SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS REFLEKTANS DAN
KEMOMETRIKA SEBAGAI TEKNIK KLASIFIKASI
SPESIMEN JARINGAN KANKER SERVIKS DAN NORMAL
PALUPI DWI ANTARI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Spektrofotometri UV-Vis Reflektans dan Kemometrika sebagai Teknik Klasifikasi Spesimen Jaringan Kanker Serviks dan Normal adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
ABSTRAK
PALUPI DWI ANTARI. Spektrofotometri UV-Vis Reflektans dan Kemometrika sebagai Teknik Klasifikasi Spesimen Jaringan Kanker Serviks dan Normal. Dibimbing oleh RUDI HERYANTO dan ARYO TEDJO.
Ciri suatu bahan dapat ditunjukkan dengan spektrum reflektansinya. Penelitian ini bertujuan mengembangkan spektrofotometri berbasis reflektans dengan menggunakan komponen alat yang tersedia secara umum. Pemanfaatannya yang dikombinasikan dengan teknik kemometrika digunakan dalam pengklasifikasian spesimen jaringan kanker serviks dan normal. Spektrofotometer dibuat dengan lampu light emitting diode sebagai sumber sinar, lapisan optik digital versatile disk sebagai kisi, web camera berbasis sensor charge-couple device sebagai detektor, dan akuisisi data dengan spectral workbench. Berikutnya, spektrofotometer digunakan untuk mengukur biopsi dari jaringan kanker serviks dan normal. Pengukuran menghasilkan pola serapan yang beragam untuk semua sampel. Data spektrum reflektans yang diberi perlakuan pendahuluan berupa koreksi garis dasar dievaluasi lebih lanjut menggunakan analisis komponen utama sehingga menghasilkan pola distribusi kelompok sampel yang baik. Model PLSDA menunjukkan metode ini belum dapat digunakan untuk memprediksi keempat kelas stadium, tetapi dapat membedakan antara jaringan kanker dan jaringan normal.
Kata kunci: analisis komponen utama, kanker serviks, spektrofotometer UV-Vis reflektans
ABSTRACT
PALUPI DWI ANTARI. Reflectance UV-Vis Spectrophotometry and Chemometrics Techniques to Classify Cancer and Normal Tissue Specimens. Supervised by RUDI HERYANTO and ARYO TEDJO.
Characteristics of a material can be indicated by reflectance spectra. The objective of the research is to develop reflectance spectrophotometry by using generally available equipment components. The use of this technique is combined with chemometrics to classify cancer and normal tissue specimens. The spectrophotometer was consisted of light emitting diode as light source, optical layer digital versatile disk as grater, web camera with charge-couple device sensor as detector, with spectral workbench for data acquisition. Then, the spectrophotometer was used to measure biopsy of normal and cancerous tissues. The measurements produced various spectral pattern for all samples. The spectral data were corrected for the baseline and then the principal component analysis was evaluated, giving good distribution pattern of the sample group. PLSDA modeling showed that this method cannot be used to predict the four grades of cancer but can be used to distinguish between cancerous and normal tissues. Keywords: cervical cancer, principal component analysis, reflectance UV-Vis
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada
Departemen Kimia
SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS REFLEKTANS DAN
KEMOMETRIKA SEBAGAI TEKNIK KLASIFIKASI
SPESIMEN JARINGAN KANKER SERVIKS DAN NORMAL
PALUPI DWI ANTARI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala limpahan rahmat, hidayah dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan judul “Spektrofotometri UV-Vis Reflektans dan Kemometrika sebagai Teknik Klasifikasi Spesimen Jaringan Kanker Serviks dan Normal”. Karya ilmiah ini disusun untuk memenuhi persyaratan sidang komprehensif pendidikan sarjana di Institut Pertanian Bogor, berdasarkan hasil penelitian yang dilaksanakan dari bulan Maret 2015 sampai Oktober 2015 di Laboratorium Analitik, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Rudi Heryanto SSi, MSi, selaku pembimbing pertama dan Bapak Aryo Tedjo SSi, MSi, selaku pembimbing kedua yang telah memberi bimbingan dan dukungan selama proses penelitian dan penyususan karya ilmiah. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada ayah dan mamah serta keluarga atas doa, kasih sayang, serta dukungan serta semua pengorbanan yang tidak terhingga kepada penulis sampai saat ini dan seterusnya. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada semua dosen Departemen Kimia, staf Laboratorium Kimia Analitik, serta teman-teman seperjuangan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi ilmu pengetahuan.
