforesis Gel Agarosa

Pembuatan Gel Agarosa 1%. Sebanyak 0.3 gram agarosa ditambah dengan 30 mL TBE 0.5x, lalu dipanaskan hingga larut. Setelah larut dengan

sempurna, larutan tersebut dibiarkan sampai hangat, kemudian tambahkan 1 L

EtBr dan kocok perlahan hingga homogen, lalu dituang ke dalam cetakan yang dilengkapi dengan sisir. Campuran tersebut didiamkan selama kira-kira 30 menit sampai gel tersebut benar-benar beku. Gel tersebut kemudian dimasukkan dalam alat elektroforesis dan direndam dengan bufer TBE 0.5x (Boyer 2000).

Elektroforesis Gel Agarosa. Sebanyak 1 L sampel DNA dicampurkan

dengan 1 L loading buffer di atas parafilm dengan menggunakan mikropipet kemudian dimasukkan ke dalam sumur elektroforesis. Setelah elektroforesis selesai, gel dikeluarkan dari alat elektroforesis kemudian dilihat dengan bantuan sinar Ultraviolet (UV). Profil DNA yang terlihat kemudian disimpan dalam perangkat dokumentasi gel (gel-documentation) (Harisha 2007).

Amplifikasi 16S rRNA

Identifikasi bakteri endofit dari isolat Biogen CC-E76 dilakukan berdasarkan sekuen nukleotida 16S rRNA. Amplifikasi fragmen DNA dilakukan dengan sepasang primer 63F (C A G G C C T A) dan 1387R (G G G C G G W G T G T A C A A G G C) menggunakan mesin PCR. Komposisi 20 µL reaksi PCR terdiri dari 2 µL 10x bufer PCR, 1.5 µL 50 mM MgCl2, 0.5 µL 4 mM dNTP, 1 µL 20 mM primer forward, 1 µL 20 mM primer reverse, 0.5 µLTaq Polymerase, dan 13.5 µL air destilasi steril. Reaksi PCR diletakan dalam tabung mikro berukuran 200 µL. DNA cetakan untuk PCR menggunakan koloni tunggal bakteri dari biakan yang berumur 18 jam pada media LB agar. Mesin PCR dijalankan dengan program sebagai berikut, yaitu denaturasi awal DNA pada suhu 94°C selama 10 menit, denaturasi kedua 94°C selama 1 menit, annealing 50°C selama 5 detik, dan extension 72°C selama 1 menit 30 detik dengan siklus sebanyak 35 kali. Penentuan suhu annealing dilakukan secara bertingkat pada interval suhu 50-60oC. Hasil penentuan tersebut menunjukan bahwa suhu annealing yang memberikan hasil amplikon terbaik yang dapat dilihat pada pita elektroforegram, yaitu pada suhu 50oC. Produk PCR diidentifikasi pada gel agarosa yang dielektroforesis dengan 90 volt selama 30 menit dalam bufer TAE (Harisha 2007).

Ekstraksi DNA dari Gel Agarosa

(15)

5 absolut yang dilakukan dalam suhu rendah selama 15 menit. Tahap selanjutnya sampel disentrifugasi pada 10.000 rpm selama dua puluh menit, lalu diambil peletnya dan ditambahkan 500 µL etanol 70%. Kemudian sentrifugasi pada 10.000 rpm selama lima menit lalu divakum dan diresuspensi dengan 15 µL H2O (Ali 2009).

Pengurutan (sequencing) dan Analisis Sekuen Basa Nukelotida

DNA produk hasil amplifikasi (amplikon) 16S rRNA Isolat Biogen CC-E76 yang telah diperoleh lalu diurutkan basa nukleotidanya. Pengurutan basa nuleotida (sequencing) dilakukan di PT. Genetika Science Indonesia, Jakarta. Hasil sekuen selanjutnya dianalisis dengan program bioinformatika yaitu dengan program BLASTX (www.ncbi.nlm.nih.gov). Program BLASTX mentranslasi sekuen nukleotida menjadi protein, kemudian membandingkannya dengan protein yang terdapat pada pangkalan data (database). Homologi yang tinggi ditunjukkan dengan nilai skor bits yang semakin besar (>150) dan E value yang kecil (<10-4) (Matthaiou et al. 2010).

