ZIMOGRAM AKTIVITAS KOLAGENASE
DARI
Bacillus licheniformis
F-11.1 DAN F-11.4
ISNAWATI PUSPITA
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
ABSTRAK
ISNAWATI PUSPITA. Zimogram Aktivitas Kolagenase Bacillus licheniformis F-11.1 dan F-11.4. Dibimbing oleh SRI BUDIARTI dan MAGGY T. SUHARTONO.
Bacillus licheniformis F-11.1 dan F-11.4 merupakan strain dari bakteri B. licheniformis F-11 yang diisolasi dari limbah udang di Palembang, Indonesia. Kedua bakteri tersebut telah mengalami perlakuan mutasi pada operon Asam Poliglutamat (PGA) dan kitinase-AB sehingga tidak memiliki aktivitas kitinase, tetapi memiliki aktivitas protease yang tinggi. Enzim kolagenase berperan penting dalam pelunakan daging dan mempercepat penyembuhan luka. Pemekatan enzim dapat dilakukan salah satunya dengan cara mengendapkan protein dengan amonium sulfat yang dapat menstabilkan enzim sehingga mengurangi denaturasi protein. Zimogram merupakan teknik elektroforesis untuk mengetahui adanya aktivitas suatu enzim secara kualitatif pada gel elektroforesis. Tujuan penelitian ini adalah menganalisis aktivitas kolagenase dari Bacillus licheniformis F-11.1 & F-11.4 secara kualitatif menggunakan teknik zimogram. Analisis dilakukan terhadap kedua isolat yang ditumbuhkan pada tiga media tumbuh, yaitu LB+5% kolagen (LBC), ½LB+5% kolagen (LBHC), dan 5% kolagen (CLG). Pertumbuhan sel kedua isolat lebih baik pada media LBC. Zimogram menunjukkan Bacillus licheniformis F-11.1 dan F-11.4 menghasilkan kolagenase pada ketiga media tumbuh yang ditambahkan kolagen sebagai substrat pertumbuhan. Hal tersebut ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening pada gel akibat degradasi kolagen oleh kolagenase. Isolat B. licheniformis F-11.1 menghasilkan fraksi terbanyak dari enzim ekstrak kasar yang berasal dari media tumbuh LBC sebanyak 32 fraksi. Sementara itu, isolat B. licheniformis F-11.4 menghasilkan fraksi terbanyak dari enzim ekstrak kasar yang berasal dari media tumbuh LBHC sebanyak 37 fraksi.
ABSTRACT
ISNAWATI PUSPITA. Zimogram Collagenase Activity From Bacillus licheniformis F-11.1 and F-11.4. Supervised by SRI BUDIARTI and MAGGY T. SUHARTONO.
Bacillus licheniformis F-11.1 and F-11.4 are strains from B. lichniformis F-11 were isolated from shrimp shell waste in Palembang, Indonesia. They has poliglutamat acid mutation in the operon (PGA) and chitinase AB, so it doesn’t have chitinase activity, but high protease activity. Collagenase plays an important role in the softening of meat and the wound healing process. Precipitation enzyme can use ammonium sulfate to stabilize the enzyme, therebly reducing protein denaturation. Zimogram is an electrophoresis technique to determine the activity of an enzyme in situ and qualitative results of the gel electrophoresis. This research was conduct to analyze the activity Bacillus licheniformis F-11.1 and F-11.4 collagenase qualitatively using techniques zimogram. Analysis is performed on both isolates that grown in three growth media, ie LB + 5% collagen (LBC), ½ LB + 5% collagen (LBHC), and 5% collagen (CLG).
ZIMOGRAM AKTIVITAS KOLAGENASE
DARI
Bacillus licheniformis
F-11.1 DAN F-11.4
ISNAWATI PUSPITA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul
: Zimogram Aktivitas Kolagenase dari
Bacillus licheniformis
F-11.1
dan F-11.4.
Nama
: Isnawati Puspita
NIM :
G34080065
Menyetujui :
Mengetahui
Ketua Departemen Biologi
Dr. dr. Sri Budiarti
Pembimbing 1
Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono
Pembimbing 2
Tanggal lulus :
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas rahmat-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Penelitian ini dilakukan mulai Desember 2011 sampai Juli 2012, di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia PPSHB, Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Terpadu, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Judul yang diambil dalam penelitian ini adalah Zimogram Aktivitas Kolagenase Dari Bacillus licheniformis F-11.1 dan F-11.4. Karya ilmiah ini merupakan salah satu syarat untuk mendapatkan glar sarjana sains di Intitut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. dr. Sri Budiarti dan Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono atas bimbingan dan arahan yang diberikan selama mengerjakan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Ibu Ika (Laboran Lab Mikrobiologi dan Biokimia, PPSHB, IPB), Bapak Ace Baehaki, Ibu Diana, dan teknisi laboratorium terpadu serta laboratorium mikrobiologi, Departemen Biologi, Ipb, atas bantuan yang diberikan selama penulis melakukan penelitian di laboratorium tersebut. Tak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada kedua orang tua atas doa, dukungan, kekuatan, kesabaran, dan semangat yang diberikan selama ini. Terima kasih penulis ucapkan pula kepada teman-teman biologi 45, biologi 46, Biologi 44, dan penghuni kost Madep yang senantiasa memberi semangat kepada saya. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Putri Ramadani, Desi Setianingsih, Ratu Aqila, A. Traya S., Dewi Senja R. S.Si, Suwaibatul A, Wathri Fitrada, dan Cindy T. S.Si yang telah membantu, menemani, dan memberikan motivasi kepada penulis selama ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Januari 2013
RIWAYAT HIDUP
Isnawati Puspita dilahirkan di Tasikmalaya pada tanggal 06 Juni 1990 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara dari pasangan Nano Sumarno dan Euis Apipah. Penulis memulai pendidikannya dari SD N 04 Cipayung, SMP N 9 Jakarta, dan SMA N 64 Jakarta. Kemudian, penulis melanjutkan pendidikannya di Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor pada tahun 2008.