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL viii
DAFTAR GAMBAR viii
DAFTAR LAMPIRAN viii
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Tempat dan Waktu Penelitian 2
METODE 2
Alat dan Bahan 2
Tahap Penelitian 2
HASIL DAN PEMBAHASAN 5
Spektrofotometer Berbasis Reflektans 5
Spektrum Reflektans Sampel biopsi 8
Distribusi Kelompok Data dengan Analisis Komponen Utama (AKU) 11 Model klasifikasi dengan Analisis Diferensial Kuadrat Terkecil Parsial
(PLSDA) 13
SIMPULAN DAN SARAN 14
Simpulan 14
Saran 14
DAFTAR PUSTAKA 14
LAMPIRAN 16
DAFTAR TABEL
1 Deskripsi sampel 4
2 Rancangan model PLSDA 5
3 Analisis model PLSDA 13
DAFTAR GAMBAR
1 Skema pembuatan spektrofotometer 3
2 Spektrofotometer reflektans (a) tampak dari atas dan (b) tampak dari
samping 8
3 Spektrum barium sulfat dengan CFL setelah kalibrasi 8 4 Sampel hasil biopsi jaringan berupa blok parafin 9
5 Spektrum barium sulfat dengan lampu LED 9
6 Spektrum sampel 10
7 Spektrum reflektans sampel terhadap panjang gelombang 11 8 Plot skor analisis komponen utama jaringan kanker dan normal 12 9 Plot skor analisis komponen utama CIN 1 dan normal 12
DAFTAR LAMPIRAN
1 Digram alir penelitian 16
2 Spektrum lampu LED pengukuran spektrofotometer reflektans 17
3 Kalibrasi spektrofotometer 17
4 Langkah-langkah kalibrasi sampel dan menyimpan data 18
5 Data dan hasil perhitungan reflektan 19
6 Model PLSDA 4 kelompok 20
7 Model PLSDA 3 kelompok 20
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Spektrofotometer UV-Vis adalah salah satu instrumen yang umum digunakan terutama berbasis serapan, yaitu dengan mengukur nilai serapan cahaya dengan panjang gelombang tertentu oleh suatu atom atau molekul. Spektroskopi UV-Vis merupakan spektroskopi berdasarkan radiasi elektromagnetik pada panjang gelombang 160 sampai 780 nm (Skoog et al. 2004). Untuk keperluan analisis, spektrofotometer absorpsi ini terbatas pada sampel homogen atau larutan. Oleh karena itu, sehubungan dengan semakin relevannya penentuan kandungan senyawa dalam sampel heterogen maka perlu diperluas cakupan sampel untuk padatan dengan memanfaatkan sifat reflektans. Reflektans merupakan cahaya yang dipantulkan oleh suatu objek pada panjang gelombang tertentu. Setiap objek yang berbeda akan memantulkan panjang gelombang yang berbeda. Lain halnya dengan sistem absorpsi, pengujian menggunakan instrumen berbasis reflektans dipilih karena preparasi sampel yang sederhana, waktu lebih cepat, tidak melibatkan senyawa-senyawa yang berbahaya dan dapat diterapkan untuk jumlah sampel yang besar.
Beberapa penelitian telah menggunakan sifat reflektans dalam analisis sampel hayati. Hidayah (2009) menggunakan spektrofotometer reflektans UV-Vis untuk mempelajari sifat optik buah jambu biji, yaitu melalui pergeseran spektrum intensitas reflektansi akibat absorpsi cahaya, hasil penelitian menunjukkan bahwa penyerapan pada panjang gelombang 740 nm dapat mengetahui mutu jambu biji selama penyimpanan. Sifat reflektans ini juga dapat digunakan untuk membedakan antara jaringan kanker dan normal. Marchesini et al. (1992) melaporkan bahwa lesi pigmen kulit melanoma dan nevi mempunyai spektrum reflektansi yang berbeda nyata, analisis fungsi diskriminan bertahap digunakan sebagai evaluasi klasifikasi antara kedua kelompok lesi tersebut. Selain itu, Marchesini et al. (1995) dalam penelitiannya melaporkan juga penggunaan telespektrofotometer dengan penggunaan charge-couple device (CCD) kamera dilengkapi dengan filter telah dikembangkan untuk memperoleh gambar dari lesi pigmen kulit pada panjang gelombang 420-1040 nm. Berdasarkan evaluasi terhadap warna permukaan, lesi dapat terbedakan antara melanoma dan nevi.
2
Spektrofotometer yang dibuat diaplikasikan untuk mengukur sampel hasil biopsi kanker serviks (cervical interepithelial neoplasias, CIN) yang telah diidentifikasi statusnya oleh ahli patologi. Sofian (2015) telah mengklasifikasikan CIN 1, CIN 2, CIN 3, dan normal menggunakan LED fotometer dan metode kemometrika, dan melaporkan bahwa penggunaan fotometer jinjing dengan lampu LED dan analisis diskriminan dapat mengelompokkan tiga stadium sel kanker dan membedakannya dengan sel normal. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan pengukuran sampel jaringan kanker dan normal dengan spektrofotometer reflektans sehingga menghasilkan data spektrum yang dimanfaatkan sebagai basis klasifikasi. Proses klasifikasi dilakukan dengan evaluasi menggunakan kombinasi metode pengenalan pola yaitu analisis komponen utama (PCA) dan analisis diferensial kuadrat terkecil parsial (PLSDA).
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Maret 2015 sampai Oktober 2015 di Laboratorium Kimia Analitik Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan antara lain karton, kayu, lampu LED (senter 1300 lumen), kepingan DVD, web camera sensor CCD, lampu compact fluorescent light (CFL), kaca preparat, dan perangkat lunak Spectral Workbench. Bahan-bahan yang digunakan antara lain sampel biopsi kanker serviks dan normal, barium sulfat, dan akuades.