Hasil pengurutan basa nukleotida 16S rRNA dianalisis dengan software Blastn yang terdapat dalam situs National Center for Biotechnology Information (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov) untuk mengetahui tingkat kekerabatan terdekat dengan bakteri yang ada di dalam Database GeneBank (NCBI). Analisis tingkat kemiripan runutan DNA antara strain dalam satu spesies dan antara spesies dalam satu genus dilakukan dengan program interaktif format Fasta yang telah disediakan oleh GeneBank. Selanjutnya sekuen 16S rRNA dalam GeneBank yang mempunyai kekerabatan dengan sekuen 16S rRNA dari isolat digunakan untuk analisis pohon filogenetika (Sousa et al. 2010).

Analisis Filogenetika

(16)

6

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

DNA Total Isolat Biogen CC-E76

DNA total isolat Biogen CC-E76 diperoleh dari metode isolasi total DNA bakteri dengan metode alkalin lisis. Analisis DNA yang dilakukan berupa analisis kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif dilakukan dengan mengamati kualitas pita DNA yang terbentuk pada elektroforegram, sedangkan analisis kuantitatif dilakukan dengan mengamati kemurnian DNA total secara spektrofotometri. Elektroforegram dari isolasi DNA bakteri ditunjukkan oleh Gambar 1. Penentuan ukuran DNA dapat dilakukan menggunakan marker atau penanda ukuran DNA. Berdasarkan hasil pengamatan, ukuran DNA total isolat Biogen CC-E76 lebih dari 3.000 pb. Pita DNA yang terbentuk terlihat utuh (tidak terfragmentasi) dan tanpa ada pengotor atau kontaminan. Selanjutnya, isolat Biogen CC-E76 dianalisis kualitas kemurniannya menggunakan spektrofotometer. Kualitas kemurnian DNA ditentukan dengan rasio 260/280 dan rasio 260/ 230. Hasil analisis menunjukkan bahwa memiliki nilai rasio 260/280 sebesar 1.905; sedangkan nilai rasio 260/ 230 pada sampel adalah 2.063.

(a) (b)

Gambar 1 Elektroforegram isolat DNATotal (a) Isolat Biogen CC-E76 (b) marker DNA 100 kb

Tabel 1 Pengukuran kualitas isolat DNA Biogen CC-E76 dengan spektrofotometer

230 260 280 260/230 260/280

Isolat Biogen CC-76 0.143 0.562 0.295 2.063 1.905 Lebih dari

(17)

7

Amplikon 16S rRNA Isolat Biogen CC-E76

DNA total isolat Biogen CC-E76 digunakan sebagai cetakan (template) untuk mengamplifikasi atau memperbanyak fragmen 16S rRNA dengan teknik PCR. Selanjutnya, produk PCR kemudian dianalisis dengan teknik elektroforesis gel agarosa. Elektroforegram dari 16S rRNA dapat dilihat pada Gambar 2. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa ukuran fragmen 16S rRNA sekitar 1500 bp. Pita yang terbentuk pada elektroforegram menunjukkan kemurnian produk PCR yang dielektroforesis, yaitu tidak terbentuknya pita atau fragmen DNA tambahan pada elektroforegram. Selain itu, produk PCR berhasil diamplifikasi dengan baik tanpa terbentuknya primer dimer yang ditunjukkan oleh pembentukan pita tunggal pada elektroforegram.