Pada tahun 2010, penulis melakukan studi lapang di Taman Wisata Alam dan Cagar Alam Pangandaran dengan judul makalah Keanekaragaman Morfologi Batang Pohon di Pangandaran Dan Potensinya. Selanjutnya, penulis juga melakukan praktek lapang pada tahun 2011 di Rumah Sakit Pusat Angkatan Udara (RSPAU) dr. Esnawan Atariksa dengan judul makalah Pemeriksaan Klinis di Laboratorium RSPAU dr. Esnawan Antariksa, Halim Perdanakusuma, Jakarta.
Selama menjadi mahasiswa Institut Pertanian Bogor, penulis aktif dalam berbagai kegiatan kemahasiswaan. Penulis pernah menjadi bendahara divisi Pengembangan Dan Sumberdaya Masyarakat (PSDM) dalam organisasi Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) pada tahun 2009-2010. Kemudian, ia juga pernah menjadi ketua divisi Informasi Dan Komunikasi (Infokom) Himabio pada tahun 2010-2011. Pada tahun 2011, ia juga aktif menjadi penanggung jawab dan tim penulis majalah Chepalos. Penulis juga aktif dalam kegiatan drama musikal Bacillus Biologi sebagai director, script writer, dan official team
selama 3 tahun. Selan itu, ia juga aktif diberbagai kepanitiaan kegiatan kampus, seperti Biologi Interaktif, Lomba Cepat Tepat Biologi (LCTB), Bina Desa, Masa Pengenalan Departemen Biologi, dan
vii
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ... viii
DAFTAR LAMPIRAN ... viii
PENDAHULUAN ... 1
Latar Belakang ... 1
Tujuan ... 1
BAHAN DAN METODE ... 1
Waktu dan Tempat ... 1
Bahan dan Alat ... 1
Metode ... 1
Pembuatan Kolagen ... 1
Peremajaan Isolat ... 2
Pembuatan Inokulum ... 2
Produksi Enzim Kolagenase ... 2
Pemekatan Enzim Ekstrak Kasar ... 2
Zimogram Aktivitas Kolagenase ... 2
HASIL ... 3
Pertumbuhan Sel dan Kadar Protein Enzim ... 3
Zimogram Aktivitas Kolagenase ... 4
PEMBAHASAN ... 6
SIMPULAN ... 7
SARAN ... 7
DAFTAR PUSTAKA ... 7
viii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Kurva Pertumbuhan Sel dan Kadar Protein Enzim Isolat F-11.1 pada media LBC ... 3
2. Kurva Pertumbuhan Sel dan Kadar Protein Enzim Isolat F-11.1 pada media LBHC ... 3
3. Kurva Pertumbuhan Sel dan Kadar Protein Enzim Isolat F-11.1 pada media CLG ... 3
4. Kurva Pertumbuhan Sel dan Kadar Protein Enzim Isolat F-11.4 pada media LBC ... 4
5. Kurva Pertumbuhan Sel dan Kadar Protein Enzim Isolat F-11.4 pada media LBHC ... 4
6. Kurva Pertumbuhan Sel dan Kadar Protein Enzim Isolat F-11.4 pada media CLG ... 4
7. Hasil zimogram, jumlah fraksi dan jumlah protein dari enzim ekstrak kasar isolat B. licheniformis F-11.1 yang tumbuh pada media LBC, LBHC, dan CLG ... 5
8. Hasil zimogram, jumlah fraksi, dan jumlah protein enzim ekstrak kasar dari isolat B. licheniformis F-11.4 yang tumbuh pada media LBC, LBHC, dan CLG .... 5
9. Hasil zimogram, jumlah fraksi, dan jumlah protein enzim semi murni dari isolat B. licheniformis F-11.1 yang tumbuh pada media LBC, LBHC, dan CLG. ... 5
10. Hasil zimogram, jumlah fraksi, dan jumlah protein enzim semi murni dari isolat B. licheniformis F-11.4 yang tumbuh pada media LBC, LBHC, dan CLG ... 6
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Diagram Metode Pembuatan Kolagen ... 10
2. Komposisi Media Luria Bertani Agar (LBA) dan Media LB (Inokulum) ... 10
3. Media Produksi LBC, LBHC, dan CLG ... 10
4. Komposisi Larutan Bradford ... 10
5. Komposisi Larutan BSA, Konsentrasi, dan Kurva Standar BSA ... 11
6. Persentase Penggunaan Amonium Sulfat Pada Proses Pemekatan ... 12
7. Komposisi dan cara membuat Larutan 50 mM Bufer Fosfat pH 7 ... 13
8. Metode Zimogram ... 13
9. Komposisi Gel Penahan dan Gel Pemisah ... 14
10. Komposisi Larutan Akrilamid, Bufer Gel Pemisah, dan Bufer Gel Penahan ... 14
11. Komposisi Larutan Bufer Sampel ... 14
12. Komposisi Bufer Elektroforesis pH 8.3 ... 14
13. Komposisi dan cara membuat Larutan 50 mM Bufer Fosfat pH 9 ... 15
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Enzim merupakan golongan protein yang banyak terdapat di dalam sel hidup dan berperan penting sebagai biokatalisator pada proses biokimiawi dalam sel (Trismilah & Sumaryanto 2005). Penggunaan enzim saat ini sudah mengalami peningkatan. Enzim memiliki sifat yang sensitif, selektif, dan spesifik terhadap suatu substrat sehingga enzim banyak digunakan oleh industri. Salah satu enzim yang banyak digunakan adalah enzim protease. Rao et al. (1998) melaporkan 65% dari enzim yang dijual di dunia adalah enzim protease. Protease merupakan enzim yang memiliki daya katalitik spesifik dan efisien terhadap ikatan peptida pada protein. Salah satu enzim yang tergolong protease adalah kolagenase. Kolagenase memiliki sifat proteolitik sehingga dapat memecah ikatan peptida dari kolagen (Kim et al. 2002). Menurut Chung et al (2004), kolagenase mampu memecah ikatan peptida pada kolagen, sehingga penggunaan kolagenase dalam proses hidrolisis kolagen dinilai lebih efektif dan efisien. Kolagenase memiliki berbagai manfaat diantaranya berperan dalam proses pelunakan daging (Hultman & Rustad 2003, diacu dalam Yuniarti 2010) dan penyembuhan luka (Riley & Herman 2005).