Tahap Penelitian
3
Pembuatan dan Kalibrasi Spektrofotometer Reflektans
Pembuatan Spektrofotometer Reflektans (Public Laboratory 2013)
Spektrofotometer reflektan dibuat dengan merancang alat dengan komponen-komponen yang telah tersedia. Sebuah kotak yang dilengkapi dengan tutupnya dibuat dari kayu dan karton berukuran 31×31×9 cm3 lalu dicat menggunakan pilox hitam doff. Sumber sinar LED yang digunakan, yaitu berupa senter Police Swatt 1300 lumen (a). Sinar yang ditembakkan akan melalui celah yang berada di depan senter, celah dibuat dengan lebar 0,2 cm (b). Setelah itu, pada tempat sampel (c) diletakkan sebuah kaca preparat (d) yang bertujuan untuk meningkatkan intensitas cahaya reflektansi saat pengukuran. Sebagai detektor disiapkan web kamera (e) yang telah dilengkapi pendispersi cahaya (kisi), yaitu lapisan optik pada keping DVD dengan ukuran 2×2 cm2 (g), kisi tersebut kemudian ditempelkan tepat di depan lensa pada web kamera (f). Semua komponen spektrofotometer disusun di dalam kotak hitam (Gambar 1), lalu kabel USB pada kamera (h) dihubungkan dengan PC yang telah tersambung dengan spectral workbench (i). Pengukuran diawali dengan menyalakan sumber sinar dengan menekan tombol ON pada senter. Spektrofotometer telah siap dipakai.
Gambar 1 Skema pembuatan spektrofotometer Kalibrasi Spektrofotometer (Public Laboratory 2013)
4
Pengukuran dan Penentuan Reflektan Jaringan Biopsi
Deskripsi sampel
Sebanyak 79 sampel biopsi yang telah diidentifikasi statusnya oleh ahli patologi disiapkan lalu diukur reflektansinya menggunakan spektrofotometer reflektan yang telah dibuat (Tabel 1).
Tabel 1 Deskripsi sampel
Jenis sampel Kode Jumlah
Neoplasia intraepitel serviks stadium 1 CIN 1 26 Neoplasia intraepitel serviks stadium 2 CIN 2 23 Neoplasia intraepitel serviks stadium 3 CIN 3 18
Normal N 12
Pengukuran
Reflektans diukur menggunakan sumber sinar LED. Spektrofotometer reflektans dihubungkan dengan perangkat lunak Spectral Workbench lalu dilakukan pengukuran blangko terlebih dahulu dengan mengukur Barium sulfat. Barium sulfat diletakkan pada tempat sampel lalu ditembak dengan radiasi cahaya yang berasal dari lampu LED hingga diperoleh spektrum dengan intensitas sebesar 75%. Semua pengaturan dipertahankan secara konstan untuk pengukuran sampel. Selanjutnya semua sampel diukur.
Akuisisi data
Sinar polikromatik yang berasal dari sumber cahaya dikirim menuju sampel biopsi. Detektor akan menangkap intensitas pada kisaran panjang gelombang tertentu. Data yang diperoleh yaitu data spektrum garis yang diubah menjadi data intensitas RGB (red green blue) terhadap panjang gelombang dalam format .xls. Nilai rata-rata intensitas RGB dikonversi menjadi nilai reflektan menggunakan persamaan (1) dan (2) sehingga diperoleh nilai reflektansi dari sampel. Selanjutnya pengenalan pola data spektrum menggunakan piranti lunak The Unscrambler X 10.3. Isampel = Persen intensitas sampel
Eksplorasi Data dengan Analisis Komponen Utama (AKU)
5
dilakukan sebagai perlakuan pendahuluan untuk memilih pemrosesan sinyal yang dapat memberikan pola distribusi yang baik antar masing-masing kelompok sampel.
Model Klasifikasi dengan Analisis Diferensial Kuadrat Terkecil Parsial (PLSDA)
Model klasifikasi dibuat menggunakan PLSDA dengan piranti lunak The Unscrambler X 10.3. Tabel 2 menunjukkan tabulasi data dari nilai reflektans yang akan digunakan sebagai dasar dalam pembuatan model klasifikasi. Terdapat hubungan antara panjang gelombang setiap intensitas spektrum reflektan dan model PLSDA (CIN 1, CIN 2, CIN 3 dan normal). Pemodelan dilakukan terhadap 2 matriks, yaitu data reflektansi hasil analisis spektrofotometer sebagai matriks X dan untuk data rujukan (matriks Y) digunakan variabel Dummy. Sebagai contoh, respons 1 untuk kelompok sampel jaringan kanker dan 0 untuk sampel jaringan normal. Kebaikan model prediksi diukur dengan nilai R2 mendekati 1 dan RMSE (root mean square error) mendekati 0.