(a) (b)

Gambar 2 Elektroforesis agarosa gel produk PCR 16S rDNA (a) isolat Biogen CC-E76 (b) Marker DNA 1 kb

Urutan Nukleotida dan Pohon Filogeni 16S rRNA

Pita yang terbentuk pada gel agarosa produk PCR 16S rRNA dari isolat Biogen CC-E76 diekstraksi. Ekstrak DNA selanjutnya digunakan untuk pengurutan (sequencing) DNA. Urutan nukleotida yang diperoleh setelah proses DNA sequencing, dibandingkan dengan sekuen DNA yang berada pada database (blast). Selanjutnya, hasil blast ditampilkan pada Gambar 3. Berdasarkan hasil pengamatan tingkat homologi, diperoleh bahwa sekuen 16S rRNA strain bakteri Burkholderia sp. bB24(2011) mempunyai tingkat homologi yang paling tinggi, yaitu sebesar 97% dengan galat (E value) sebesar 0.0. Kemudian sekuen DNA dianalisis hubungan kekerabatannya melalui pengamatan pohon filogeni, semakin besar tingkat homologinya maka kekerabatannya semakin dekat. Pohon filogeni dari isolat Biogen CC-E76 dapat diamati pada Gambar 4, yang menunjukkan bahwa isolat Biogen CC-E76 berkerabat dekat dengan Burkholderia sp. (JF772524) dengan derajat divergensi sebesar 0.02.

(18)

8

Gambar 3 Kromatogram hasil sequencing isolat Biogen CC-E76

Accession Description Max

score

Query coverage

E

value Max ident

JF772524.1 Burkholderia sp. bB24(2011) 16S ribosomal RNA

gene, partial sequence 2374 97% 0.0 99%

EF114394.1 Burkholderia cepacia isolate MSMB3 16S ribosomal

RNA gene, partial sequence 2374 97% 0.0 99%

EF114397.1 Burkholderia cepacia isolate MSMB36 16S

ribosomal RNA gene, partial sequence 2370 97% 0.0 99%

AB362772.1 Burkholderia cepacia gene for 16S rRNA, partial

sequence, strain: CR2 2368 97% 0.0 99%

JF701980.1 Burkholderia sp. YXE3-19 16S ribosomal RNA

JF833830.1 Uncultured Burkholderia sp. clone D330 16S

AY741362.1 Burkholderia cepacia strain ATCC 53130 16S

AY640618.1 Burkholderia sp. CBPB-MNP 16S ribosomal RNA

(19)

9

(20)

10

Pembahasan

DNA Total Isolat Biogen CC-E76

Isolasi DNA total isolat Biogen CC-E76 merupakan tahapan awal yang dilakukan untuk memisahkan DNA dari komponen seluler lainnya (protein, karbohidrat, lipid), sehingga analisis DNA dapat dilakukan dengan baik. Isolasi DNA memiliki tiga tahapan umum. Pertama, dinding dan membran sel bakteri dirusak untuk membantu ekstraksi dari komponen yang dikehendaki. Proses selanjutnya dikerjakan pada kondisi yang baik hingga dapat menghambat atau menghancurkan turunan enzim yang dihasilkan dalam perusakan bakteri. Ketiga, digunakan prosedur pemisahan yang menghasilkan makromolekul yang dikehendaki (DNA) (McCleary 2001). Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA adalah sentrifugasi dan purifikasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Selanjutnya purifikasi DNA dilakukan dengan memisahkan matriks atau debris sel yang terbentuk menggunakan etanol (Metzler 2003). Analisis kemurnian DNA total dilakukan dengan teknik spektrofotometri pada panjang gelombang 230, 260 dan 280 nm. Nilai absorbansi yang diperoleh pada panjang gelombang 230, 260 dan 280 nm menunjukkan keberadaan kontaminan, DNA dan RNA dalam sampel. Tingkat kemurnian DNA dapat diperoleh dari rasio absorbansi DNA terhadap kontaminan (260/230) maupun DNA terhadap RNA (260/280). Kemurnian DNA ditandai dengan nilai rasio absorbansi 260/280 lebih dari 1.8 atau nilai rasio absorbansi 260/230 berada dalam interval 2.0 dan 2.2 (Harisha 2007). Hasil pengamatan menunjukkan bahwa DNA total isolat Biogen CC-E76 memiliki tingkat kemurnian yang tinggi. Hal ini ditunjukkan oleh nilaiabsorbansi 260/280 sebesar 1.905 dan absorbansi 260/230 sebesar 2.063.