Kolagenase dapat dihasilkan dari jaringan mamalia (Park et al. 2002), usus ikan bandeng (Yuniarti 2010), dan bakteri yang berasal dari organ dalam ikan filefish (Kim et al. 2002). Pada jaringan mamalia, kolagenase dapat ditemukan di jaringan epitel, leukosit, dan sel tulang (Golub et al. 1976). Bakteri yang dapat menghasilkan kolagenase, antara lain, Clostridium histolyticum (Bond & Wart 1984), Serratia marcesens, Pseudomonas
aeruginosa, Bacillus cereus (Harrington
1996), dan B. licheniformis F-11.4 (Baehaki et al. 2012). Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4. Bacillus licheniformis F-11.1 dan F-11.4 merupakan strain dari B. licheniformis F-11 yang diisolasi dari limbah udang di Palembang (Weldeck et al. 2006). Kedua isolat tersebut telah mengalami perlakuan mutasi pada operon asam poliglutamat (PGA) dan kitinase-AB. Perlakuan mutasi tersebut menyebabkan kedua bakteri tidak memiliki aktivitas kitinase, tetapi memiliki aktivitas protease yang tinggi (Hoffmann et al. 2010).
Oktivianti (2012) melaporkan bahwa kedua isolat dapat menghasilkan kolagenase pada tiga media tumbuh, yaitu media LBC
(100%LB+5% kolagen), LBHC (50% LB+ 5% kolagen), dan CLG (5% kolagen). Produksi kolagenase kedua isolat optimum pada media LBC dengan aktivitas spesifik kolagenase sebesar 2.057 U/mg untuk F-11.1 dan 4.695 U/mg untuk F-11.4. Aktivitas kolagenase dalam penelitian tersebut belum dianalisis secara kualitatif sehingga perlu dilakukan analisis secara kualitatif terhadap aktivitas katalitik enzim tersebut.
Analisis enzim secara kualitatif dapat dilakukan dengan teknik zimogram. Zimogram merupakan teknik elektroforesis untuk mengetahui adanya aktivitas suatu enzim terhadap substrat yang ditambahkan kedalam gel akrilamid. Teknik ini memiliki keuntungan antara lain sederhana, sensitif, dan spesifik (Mubarik 2005).
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis enzim kolagenase dari Bacillus licheniformis F-11.1 & F-11.4 secara kualitatif menggunakan teknik zimogram.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2011 hingga Juli 2012 di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia PPSHB-IPB, Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, dan Laboratorium Terpadu Departemen Biologi, FMIPA IPB, Bogor.
Bahan
Bahan yang diteliti adalah isolat bakteri
B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4 koleksi
laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Studi Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Institut Pertanian Bogor.
Metode
Pembuatan Kolagen.
2
selama 24 jam. Setelah perendaman, kulit ikan lalu dibersihkan dengan air mengalir sampai tidak tercium bau asam. Setelah itu, kulit tersebut direndam dalam akuades dengan perbandingan (berat kulit (gr) / volume asam asetat (ml)) 2:1 dan diinkubasi pada suhu 50oC selama 3-4 jam. Kemudian, rendaman kulit tersebut disaring menggunakan kertas saring. Penyaringan ini dilakukan untuk memisahkan cairan kolagen dan sisa-sisa kulit yang tidak terpakai
Peremajaan Isolat.
Isolat B. licheniformis F-11.1 & F-11.4 diremajakan pada media tumbuh optimum
Luria Bertani (LB) Agar, kemudian
diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam diinkubator (Lampiran 2). Isolat yang telah diremajakan disimpan pada suhu 4o C dan digunakan sebagai isolat kerja.
Pembuatan Inokulum.
Media yang digunakan sebagai inokulum
adalah media tumbuh optimum B.
licheniformis, yaitu media LB cair (Ratu
2007) (Lampiran 2). Sebanyak 2 lup dari kedua isolat masing-masing ditumbuhkan pada media LB sebagai inokulum. Inokulum diinkubasi di shaker waterbath (Certomat WR) dengan kecepatan 110 rpm selama 24 jam pada suhu tumbuh optimum 50oC untuk B. licheniformis F-11.1 dan 40oC untuk B. licheniformis F-11.4. Inokulum dengan nilai
optical density (OD) 0.7-0.8 digunakan
sebagai isolat kerja pada media produksi.
Produksi Enzim Kolagenase.
Produksi enzim kolagenase dilakukan dengan mengekstraksi enzim dari tiga media tumbuh, yaitu LBC, LBHC, dan CLG. Sebanyak 10% inokulum yang memiliki nilai OD 0.8 dimasukkan ke masing-masing erlenmeyer beisi media produksi kolagenase (Lampiran 3). Selanjutnya ketiga erlenmeyer tersebut diinkubasi di shaker waterbath (Certomat WR) dengan kecepatan 110 rpm dan diinkubasi pada suhu tumbuh optimum masing-masing isolat. sebanyak 20 ml kultur dari erlenmeyer diambil setiap 10 jam selama 40 jam. Sebanyak 2 ml kultur yang telah diambil kemudian diamati laju pertumbuhannya dengan mengukur turbiditas selnya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm. Selanjutnya, sisa kultur yang telah diambil kemudian. Diekstraksi untuk mendapatkan enzim ekstrak kasar. Ekstraksi dilakukan dengan cara sentrifugasi kultur menggunakan alat Tomy
MRX-152 dengan kecepatan 4000 rpm selama 20 menit pada suhu 4oC. Supernatan yang dihasilkan merupakan enzim ekstra kasar (EEK). Enzim ekstrak kasar kemudian dianalisis aktivitasnya menggunakan teknik zimogram. Selain itu diukur pula kadar proteinnya menggunakan metode Bradford (Bradford 1976, diacu dalam Ratu 2007) (Lampiran 4). Sebanyak 50 µl enzim sebagai sampel direaksikan dengan 2.5 ml larutan Bradford dan dikocok kuat. Bovin Serum Albumin (BSA) digunakan sebagai larutan standar (Lampiran 5). Sebanyak 50 µl akuades sebagai blanko direaksikan dengan 2.5 ml larutan Bradford dan dikocok kuat. Masing-masing campuran tersebut diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Selanjutnya dilakukan pembacaan nilai absorbansinya di spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.