Tabel 2 Rancangan model PLSDA
Pemanfaatan sifat reflektans untuk analisis sampel heterogen atau sampel padat memerlukan suatu alat yang berbasis reflektans. Penelitian bertujuan membuat spektrofotometer sinar tampak berbasis reflektansi atau sinar yang dipantulkan oleh sampel padatan dengan proses perancangan yang mengacu pada Public Laboratory (2013). Secara umum spektrofotometer terdiri atas sumber cahaya, pemilih panjang gelombang (monokromator) dan detektor. Oleh karena itu, pengembangan dalam penelitian ini yaitu membuat suatu spektrofotometer dengan komponen-komponen yang memiliki fungsi yang sama namun mudah didapat, praktis dan harga yang terjangkau. Komponen tersebut antara lain lampu LED putih (light emitting diode) sebagai sumber sinar, lapisan optik DVD (digital versatile disks) sebagai kisi, web camera sensor CCD (charge-couple device)
sebagai detektor, dan perangkat komputer untuk mengakses piranti lunak spectral workbench.
6
lumen maka semakin kuat intensitas cahaya yang dipancarkan. Lampu senter dengan lumen sebesar 1300 dipilih karena dasar pengukuran yaitu berupa reflektansi atau sinar yang dipantulkan maka diperlukan baterai dengan daya yang cukup kuat dan dapat memberikan intensitas sekitar 75%. Lampu senter ini cukup memberikan intensitas sekitar 75%. Kelebihan dari lampu ini yaitu sebagai sumber sinar yang sederhana dan mudah didapat, selain itu ukuran yang dimiliki kecil dan mudah diletakkan di dalam spektrofotometer. Menurut Albert et al. (2012) kelebihan dari lampu LED adalah praktis dengan ukurannya yang kecil, tidak memproduksi sinar ultraviolet dan inframerah, tahan lama, dan memancarkan radiasi cahaya pada panjang gelombang sinar tampak. Berdasarkan pengukuran pancaran radiasi LED memberikan intensitas yang tinggi pada kisaran 400-600 nm (Lampiran 2). Kelemahannya yaitu baterai yang digunakan kurang tahan lama sehingga harus dilakukan pengisisan daya baterai apabila intensitas yang diberikan semakin menurun. Hal tersebut ditunjukkan pada saat pengukuran standar barium sulfat, yaitu kurang dari 75%.
Pemilih panjang gelombang atau monokromator yang digunakan yaitu berupa DVD yang memiliki lapisan optik sebagai kisi. Wakabayashi dan Hamada (2006) menggunakan DVD sebagai monokromator dengan resolusi tinggi karena memiliki kisi pada lapisan optiknya. Satu lingkaran keping DVD memiliki jarak Track record sebesar 0.74 μm dan kisi sebesar 1350 garis/mm. Semakin kecil jarak tiap track record dan semakin banyak jumlah tiap garisnya maka spektrum warna yang dihasilkan akan lebih rapat dan kontinu. Ukuran lapisan optik pada DVD dipotong sesuai dengan luas lensa web kamera, yaitu sebesar 2×2 cm2, lalu dipilih bagian yang paling tegak lurus dan ditempelkan di depan lensa web kamera. Dipilih bagian yang tegak lurus agar cahaya yang didifraksikan sempurna. Selain itu, karena lensa optik DVD ditempelkan pada web kamera maka posisi web kamera dibuat 45°. Hal ini dikarenakan kisi pada DVD dapat menampilkan warna apabila dikenai cahaya yang datang pada sudut 45° terhadap lensa optik DVD.
Komponen terakhir yaitu alat pendeteksi atau detektor. Detektor berfungsi mengubah energi radiasi menjadi sinyal listrik. Detektor tersusun atas tranduser yang menghasilkan sinyal listrik yang besarnya sebanding dengan daya radiasi yang diterima. Spektrofotometer yang dirancang menggunakan web kamera yang dilengkapi CCD (charge-coupled device) sebagai detektor. CCD merupakan sensor yang dapat menangkap cahaya yang terdiri atas jutaan fotodioda (piksel) yang akan menghasilkan muatan yang sebanding dengan besarnya cahaya yang diterima (Magnan 2003). Muatan ini oleh penguat akan diubah menjadi tegangan listrik lalu menjadi sinyal analog. Sinyal analog ini berupa spektrum gambar yang dikonversi menjadi nilai RGB (red-green-blue). Selain itu, penggunaan web kamera sebagai detektor dikarenakan alatnya lebih sederhana dibandingkan kamera digital, tidak membutuhkan tempat penyimpanan data, serta data hasil perekaman dapat langsung dipindahkan ke komputer. Sedangkan kelebihan dari penggunaan sensor CCD pada web kamera yaitu memiliki resolusi tinggi dan dapat mengatasi ketersediaan cahaya yang lemah dibandingkan dengan CMOS (Pamungkas 2014).
7
dengan tujuan yang sama tutup kotak harus dipasang. Langkah selanjutnya adalah mencari posisi yang tepat untuk meletakkan masing-masing komponen di dalam kotak tersebut. Posisi yang tepat adalah posisi saat diperoleh spektrum yang jelas, tajam, stabil, memiliki intensitas yang optimum dan dapat ditangkap oleh detektor dengan baik.