(21)

11 DNA total yang terisolasi merepresentasikan campuran DNA nukleus dan DNA ribosomal (Donzelli et al. 2001).

Amplikon 16S rRNA Isolat Biogen CC-E76

Amplifikasi atau penggandaan DNA dilakukan untuk meningkatkan jumlah sekuen DNA yang diinginkan. Fragmen DNA yang telah digandakan berperan penting dalam proses analisis, sehingga analisis DNA bisa dilaksanakan dengan baik. Teknik amplifikasi DNA biasanya dilakukan dengan teknik PCR (polymerase chain reaction). Teknik ini membutuhkan beberapa komponen penting, seperti primer (yang menginisiasi proses pemanjangan), dNTP yang menyediakan sumber basa, enzim Taq polymerase dan MgCl2 (Shetty 2009). Amplifikasi gen 16S rRNA isolat Biogen CC-E76 dilakukan untuk kebutuhan analisis selanjutnya, yaitu proses analisis kualitatif dalam penentuan strain bakteri yang digunakan berdasarkan susunan informasi genetiknya. Sekuen 16S rRNA merupakan sekuen DNA pada subunit kecil ribosom bakteri. Biasanya, sekuen ini digunakan untuk mengidentifikasi isolat bakteri berdasarkan tingkat homologi sekuen DNA karena bersifat spesifik pada organisme prokariot. Produk PCR gen 16S rRNA isolat Biogen CC-E76 yang diperoleh pada tahapan amplifikasi DNA diperlukan dalam proses elektroforesis. Elektroforesis diperlukan dalam mengidentifikasi ukuran fragmen DNA yang diamati dan dibandingkan dengan referensi. Menurut Lim et al.(2012), gen 16S rRNA pada hampir semua bakteri, biasanya berukuran 1.5 kb dengan susunan basa yang berbeda satu sama lain. Hal ini sejalan dengan ukuran pita yang diperoleh dari elektroforegram produk PCR sampel DNA yang ditunjukkan oleh gambar 2. Kondisi ini menunjukkan bahwa isolat Biogen CC-E76 mempunyai gen 16S rRNA yang berukuran 1.5 kb. Pita yang terbentuk pada elektroforegram juga menunjukkan bahwa fragmen DNA teramplifikasi dengan baik tanpa adanya kontaminan, yang ditandai dengan kejelasan pita yang terbentuk. Selain itu, gambaran pita yang jelas dan ukuran fragmen gen yang sesuai menunjukkan bahwa proses amplifikasi DNA berlangsung dengan baik, tanpa pembentukan pita lain yang berukuran lebih kecil. Pembentukan pita tambahan yang berukuran lebih kecil menunjukkan pembentukan dimer primer (miss priming) (Ulrich et al.2008). Hasil ini diperlukan untuk meningkatkan keakuratan proses isolasi dan amplifikasi pada tahapan sebelumnya, sehingga sampel DNA yang telah diamplifikasi siap untuk digunakan pada tahapan selanjutnya. Tahapan ini dilanjutkan dengan tahapan DNA sequencing, yaitu tahapan penentuan urutan nukleotida gen ini.

Urutan Nukleotida dan Pohon Filogeni 16S rRNA

(22)