.
Pemekatan Enzim Ekstrak Kasar.
Pemekatan enzim ekstrak kasar dilakukan untuk mendapatkan enzim semi murni (ESM). Pemekatan ini dilakukan dengan cara mencampurkan enzim ekstrak kasar dengan 50% amonium sulfat (Bollag & Edelstein 1991) (Lampiran 6). Kemudian, campuran tersebut didiamkan selama semalam. Setelah itu, campuran tersebut disentrifugasi menggunakan Micro 200R Hettich Zentrifugen pada kecepatan 10000 rpm, suhu 4oC, selama 20 menit. Pelet yang dihasilkan merupakan enzim semi murni (ESM). Selanjutnya, pelet tersebut dilarutkan kedalam 50mM bufer fosfat pH 7 dengan perbandingan (b/v) 1: 2 (Lampiran 7).
Zimogram Aktivitas Kolagenase.
3
Gambar 1 Kurva pertumbuhan sel dan kadar protein enzim isolat F-11.1 media LBC.
Gambar 2 Kurva pertumbuhan sel dan kadar protein enzim isolat F-11.1 media LBHC.
Gambar 3 Kurva pertumbuhan sel dan kadar protein enzim isolat F-11.1 media CLG.
Kadar Prot ein EEK (mg/ ml) Kadar Prot ein ESM (mg/ml) OD 620 nm
Kadar Prot ein EEK (mg/ml) Kadar Prot ein ESM (mg/ ml)
Kadar Prot ein EEK (mg/ ml) Kadar Prot ein ESM (mg/ml) OD 620 nm
EEK : Enzim ekstrak kasar ESM : Enzim semi murni menggunakan BIO-RAD dengan kekuatan 70 volt dan 50 ampere. Elektroforesis dilakukan sampai sampel berada 2 cm dari tepi bawah gel.
Selanjutnya, gel direndam dalam 2.5% Triton X-100 dan diputar di atas shaker waterbath (Certomat WR) pada kecepatan 110 rpm selama 1 jam. Larutan tersebut dibuang kemudian diganti dengan 50mM bufer fosfat pH 9 dan gel tersebut diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam (Lampiran 13). Setelah diinkubasi, gel tersebut diwarnai dengan pewarna Coomassie Brilliant Blue dan diputar di atas shaker waterbath (Certomat WR) pada kecepatan 110 rpm (Lampiran 14). Pewarnaan tersebut dapat menghasilkan zona bening akibat dari aktivitas kolagenase terhadap kolagen.
HASIL
Pertumbuhan Sel dan Kadar Protein Enzim.
Pengamatan laju pertumbuhan sel bakteri dapat dilakukan dengan pengukuran turbiditas sel. Pengukuran turbiditas sel dilakukan dengan mengukur tingkat kekeruhan media selama waktu inkubasi. Tingkat kekeruhan media didapat dari nilai OD yang diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm. Isolat B. licheniformis F-11.1 tumbuh lebih baik pada media tumbuh LBC. Pada media tersebut, isolat F-11.1 tumbuh optimum pada jam ke-30 dengan nilai absorbansi sebesar 1.38. Kadar protein EEK dan ESM isolat tersebut optimum pada jam
ke-20 dan 40 dengan nilai masing-masing sebesar 0.1 mg/ml (Gambar 1). Sementara itu, pada media tumbuh LBHC, isolat tersebut tumbuh optimum pada jam ke-10 dengan nilai absorbansi sebesar 1.43. isolat F-11.1 yang tumbuh pada media tersebut memiliki kadar protein EEK dan ESM optimum pada jam ke-10 dan 40 dengan nilai masing-masing sebesar 0.2 mg/ml dan 0.1 mg/ml (Gambar 2). Pada media CLG, isolat F-11.1 tumbuh optimum pada jam ke-10 dengan nilai absorbansi sebesar 0.61. Kadar protein EEK dan ESM yang dimiliki isolat tersebut optimum pada jam ke-40 dengan nilai masing-masing sebesar 0.1 mg/ml (Gambar 3).
4
Gambar 5 Kurva pertumbuhan sel dan kadar protein enzim isolat F-11.4 media LBHC
Kadar Prot ein EEK (mg/ ml) Kadar Prot ein ESM (mg/ml) OD 620 nm
EEK : Enzim ekstrak kasar ESM : Enzim semi murni
Gambar 6 Kurva pertumbuhan sel dan kadar protein enzim isolat F-11.4 media CLG.
Kadar Protein EEK (mg/ ml) Kadar Protein ESM (mg/ml) OD 620 nm
EEK : Enzim ekstrak kasar ESM : Enzim semi murni
Gambar 4 Kurva pertumbuhan sel dan kadar protein enzim isolat F-11.4 media LBC
Kadar Protein EEK (mg/ ml) Kadar Protein ESM (mg/ml) OD 620 nm
EEK : Enzim ekstrak kasar ESM : Enzim semi murni
Zimogram Aktivitas Kolagenase.