Sudut antara sumber sinar dan tempat sampel yaitu 45° karena diduga pada sudut 45° cahaya yang dipantulkan oleh sampel adalah paling optimum. Untuk sudut datang yang lebih besar dari sudut kritis, tidak ada sinar refraksi yang terjadi, fenomena ini disebut sebagai refleksi internal total (sudut kritis kaca dan udara sebesar 41.8o) (Halliday et al. 1978). Berdasarkan hukum pantulan, yang terjadi adalah pantulan spekular, karena pada saat objek disinari berkas cahaya , cahaya tidak akan ditangkap detektor, kecuali jika ditempatkan pada posisi yang benar saat hukum pantulan terpenuhi. Kemudian posisi web kamera terhadap cahaya yang datangpun dibuat 45°, hal ini dikarenakan kisi pada DVD dapat menampilkan warna apabila dikenai cahaya yang datang pada sudut 45° terhadap lensa optiknya. Kisi berfungsi sebagai pendispersi yang bertujuan untuk memisahkan cahaya putih menjadi warna-warna pembentuknya dan menjadi spektrum yang lengkap (Giancoli 2001). Sistem dari kisi yang digunakan adalah kisi difraksi, karena digunakan sejumlah celah paralel yang berjarak sama yang disebut kisi transmisi. Kisi transmisi keping DVD berisi 1350 garis/mm (Wakabayashi & Hamada 2006). Celah-celah tersebut menyebabkan cahaya yang datang mengalami difraksi dan masing-masingnya menyebarkan cahaya dengan sudut yang sangat besar pada layar yang jauh di belakang kisi. Namun, sistem dari spektrofotometer yang dibuat adalah cahaya yang melalui kisi langsung ditangkap oleh detektor. Kemudian dibagian depan sumber sinar dibuat celah dengan lebar 0.2 cm bertujuan agar sinar yang dipancarkan pada sampel terfokus dan tidak menyebar. Sehingga saat pengukuran, sinar yang ditembakan tepat pada bagian dari sampel yang ingin diketahui intensitasnya.
Selain komponen-komponen tersebut, dibuat pula tempat sampel, tempat sampel dilengkapi kaca preparat di bagian depan bertujuan untuk meningkatkan intensitas. Jika foton datang mengenai sampel, maka akan terjadi beberapa proses, yaitu absorpsi (diserap), transmisi (diteruskan), dan refleksi (dipantulkan). Banyaknya sinar yang dipantulkan dari suatu permukaan hanya 4% dan selebihnya akan ditransmisikan menuju sampel. Oleh karena itu, tanpa adanya kaca sebagai penguat sinyal, maka intensitas yang diperoleh sangat kecil sehingga perbedaan intensitas akan sulit diamati.
8
a b
Gambar 2 Spektrofotometer reflektans (a) tampak dari atas dan (b) tampak dari samping
Spektrofotometer dikalibrasi dengan mengganti lampu LED dengan compact fluorescent lamp (CFL) atau di pasaran dikenal dengan lampu neon. Daya yang dipakai sebesar 15 W. CFL dipilih karena memiliki spektrum warna yang khas, dicirikan dengan puncak serapan pada panjang gelombang 436 untuk indigo dan dan 546 nm untuk hijau. Bahan yang digunakan untuk kalibrasi yaitu Barium sulfat yang dipadatkan. Barium sulfat diletakkan pada tempat sampel dan diukur dengan lampu CFL. Spektrum kalibrasi ditunjukkan pada Gambar 3. Berdasarkan spektrum, intensitas yang diperoleh kurang dari 75% bahkan hanya 25%. Hal ini tidak menjadi masalah karena yang diutamakan puncak serapan indigo dan hijau terbentuk ditandai dengan intensitas yang tinggi. Kalibrasi dilakukan untuk membentuk skala panjang gelombang pada sampel. Langkah-langkah kalibrasi ditunjukkan pada Lampiran 3. Kalibrasi dinyatakan selesai saat panjang gelombang pada spektrum telah ditampilkan. Selanjutnya, data kalibrasi ini dijadikan sebagai acuan panjang gelombang pada semua pengukuran analisis dengan lampu LED.
Gambar 3 Spektrum barium sulfat dengan CFL setelah kalibrasi Spektrum Reflektans Sampel Biopsi
9
human papilloma virus (HPV) diduga kuat sebagai penyebab utama kanker serviks. Penelitian bertujuan mengelompokkan antara jaringan prakanker serviks (cervical interepithelial neoplasias, CIN) berbagai stadium dan normal berdasarkan nilai reflektans yang dihasilkan pada pengukuran menggunakan spektrofotometer sederhana yang telah dibuat sebelumnya. Sampel jaringan kanker berupa hasil biopsi yang dibekukan pada blok parafin (Gambar 4). CIN (Neoplasia antarepitel serviks) merupakan tahap awal perubahan sel normal menjadi sel kanker serviks (lesi prakanker). Proses perubahan sel normal menjadi sel kanker diawali dengan perubahan sel normal menjadi CIN 1 (stadium 1) atau disebut karsinoma in situ (sel abnormal hanya ditemukan di dalam lapisan serviks), lalu berkembang menjadi CIN 2 (stadium 2) yaitu mulai ditemukan kanker pada leher rahim, kemudian CIN 3 (stadium 3) kanker sudah ditemukan menyebar di luar leher rahim tetapi tidak menyebar ke dinding pelvis atau sepertiga bagian bawah vagina (Tim CancerHelps 2014).