12

menunjukkan basa sitosin, timin, adenin dan guanin (Metzler 2003). Selanjutnya, sekuen yang diperoleh dibandingkan dengan sekuen DNA yang tersedia pada database melalui proses penyejajaran (blast). Hasil blast menunjukkan bahwa sekuen DNA 16S rRNA isolat Biogen CC-E76 homolog terhadap sekuen 16S rRNA bakteri Burkholderia sp. dengan tingkat homologi paling tinggi (sebesar 97%), sehingga dapat disimpulkan bahwa isolat Biogen CC-E76 memiliki kemiripan dengan bakteri Burkholderia sp. karena mempunyai homologi yang paling tinggi, dibandingkan strain bakteri lain berdasarkan hasil blast. Tahapan selanjutnya adalah pembuatan pohon filogeni berdasarkan sekuen 16S rRNA yang diperoleh dari hasil penyejajaran (blast). Hasil pengamatan pada pohon filogeni menunjukkan kekerabatan berdasarkan derajat divergensi, yaitu derajat atau nilai yang menunjukkan heterogenitas sekuen basa hasil penyejajaran dari setiap sekuen 16S rRNA. Semakin kecil nilai derajat divergensi, maka semakin dekat kekerabatannya. Isolat Biogen CC-E76 memiliki kekerabatan yang paling dekat dengan Burkholderia sp. bB24 dengan derajat divergensi sebesar 0.02 (Doxey et al. 2007). Derajat divergensi sebesar 0.02 menunjukkan bahwa tingkat homologi sekuen nukleotida 16S rRNA isolat Biogen CC-E76 dan sekuen nukleotida Burkholderia sp. bB24 yang berasal dari database sebesar 97%, dengan perbedaan sekuen basa penyusunnya sebesar 2%.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Identifikasi bakteri isolat Biogen CC-E76 dilakukan dengan teknik PCR 16S rRNA. Amplikon yang terbentuk dari amplifikasi 16S rRNA isolat Biogen E76 berukuran 1500 bp. Penyejajaran (blast) sekuen 16S rRNA isolat Biogen CC-E76 memberikan informasi bahwa strain bakteri isolat Biogen CC-CC-E76 memiliki kemiripan dengan bakteri Burkholderia sp. bB24 dengan tingkat homologi sebesar 97% dan derajat divergensi sebesar 0.02.

Saran

(23)

13

DAFTAR PUSTAKA

Adams DJ. 2004. Fungal cell wall chitinases and glucanases. Microbiology. 150: 2029-2035.

Boyer R. 2000. Modern Experimental Biochemistry. San Francisco: Benjamin-Cummings.

Brown TA. 2010. Gene Cloning & DNA Analysis: An Introduction Ed ke-6. Oxford: Wiley-Blackwell.

Cole JR, Wang Q, Fish JA, Chai B, McGarrell DM, Sun Y, Brown CT, Porras-Alfaro A, Kuske CR, Tiedje JM. 2013. Ribosomal database project : data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research 42: 633-642. Donzelli B, Lorito M, Scala F, Harman G. 2001. Cloning, sequence and structure

of a gene encoding an antifungal glucan 1,3-beta-glucosidase from Trichoderma atroviride (T. harzianum). Gene 277: 199-208.

Doxey AC, Yaish MW, Moffatt BA, Griffith M, McConkey BJ. 2007. Functional divergence in the Arabidopsis β-1,3-glucanase gene family inferred by phylogenetic reconstruction of expression state. Mol Biol Evol 24: 1045-1055. Eyberger AL, Dondapati R, Porter JR. 2006. Endophyte fungal isolates

from Podophyllum peltatum produce podophyllotoxin. J. Nat. Prod., 69: 1121-1124.

Ezra D, Hess WM, Strobel GA, 2004. New endophytic isolates of Muscodor albus, a volatile-antibiotic-producing fungus. Microbiology, 150: 2023-2031.

Gozan M. 2007. Sakarifikasi dan fermentasi bagas menjadi ethanol menggunakan enzim selulase dan enzim sellobiase. Jurnal Teknologi 3: 209-215.

Harisha S. 2007. Biotechnology Procedures and Experiments Hanbook. New Delhi: Infinity Science Press.

Lim JS, Choi BS, Choi AY, Kim KD, Kim DI, Choi IY, Ka JO. 2012. Complete Genome Sequence of the Fenitrothion-Degrading Burkholderia sp. Strain YI23. J.Bacteriol.194:896-896.

Matthaiou DK, Chasou E, Atmazidis S, Tsolkas P. 2010. A case of bacteremia due to Burkholderia cepacia in a patient without cystic fibrosis.Respiratory Medicine CME 4: 144-145.