Secara keseluruhan, zimogram kedua isolat dapat menghasilkan aktivitas kolagenolitik. Hal tersebut ditunjukan dengan terbentuknya pita bening pada gel akibat terdegradasinya kolagen pada gel oleh kolagenase. Hasil zimogram EEK kedua isolat yang ditumbuhkan pada media LBC menghasilkan pita bening yang lebih tebal dibandingkan isolat yang tumbuh di media LBHC dan CLG. Sementara itu, pada media LBHC pita bening yang dihasilkan tidak membentuk zona bening yang teratur (Gambar 7 dan 8). Zimogram enzim semi murni menghasilkan pita yang lebih tipis dibandingkan dengan pita hasil zimogram ekstrak kasar enzim. Enzim semi murni dari isolat F-11.1 yang ditumbuhkan pada media LBC menghasilkan pita bening pada jam 10, 20, 30, dan 40 (Gambar 9). Pada media LBHC dan CLG tidak terbentuk pita bening. Eenzim semi murni dari F-11.4 pada media LBC menghasilkan pita bening pada jam ke-30, sedangkan ESM isolat F-11.4 yang tumbuh pada media LBHC menghasilkan pita bening pada jam ke-10, 20, dan 30 (Gambar 10).
Jumlah protein tiap sampel per 10 jam didapat dari nisbah kadar protein sampel dengan volume sampel yang dimasukan
kedalam gel. Jumlah protein yang terdapat di dalam gel berbeda-beda tiap sampel. Enzim ekstrak kasar isolat B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4 memiliki jumlah protein optimum tertinggi yang berasal dari isolat yang tumbuh pada media LBHC. Isolat B. licheniformis F-11.1 memiliki jumlah protein optimum pada jam ke-10 sebesar 3.36 µg, sedangkan isolat B. licheniformis F-11.4 optimum pada jam ke-20 sebesar 5.57µg. Enzim semi murni isolat B. licheniformis F-11.1 memiliki jumlah protein optimum tertinggi berasal dari ESM isolat yang ditumbuhkan di media CLG pada jam ke-40 sebesar 1.89 µg. Sementara itu, isolat B. licheniformis F-11.4 memiliki jumlah protein optimum tertinggi berasal dari ESM isolat yang ditumbuhkan di media LBC pada jam ke-30, sebesar 2.42 µg.
5
Gambar 7 Hasil zimogram, jumlah fraksi dan jumlah protein dari EEK isolat B. licheniformis F-11.1 yang tumbuh pada media LBC, LBHC, dan CLG
Jam ke- 10 20 30 40 Jam ke- 10 20 30 40 Jam ke- 10 20 30 40
Media : LBC
Σ Fraksi : 6, 9, 9, 8
Σ Protein (µg) : 1.8, 2.3, 1.5, 1.7
Media : LBHC
Σ Fraksi : -
Σ Protein (µg) : 3.4, 3, 2.4, 1.5
Media : CLG
Σ Fraksi : 8, 8, 5, 6
Σ Protein (µg) : 1.8, 1.8, 1.9, 2
Gambar 8 Hasil zimogram, jumlah fraksi, dan jumlah protein EEK dari isolat B. licheniformis F-11.4 yang tumbuh pada media LBC, LBHC, dan CLG
Jam ke- 10 20 30 40
Media : LBC
Σ Fraksi : 8, 5, 8, 6
Σ Protein (µg) : 1.5, 1.5, 2.7, 2.3
Media : LBHC
Σ Fraksi : 7, 9, 11, 10
Σ Protein (µg) : 1.2, 5.6, 2.3, 3
Jam ke- 10 20 30 40 Jam ke- 10 20 30 40
Media : CLG
Σ Fraksi : 6, 7, 6, 5
Σ Protein (µg) : 1.2, 1.9, 2., 2
Jam ke- 10 20 30 40
Media : LBC
Σ Fraksi : 1, 5, 1, 2
Σ Protein (µg) : 0.39, 1.07, 1.33, 1.63
Gambar 9 Hasil zimogram, jumlah fraksi, dan jumlah protein ESM dari isolat B. licheniformis F-11.1 yang tumbuh pada media LBC.
Media : LBHC
Σ Fraksi : -
Σ Protein (µg) : 0.5, 1.2, 1.6, 1.9
Jam ke- 10 20 30 40 Jam ke- 10 20 30 40
Media : CLG
Σ Fraksi : -
6
Gambar 10 Hasil zimogram, jumlah fraksi, dan jumlah protein ESM dari isolat B. licheniformis F-11.4 yang tumbuh pada media LBC dan LBHC.
Jam ke- 10 20 30 40
Media : CLG
Σ Fraksi : -
Σ Protein (µg) : 1.1, 1.7, 1.9, 2
PEMBAHASAN
Bacillus licheniformis F-11.1 dan F-11.4 yang ditumbuhkan pada tiga media berbeda menunjukkan hasil pertumbuhan sel yang berbeda. Kedua isolat tumbuh lebih baik pada media yang mengandung komposisi 100% LB dan 5% kolagen, yaitu media LBC. Hal tersebut ditunjukkan dengan nilai OD yang lebih tinggi dibandingkan dengan nilai OD dari media LBHC dan CLG. Selain itu, isolat yang ditumbuhkan pada media LBC mengalami fase kematian setelah jam ke-30. Sementara itu, isolat yang ditumbuhkan pada media LBHC dan CLG sudah mengalami fase kematian pada jam ke-10. Hal tersebut disebabkan oleh ketersediaan nutrisi yang lengkap pada media tumbuh isolat. Sel bakteri yang tumbuh subur pada suatu media menunjukkan bahwa media tersebut cocok untuk pertumbuhannya. Media yang cocok bagi pertumbuhan bakteri dapat membantu bakteri dalam menghasilkan enzim ekstraseluler selama masa pertumbuhannya. Selain itu, faktor agitasi, suhu dan pH juga mempengaruhi pertumbuhan bakteri. Pergeseran suhu dan nilai pH akan menyebabkan terhambatnya pertumbuhan bakteri (Suhartono 1992).