Gambar 4 Sampel hasil biopsi jaringan berupa blok parafin
Bagian yang digunakan sebagai penanda dalam pengukuran yaitu daerah yang berwarna kuning kecoklatan. Lampu LED ditembakkan pada daerah tersebut maka beda intensitas pantulan dari tiap-tiap sampel digunakan sebagai dasar pengelompokkan. Pengukuran barium sulfat dijadikan sebagai blangko, karena serapan barium sulfat memberikan nilai intensitas 75% (Gambar 5).
10
Setelah semua sampel diukur, masing-masing spektrum garis hasil pengukuran perlu dilakukan koreksi panjang gelombang terhadap pengukuran barium sulfat dengan lampu CFL yang telah dilakukan sebelumnya. Spektrum sampel hasil pengukuran ditunjukkan pada Gambar 6. Selanjutnya data diunduh sehingga diperoleh data berupa nilai intensitas RGB terhadap panjang gelombang dalam bentuk .xls (Lampiran 4). Nilai dari rata-rata intensitas RGB selanjutnya digunakan untuk menghitung nilai reflektan. Spectral workbench ini mengukur serapan dari rentang panjang gelombang 227.75-799.19 nm, namun karena sumber radiasi yang digunakan yaitu lampu LED yang memiliki serapan pada cahaya tampak, maka untuk analisis data hanya digunakan rentang panjang gelombang dari 400.35-600.66 nm. Hasil pengukuran intensitas spesimen jaringan kanker dan normal setelah dihitung menjadi nilai reflektanS ditunjukkan pada Lampiran 5.
Gambar 6 Spektrum sampel
11
kanker telah dibuktikan oleh penelitian Sofian (2015) dengan melihat perbedaan serapan HbO2 dan Hb pada serapan cahaya tampak dan NIR menggunakan fotometer.
Gambar 7 Spektrum reflektans sampel terhadap panjang gelombang
Distribusi Kelompok Data dengan Analisis Komponen Utama (AKU)
Tahap selanjutnya adalah mengelompokkan sel kanker dan normal berdasarkan nilai reflektans menggunakan analisis multivariat untuk melihat pola distribusi sampel. Seluruh contoh yang telah dihitung reflektannya diberi perlakuan pendahuluan berupa eksplorasi pemrosesan sinyal. Hasil eksplorasi menunjukkan dengan koreksi garis dasar diperoleh pengelompokkan yang lebih baik dibandingkan tanpa perlakuan pendahuluan. Setelah itu di analisis dengan metode analisis komponen utama (AKU) atau pricipal component analysis (PCA). AKU merupakan metode analisis peubah ganda yang bertujuan memperkecil dimensi peubah asal sehingga diperoleh peubah baru yaitu komponen utama (KU) yang tidak saling berkorelasi tetapi menyimpan sebagian informasi yang terkandung pada peubah asal (Miller & Miller 2000).
12
Gambar 8 Plot skor analisis komponen utama jaringan kanker dan normal Sehubungan dengan hasil analisis komponen utama tersebut, berikutnya data spektrum CIN 1 dan normal dievaluasi lebih lanjut secara terpisah menggunakan AKU. Hal ini bertujuan untuk memperjelas bahwa antara spesimen jaringan normal dan jaringan yang mulai terinfeksi kanker serviks terdistribusi dengan baik yang ditunjukkan dengan pola pengelompokkan yang terpisah antara CIN 1 dan normal pada plot skor (Gambar 9). Plot KU dapat memberikan informasi 78.0% dari total varians, yaitu KU-1 sebesar 57.0% dan KU-2 sebesar 21.0%. Pengelompokkan terjadi karena antara spesimen jaringan CIN 1 dan normal memiliki karakteristik kimia yang berbeda sehingga spektrum reflektansinya pun berbeda. Pola pengelompokkan sampel yang baik ini mengakibatkan metode dapat digunakan untuk membantu ahli patologi dalam melakukan deteksi dini.
13
Model Klasifikasi dengan Analisis Diferensial Kuadrat Terkecil Parsial (PLSDA)
PLSDA merupakan metode pengelompokkan yang sering diterapkan untuk memudahkan memperoleh model yang dapat membuat separasi antarkelas. Model analisis multivariat ini dikembangkan dari set pengamatan berdasarkan keanggotaan kelas yang telah ditemtukan sebelumnya (Umetrics 2006). Dengan kemampuannya untuk mendiskriminasi data antarkelas, maka PLSDA cocok digunakan dalam analisis data multivariat dari nilai reflektan biopsi jaringan kanker serviks dan normal yang telah terbagi menjadi 4 kelas. Model prediksi PLSDA menggunakan teknik pendekatan PLS. Standar algoritma PLS dapat dipergunakan dengan peubah tak bebas (Y) berupa data kelompok dan peubah bebas (X) yang sangat banyak, memiliki kolinieritas tinggi, dan memiliki struktur yang sistematik dengan menggunakan regresi kuadrat terkecil (Westerhuis et al. 2008). Peubah yang digunakan pada saat pembuatan model terdiri atas matriks X berupa data spektrum reflektans yang telah dilakukan perlakuan pendahuluan, dan matriks Y merupakan respons untuk setiap kelas kelompok. Saat salah satu kelas diberi respon nilai 1, maka kelas lainnya diberi respon 0. Selanjutnya dibangun model CIN 1, CIN 2, CIN 3, dan normal. Kebaikan suatu model klasifikasi pada metode PLSDA dilihat dari nilai koefisien determinasi (R2), galat kalibrasi akar rerata kuadrat (RMSEC), dan galat prediksi akar rerata kuadrat (RMSEP). Model dikatakan baik jika memiliki nilai R2 mendekati 1 dan galat sangat kecil atau mendekati 0 (Brereton 2003).