McCleary BV. 2001. Analysis of feed enzyme. Enzyme in Farm Animal Nutrition 4: 85-107.

Metzler DE. 2003. Biochemistry: The Chemical Reactions of Living Cells. Burlington: Elsevier Academic Press.

[NCBI] National Center for Biotechnology Information. 2013. Basic Local

Alignment Search Tools.[terhubung berkala].

www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi/ [8 November 2013].

(24)

14

lentinan degradation and fruiting body senecence. Plant Physiology 141: 793-801.

Shetty NP, Jensen JD, Knudsen A, Finnie C, Geshi N, Blennow A, Collinge DB, Jorgensen HJL. 200λ. Effect of β-1,3-glucan from Setoria tritici on structural defence responses in wheat. Journal of Experimental Botany 60: 4287-4300. Sousa SA, Ramos CG, Leitão JH. 2010. Burkholderia cepacia Complex: emerging

multihost pathogens equiped with a wide range of virulence factors and determinants. International Journal of Microbiology 2011: 1-9.

Strobel G, Daisy B, Castillo U, Harper J. 2004. Natural products from endophytic microorganisms. J. Nat. Prod., 67: 257-268.

Ulrich RS, Zimring C, Zhu X, DuBose J, Seo HB, Choi YS, Quan X, Joseph A. 2008. A review of the research literature on evidence-based healthcare design. Health Environments Research and Design Journal, 1(3), 61–125.

(25)

15

LAMPIRAN

Lampiran 1 Alur Penelitian

Penyegaran bakteri

Isolasi DNA Total Bakteri

dengan Metode Alkalin Lisis

Elektroforesis Gel Agarosa

Amplifikasi 16S rRNA

Ekstraksi DNA dari Gel

Agarosa

Pengurutan (

sequencing

) dan

Analisis Sekuen Nukelotida

(26)

16

Lampiran 2 Sekuen 16S rDNA isolat Biogen CC-E76.

(27)

17

RIWAYAT HIDUP

Penulis adalah anak kedua dari Bapak Dadang Djatnika dan Ibu Ika Kartarineka.Penulis lahir di Garut, tanggal 28 Agustus 1991.Mengawali pendidikan kegiatan belajar dari TK Al-Musadaddiyah Garut, lalu SDN REGOL XII, MTs Darul Arqam Muhammadiyah Garut, MA Darul Arqam Muhammadiyah Garutdan sekarang di Departemen Biokimia Institut Pertanian Bogor.Prestasi yang pernah diraih selama kuliah, yaitu Juara 1 Lomba Fotografi

“Polemik Energi Negeri Indonesia” Almamater Sakti Kastrad BEM FMIPA IPB

2011, Juara 1 Lomba Pekan Ilmiah Mahasiswa FMIPA (PIPA) 2011.PKM didanai DIKTI : HERB 1.0 :Model Alternatif ProgramPeningkatan Pengetahuan Dan Minat Terhadap Obat Herbal Melalui Permainan Edukatif Kepada Siswa SMAN Di Bogor.PKM didanai DIKTI : Kajian In Vitro Takokak (Solanum torvumSwartz) sebagai Peluruh Batu Ginjal. Selama kuliah penulis pernah mengikuti organisasi kemahasiswaan sebagai anggota divisi Komunikasi dan Informasi BEM TPB IPB 2010, Ketua Divisi Acara Open House BEM TPB IPB,anggota divisi advokasi dan kesejahteraan mahasiswa BEM FMIPA IPB 2011,ketua divisi humas Biochemistry Champion League 2011,ketua divisi humas MPD Biokimia 47,ketua divisi dana usaha dan sponsorship Pesta SainsNasional 2011, Kepala Departemen Sains dan Teknologi BEM FMIPA IPB 2012, Steering Comitee Explo-Science 2012, Ketua Pesta Sains Nasional 2012, Education Guide Kalbe Junior Science Fair 2013, Steering Comitee Road to ISEE,Steering Comitee