Media LBC memiliki komposisi LB 100% dan 5% kolagen, media LBHC memiliki komposisi LB 50% dan 5% kolagen, sedangkan media CLG hanya mengandung
5% kolagen. Media LB mengandung NaCl,
Tryptone, dan ekstrak khamir. Ekstrak khamir memiliki asam amino & peptida, vitamin yang larut dalam air, dan karbohidrat. Kolagen merupakan sumber nitrogen yang berperan sebagai induser. Sumber karbon yang paling
tinggi didapat pada media LBC. Ketersediaan karbon tersebut menyebabkan isolat dapat hidup lebih lama. Sementara itu, pada media CLG hanya tersedia sumber nitrogen dari protein kolagen. Hal tersebut menyebabkan isolat pada media tersebut tidak dapat tumbuh dengan baik.
Kadar protein yang dihasilkan kedua isolat dari tiga media tumbuh memiliki konsentrasi yang berbeda-beda. Pada media LBC, kadar protein enzim ektrak kasar kedua isolat terus mengalami peningkatan sampai menjelang fase kematian. Sementara itu, kadar protein dari isolat yang ditumbuhkan pada media LBHC cenderung menurun setelah fase eksponensial. Pada media CLG, kedua isolat menghasilkan kadar protein dari enzim ekstrak kasar yang paling sedikit dibandingkan dengan media LBC dan LBHC. Kadar protein dari ekstrak kasar enzimnya cenderung stabil. Peningkatan kadar protein enzim dapat disebabkan oleh aktivitas bakteri selama masa pertumbuhan. Sintesis enzim ekstraseluler bakteri terjadi pada akhir fase eksponensial. Namun, enzim yang dihasilkan lebih sedikit selama fase tersebut dan terakumulasi dalam jumlah besar saat fase stasioner (Suhartono 1992).
7
terjadi proses salting out. Penambahan garam menyebabkan air yang mengelilingi protein terlepas dan terikat oleh garam, sedangkan molekul-molekul protein akan saling berikatan membentuk gumpalan. Protein dan supernatan dipisahkan dengan sentrifugasi. Endapan yang dihasilkan merupakan protein yang bebas dari zat nonprotein (Suhartono 1989).
Kadar protein dari enzim semi murni memiliki konsentrasi yang lebih rendah dari enzim ekstrak kasar. Hal tersebut disebabkan oleh terpisahnya protein dengan zat nonprotein (Suhartono 1989). Namun, konsentrasi enzim semi murni terus meningkat selama masa pertumbuhan dan optimum pada akhir fase stasioner sampai fase kematian. Zimogram merupakan suatu teknik elektroforesis menggunakan gel akrilamid, sodium dodecyl sulphate (SDS), dan substrat.
Sodium dodecyl sulphate (SDS) berfungsi
untuk mendenaturasi protein sehingga protein dapat terpisah dan bergerak pada gel akrilamid sesuai dengan berat dan ukuran molekulnya. Protein yang sudah bergerak akibat proses elektroforesis, kemudian direnaturasi kembali oleh Triton X-100. Renaturasi protein dilakukan agar protein dapat menghidrolisis substrat pada gel dengan menginkubasi gel ke dalam bufer pada pH yang sesuai dengan aktivitas enzim. Daya katalitik protein divisualisasikan dengan merendam gel ke dalam pewarna Coomasie briliant blue hingga terbentuk fraksi atau pita bening (Baehaki et al. 2012).
Hasil zimogram kedua isolat dari ketiga media tumbuh menunjukkan adanya aktivitas kolagenase. Hal tersebut ditunjukkan dengan terbentuknya pita bening pada gel akrilamid yang sudah ditambahkan kolagen. Zimogram enzim ekstrak kasar kedua isolat dari media LBC menujukkan hasil paling baik. Hal tersebut disebabkan oleh fraksi yang terbentuk terlihat lebih pekat. Sementara itu, zimogram enzim ekstrak kasar dari media CLG menunjukkan hasil yang kurang baik. Fraksi yang terbentuk pada gel tersebut terlihat sangat tipis. Zimogram enzim semi murni kedua isolat paling baik dihasilkan dari media LBC. Sementara itu, zimogram enzim semi murni kedua isolat dari media CLG tidak memunculkan fraksi. Kepekatan fraksi yang dihasilkan diduga akibat dari aktivitas enzim yang dihasilkan kedua isolat. Aktivitas kolagenase pada media CLG merupakan aktivitas terendah dibandingkan aktivitas kolagenase pada media LBC dan LBHC (Oktivianti 2012). Ketidakmunculan pita pada
gel dapat disebabkan oleh rendahnya aktivitas enzim atau hilangnya aktivitas enzim selama proses pemekatan. Hilangnya aktivitas enzim dapat disebabkan oleh perubahan suhu dan pergeseran nilai pH.
Selain untuk menganalisis aktivitas enzim, zimogram juga digunakan untuk menghitung berat molekul suatu enzim. Perhitungan berat molekul dilakukan dengan menghitung jarak migrasi (rf) molekul sampel dan protein standar pada gel. Nagano dan To (1999) melaporkan bahwa zimogram dari
Bacillus subtilis FS-2 menunjukan adanya
aktivitas enzim kolagenase dengan berat molekul sebesar 125 kDa. Selain itu, aktivitas kolagenase juga ditunjukkan oleh hasil zimogram dari Sterptomyces sp strain3B yang memiliki berat molekul sebesar 116 kDa & 97 kDa (Petrova et al. 2006).
SIMPULAN
Aktivitas kolagenase dari Bacillus licheniformis F-11.1 & F-11.4 dapat dianalisis menggunakan teknik zimogram. Hal tersebut ditunjukkan dengan terbentuknya pita bening (fraksi) pada gel elektroforesis. Fraksi zimogram paling pekat dihasilkan dari enzim ekstrak kasar isolat yang ditumbuhkan pada media 100% LB + 5% kolagen (LBC). Isolat B. licheniformis F-11.1 menghasilkan fraksi terbanyak dari enzim ekstrak kasar yang berasal dari media tumbuh LBC sebanyak 32 fraksi. Sementara itu, isolat B. licheniformis F-11.4 menghasilkan fraksi terbanyak dari enzim ekstrak kasar yang berasal dari media tumbuh yang berisi 50% LB + 5% kolagen (LBHC), yaitu sebanyak 37 fraksi.