Tabel 3 Analisis model PLSDA
Model PLS-DA Kelompok RMSEC R2 RMSEP R2
14
sudah baik namun dianggap masih belum cukup sensitif sebagai model klasifikasi. Model yang terakhir yaitu model 2 kelompok (Cin & normal), diperoleh nilai galat yang paling kecil dibandingkan kedua model yang lain, sehingga nilai koefisien determinasi yang diperoleh besar, yaitu mendekati nilai 1. Hasil ini menunjukkan bahwa metode ini belum dapat digunakan untuk mengelompokkan spesimen jaringan kanker serviks antara CIN 1, CIN 2, CIN 3, dan normal. Namun sudah cukup baik jika digunakan untuk memutuskan status biopsi antara jaringan kanker dan normal saja. Hal ini diduga kemiripan karakteristik kimia ketiga stadium jaringan kanker serviks menyebabkan dibutuhkan alat yang lebih sensitif dengan keakuratan yang lebih tinggi untuk mendeteksinya.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Spektrofotometer UV-Vis reflektans dapat digunakan untuk mengukur nilai reflektansi dari sampel jaringan biopsi. Analisis komponen utama (AKU) memperoleh nilai plot KU pada plot skor sebesar 88.0% dan berdasarkan plot menunjukkan jaringan kanker CIN 1 dan CIN 2 belum dapat dibedakan, tetapi dengan CIN 3 dan sel normal sudah dapat dibedakan. Penggunaan model PLSDA memberikan klasifikasi dan tingkat ketepatan yang baik dengan semakin kecilnya nilai galat. Karakeristik yang mirip antara stadium sel kanker menyebabkan ketepatan klasifikasi menjadi semakin berkurang. Metode AKU dan PLSDA memberikan hasil yang baik untuk mengelompokkan antara sel kanker dan normal.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengembangkan alat spektrofotometer dan mencari daya sumber radiasi yang lebih tahan lama.
DAFTAR PUSTAKA
Albert DR, Todt MA, Davis HF. 2012. A low-cost quantitative absorption spectrophotometer. Journal Chemical Education. 89: 1432–1435.
Bakker A, Smith B, Ainslie P, Smith K. 2012. Near infrared spectroscopy applied aspect of ultrasonography in human. Di dalam: Ainslie P, editor. Ultrasonography in Human [Internet]. Bogor (ID): Loji. Hlm 65-88; [Diunduh 2015]. Tersedia pada: http://www.ontechopen.com/books/applied-aspects-of-ultrasonography-in-humans-/near-infrared-spectroscopy.
Brereto RG. 2003. Chemometrics: Data Analysis FOR The Laboratory AND Chemical Plant. England (IN): Jhon Willey & Sons.
15
Giancoli D C. 2001. Fisika. Edisi ke-5. Yuhilza H, Irwan A, penerjemah; Hilarius W, editor. Jakarta (ID): Penerbit Erlangga. Terjemahan dari: Physics.
Halliday D, Robert R. 1978. Fisika.Edisi ke-3. Pantur S, Erwin S, penerjemah. Jakarta (ID): Penerbit Erlangga. Terjemahan dari: Physics.
Hidayah NN. 2009. Sifat optik buah jambu biji (Psidium guajava) yang disimpan dalam toples plastik menggunakan spektrofotometer reflektan UV-Vis [Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Magnan P. 2003. Detection of visible photons in CCD and CMOS: a comparative view. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research A. 504: 199– 212.
Marchesini R, N Cascinelli, M Brambilla, C Clemente, L Mascheroni, E Pignoli, A Testori, D R Venturoli. 1992. In vivo spectrophotometric evaluation of neoplastic and non-neoplastic skin pigmented lesions. II: Discriminant analysis between nevus and melanoma.Photochemistry and Photobiology. 55(4): 515-522.
Marchesini R, S Tomatis, C Bartoli, A Bono, C Clemente, C Cupeta, I Del Prato, E Pignoli, E Sichirollo, N Cascinelli. 1995. In vivo spectrophotometric evaluation of neoplastic and non-neoplastic skin pigmented lesions. III: CCD Camera-Based reflectance imaging.Photochemistry and Photobiology. 62(1): 151-154.
Miller JC, Miller JN. 2000. Statistic and Chemometrics for Analytical Chemistry. Ed-4. Harlow: Pearson Education.
Mulyati. 2014. Pengembangan dan pengukuran kinerja analitik spetrofotometer sinar tampak „kuantivis‟ berbasis detektor charge-couple device [Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Pamungkas WS. 2014. Pengembangan spektrofotometer sinar tampak (kuantivis) berbasis komponen elektronik umum dan uji kinerjanya [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Publiclab. 2013. Desktop Spectrometry Kit [internet]. [diakses 2014 Januari 10]. Tersedia dari: http://www.publiclab.org/wiki/dsk.