SARAN
Perlu dilakukan penentuan kondisi optimum pertumbuhan dan kadar protein kolagenase pada ketiga media, berbagai pH dan suhu. Selain itu, perlu dilakukan pemurnian enzim dan dihitung berat molekul protein enzim kolagenase dari kedua bakteri tersebut pada tiga media tumbuh.
DAFTAR PUSTAKA
Baehaki et al. 2012. Purification and characterization of collagenase from B. licheniformis F11.4. Afr J Micribiol Res 6: 2373-2379.
Bollag DM, Edelstein SJ. 1991. Protein Methods. New York: Wiley-Liss
Bond MD, Wart HE. 1984. Purification and separation of individual collagenase of
8
ligand chromatography. Biochem 23: 3077-3085.
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram uantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochen 72: 248-254.
Chung L, Dinakarpandian D, Yoshida N, Laurel-Frields GB, Visse R, Nagase H. 2004. Collagenase unwinds triple helical collagen proir to peptida bond hydrolisis. EMBO Journal 23 : 3020-3030.
Harrington DJ. 1996. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infect Immun 64: 1885-1891.
Hoffmann K, Daum G, Koster M, Kulicke WM, Rammes HM, Bisping B, Meinhardt F. 2010. Genetic Improvment of Bacillus
licheniformis Strains for Efficient
Deproteinization of Shrimp Shells and Production of High-Molecular-Mass
Chitin and Chitosan. Applied And
Enviromental Microbiology 76 :
8211-8221.
Hultmann L, Rustad T. 2004. Iced storage of Atlantic salmon (Salmo salar)-effect on endogenous enzymes and their impact on muscle protein and texture. J Food Chem. 87: 31-41.
Golub LM, Siegel K, Ramamurthy NS, Mandel ID. 1976. Some characteistics of collagenase activity in gingival crevicular fluid and its relationship to gingival disease in human. J Dental Research 55: 1049-1057.
Kim SK, Park PJ, Kim JB, Shahidi F. 2002. Purification and characterization of collagenase from the tissue of filefish, Novoden modestrus. J Biochem Mol Biol 35: 165-171.
Lestari SD. 2005. Analisis sifat fisika, kimiawi dan rheologi gelatin kulit hiu gepeng (Alloipis sp.) dengan penambahan MgSO4, sukrosa dan gliserol. [skripsi].
Bogor: Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Mubarik NR. 2005. Analisis Zimogram α
-Amilase Mikrob Toleran Basa. J
Mikrobiologi Indonesia 10: 48-50.
Nagano H, To KA. 1999. Purification of collagenase and specificity of its related enzyme from Bacillus subtilis FS-2. Biosci Biotechnol Biochem 63: 181-183.
Octivianti CT. 2012. Produksi dan Uji Aktivitas Kolagenase dari Bacillus licheniformis F-11.1 dan F-11.4 [skripsi]. Bogor : Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Petrova D, Derekova A, Vlahov S. 2006. Purification and properties of individual collagenases from Streptomyces sp Strain 3B. Folia Microbiol. 51:93-98.
Rao MB, Tanksale AM, Ghatge MS, Deshpande VV. 1998. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol Mol Biol Rev 62: 597-635.
Ratu AP. 2007. Media Optimum Untuk Produksi Protease Dari Bacillus licheniformis F 11 [skripsi]. Bogor : Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Riley KN, Herman IM. 2005. Collagenase promotes the cellular responses to injury and wound healing in vivo. J Burns Wound 4: 112-124.
Suhartono MT. 1989. Enzim dan
Bioteknologi. Bogor: Dirjen DIKTI, Pusat Antar Universitas (PAU) Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor.
Suhartono MT. 1992. Protease. Bogor:
Depdikbud, DIKTI, Pusat Antar Universitas Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor.
Trismilah, Sumaryanto. 2005. Pengaruh kadar nitrogen dalam media pada pembuatan
protease menggunakan Bacillus
megaterium DSM 319. J Ilmu Ilmu Farm Indones 3: 9-12.
Waldeck J, Daum G, Bisping B, Meinhardt F. 2006. Isolation and molecular characterization of chitinase-deficient Bacillus licheniformis strains capable of deproteinization of Shrimp Shell waste to obtain highly viscous chitin. Applied And Enviromental Microbiology 72 : 7879-7883.
Yuniarti T. 2010. Purifikasi Dan Karakterisasi Kolagenase Dari Organ Dalam Ikan Bandeng (Chalos chalos Forskall) Selama Periode Kemunduran Mutu Ikan [tesis]. Bogor : Megister Sains Program Studi Teknologi Hasil Perairan, Institut Pertanian Bogor.
9
10
Lampiran 1
Diagram Metode Pembuatan Kolagen
Lampiran 2
Komposisi Media Luria Bertani (LB) Agar dan media LB Cair (inokulum)
No Bahan LB Agar (100 ml) LB Cair (50 ml)
1 NaCl 1 gr 0.5 gr
2 Tryptone 1 gr 0.5 gr
3 Ekstak Khamir 0.5 gr 0.25 gr
4 Agar 0.15 gr -
5 Akuades 100 ml 50 ml
Lampiran 3
Kompsisi Media Produksi LBC, LBHC, dan CLG
No Bahan LBC (50 ml) LBHC (50 ml) CLG (50
ml)
1 NaCl 0.475 gr 0.237 gr -
2 Tryptone 0.475 gr 0.237 gr -
3 Ekstak Khamir 0.237 gr 0.118 gr -
4 Akuades 47.5 ml 47.5 ml 47.5 ml
5 Kolagen 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml
Lampiran 4
Komposisi Larutan Bradford 100 ml
No Bahan Jumlah
1 Brilian blue G 0.01 gr
2 Etanol 95% 5 ml
3 H2PO4 5 ml
4 Akuades 90 ml
Komposisi Blanko, Standar, dan Sampel pada metode Bradford
Bahan Blanko (ml) Standar (ml) Sampel (ml)
Akuades 0.05 0 0
Dipotong-potong Direndam dalam 1.5% Asam
Asetat (berat kulit (gr) / volume asam astat (ml)) 1:2, 24 jam, suhu ruang Dicuci dengan air
Direndam dalam akuades (berat kulit (gr) / volume asam astat (ml)) 2:1, 3-4 jam, 50oC
Kulit disaring menggunakan kertas saring
Kolagen yang larut dalam akuades akan tidak tersaring. Kolagen tersebut digunakan untuk substrat
Kulit Ikan Bandeng Dibersihkan dari daging, lemak,
dan kotoran.
11
Enzim 0 0 0.05
BSA (1 mg/ml) 0 0.05 0
Bradford 2.5 2.5 2.5
Lampiran 5
Komposisi Larutan BSA, Konsentrasi, dan Kurva Standar BSA a. Komposisi Bovin Serum Albumin (BSA) 10 ml
No Bahan Jumlah
1 Bovin Serum Albumin 10 mg
2 Akuades 10 ml
b. Konsentrasi dan Kurva Larutan Standar Bovin Serum Albumin (BSA) Konsentrasi BSA
(mg/ml) Volume BSA (µl) Volume Bradford (µl)
0 0 50
0.05 2.5 47.5
0.1 5 45
Kurva Standar Bovin Serum Albumin (BSA)
y = 0.96x + 0.2927 R2 = 0.9724
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45
0 0.05 0.1 0.15
Blanko
Standar BSA
12
Lampiran 6
13
Persiapan Alat dan Bahan
Pembuatan Gel Pemisah
Pembuatan Gel Penahan
Persiapan Sampel
1.Alat yang digunakan adalah BIO-RAD.Bahan yang digunakan adalah akrilamid, bis-akrilamid, TEMED, dan APS.
2.Pemasangan alat elektroforesis SDS-PAGE ( BIO-RAD).
3.Pengecekan kebocoran pada plat elektroforesis dengan memasukkan akuades kedalam plat tersebut.
1.Pembuatan larutan gel pemisah
2.Injeksi larutan gel pemisah ke plat elektroforesis 3.Pengerasan gel 15-20 menit
1.Pembuatan larutan gel pemisah
2.Injeksi larutan gel pemisah ke plat elektroforesis 3.Pemasangan sisir
4.Pengerasan gel 15-30 menit
1.Pencampuran 10µl bufer sampel dengan 40 µl enzim (sampel)
2.Injeksi sampel ke dalam masing-masing sisir.
Running Running gel dengan BIO RAD pada kekuatan 70 volt/50
Ampere.
Lampiran 7
Komposisi dan cara membuat Larutan 50 mM Bufer Fosfat pH 7 250 ml
Sebanyak 1.724 gr NaH2PO4 dilarutkan kedalam 250 ml akuades. Larutan tersebut akan
menjadi larutan A. Selanjutnya, sebanyak 2.22 gr Na2HPO4 dilarutkan kedalam 250 ml akuades.
Larutan tersebut akan menjadi larutan B.Kemudian, nilai pH pada larutan B diukur menggunakan pH meter. Setelah itu teteskan larutan A ke larutan B sampai pH larutan B menjadi 7.
Lampiran 8
Metode Zimogram
14
Lampiran 9
Komposisi Gel Penahan dan Gel Pemisah
Nama Bahan Gel Pemisah 12% Gel Penahan 4%
Akrilamid (larutan A) 4.2 ml 0.65 ml
Bufer Gel Pemisah (larutan B)
2.5 ml -
Bufer Gel Penahan (larutan C)
- 1.25 ml
Kolagen 1 ml -
Akuades 2.1 ml 3 ml
1% APS 0.1 ml 0.05 ml
TEMED 0.01 ml 0.005 ml
Lampiran 10
Komposisi Larutan Akrilamid, bufer gel pemisah, dan bufer gel penahan
Nama Bahan Akrilamid 100 ml (Larutan A)
Bufer Gel Pemisah 100 ml (Larutan B)
Bufer Gel Penahan 100 ml (Larutan C) 30% (b/v)
Akrilamid 30 gr - -
0.8% (b/v)
Bis-Akrilamid 0.8 gr - -
1.5 M Tris-HCl
pH 8.8 - 75 ml -
1.5 M Tris-HCl
pH 6.8 - - 50 ml
10% SDS - 4 ml 4 ml
Akuades Steril 100 ml 21 ml 46 ml
Lampiran 11
Komposisi Larutan Bufer Sampel 9.5 ml
No Bahan Jumlah
1 60 mM Tris-HCl pH6.8 0.6 ml
2 50% Gliserol 5 ml
3 10% SDS 2 ml
4 1% Bromophenol Blue 1 ml
5 Akuades steril 0.9 ml
Lampiran 12
Komposisi Bufer Elektroforesis pH 8.3 500 ml
No Bahan Jumlah
1 Tris 1.51 gr
2 Glysin 7.20 gr
3 SDS 0.2 gr
Inkubasi gel menggunakan 50mM bufer fosfat pH 9 di inkubator 37oC selama 24 jam
15
Lampiran 13
Komposisi dan cara membuat Larutan 50 mM Bufer Fosfat pH 9 250 ml
Sebanyak 1.724 gr NaH2PO4 dilarutkan kedalam 250 ml akuades. Larutan tersebut akan
menjadi larutan A. Selanjutnya, sebanyak 2.22 gr Na2HPO4 dilarutkan kedalam 250 ml akuades.
Larutan tersebut akan menjadi larutan B. Kemudian, nilai pH pada larutan B diukur menggunakan pH meter. Setelah itu larutan A diteteskan ke larutan B sampai pH larutan B menjadi 9.
Lampiran 14
Komposisi Larutan Pewarna Gel (Staining) dan Peluntur (Destaining)
No Bahan Pewarna Gel
200 ml
Peluntur 200 ml
1 Coomassie Briliant Blue 0.2 gr -
2 Metanol 90 ml 20 ml
3 Akuades Steril 90 ml 160 ml