Sofian A. 2014. Klasifikasi sel kanker rahim berdasarkan intensitas cahaya tampak dan inframerah dekat dengan analisis diskriminan [Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Skoog DA, West DM, Holler FJ, Crouch SR. 2004. Fundamentals of Analytical Chemistry. Toronto: Thomson.
Spragg Richard. 2013. Reflection Measurement in IR Spectroscopy. Seer Green (UK): PerkinElmer,inc.
Tim CancerHelps. 2010. Kanker, Kanker Bukan Lagi Vonis Mati. Jakarta (ID): Agro Media Pustaka.
Wakabayashi F, Hamada K. 2006. A DVD spectroscope: a simple, high-resolution classroom spectroscope. Journal Chemical Education. 83(1):56–58.
Westerhuis JA, Hoefsloot CJH, Smit S, Vis DJ, Smiled AK, van Velsen EJJ, Duijnhoven JPM, van Doesten FA. 2008. Assesment of PLSDA cross validation. Journal Metabolomics. 4(1):81-89.
17
Lampiran 2 Spektrum Lampu LED pengukuran spektrofotometer reflektans
Lampiran 3 Kalibrasi spektrofotometer
-50 0 50 100 150 200 250
0 200 400 600 800 1000
Intensit
as
18
Lampiran 3 (Lanjutan)
19
Lampiran 4 (Lanjutan)
Lampiran 5 Data dan hasil perhitungan reflektans
Sampel 400.35 nm ... 600.66 nm
I %I R I %I R I %I R
Blangko 117 45,53 122 47,47 104 40,47
20
Lampiran 5 (Lanjutan) Contoh perhitungan:
Lampiran 6 Model PLSDA 4 kelompok Panjang
gelombang Y1 Y2 Y3 Yn 400,35 401,24 ... 600,66
1.1 1 0 0 0 0,1385 0,1284 0,1384 0,2634
1.2 1 0 0 0 0,1152 0,1028 0,1018 0,4172
1.3 1 0 0 0 0,1767 0,1718 0,1739 0,2847
... 1 0 0 0 0,1056 0,0940 0,1011 0,3402
2.1 0 1 0 0 0,1487 0,1387 0,1443 0,3804
2.2 0 1 0 0 0,1804 0,1710 0,1769 0,3009
2.3 0 1 0 0 0,1242 0,1008 0,1116 0,3546
... 0 1 0 0 0,1593 0,1587 0,1646 0,2756
3.1 0 0 1 0 0,0221 0,0037 0,0006 0,0104
3.2 0 0 1 0 0,0198 0,0162 0,0164 0,0193
3.3 0 0 1 0 0,0110 0,0001 0,0039 0,0027
... 0 0 1 0 0,0215 0,0000 0,0041 0,0132
N1 0 0 0 1 0,0173 0,0096 0,0204 0,3117
N2 0 0 0 1 0,0315 0,0164 0,0200 0,3432
N3 0 0 0 1 0,0110 0,0068 0,0059 0,3070
... 0 0 0 1 0,0095 0,0016 0,0011 0,3134
Lampiran 7 Model PLSDA 3 kelompok Panjang
gelombang Y1.2 Y3 Yn 400,35 401,24 ... 600,66
1.1 1 0 0 0,1385 0,1284 0,1384 0,2634
1.2 1 0 0 0,1152 0,1028 0,1018 0,4172
1.3 1 0 0 0,1767 0,1718 0,1739 0,2847
... 1 0 0 0,1056 0,0940 0,1011 0,3402
2.1 1 0 0 0,1487 0,1387 0,1443 0,3804
2.2 1 0 0 0,1804 0,1710 0,1769 0,3009
2.3 1 0 0 0,1242 0,1008 0,1116 0,3546
21
Lampiran 7 (Lanjutan) Panjang
gelombang Y1.2 Y3 Yn 400,35 401,24 ... 600,66
3.1 0 1 0 0,0221 0,0037 0,0006 0,0104
3.2 0 1 0 0,0198 0,0162 0,0164 0,0193
3.3 0 1 0 0,0110 0,0001 0,0039 0,0027
... 0 1 0 0,0215 0,0000 0,0041 0,0132
N1 0 0 1 0,0173 0,0096 0,0204 0,3117
N2 0 0 1 0,0315 0,0164 0,0200 0,3432
N3 0 0 1 0,0110 0,0068 0,0059 0,3070
... 0 0 1 0,0095 0,0016 0,0011 0,3134
Lampiran 8 Model PLSDA 2 kelompok Panjang
gelombang Y1.2.3 Yn 400,35 401,24 ... 600,66
1.1 1 0 0,1385 0,1284 0,1384 0,2634
1.2 1 0 0,1152 0,1028 0,1018 0,4172
1.3 1 0 0,1767 0,1718 0,1739 0,2847
... 1 0 0,1056 0,0940 0,1011 0,3402
2.1 1 0 0,1487 0,1387 0,1443 0,3804
2.2 1 0 0,1804 0,1710 0,1769 0,3009
2.3 1 0 0,1242 0,1008 0,1116 0,3546
... 1 0 0,1593 0,1587 0,1646 0,2756
3.1 1 0 0,0221 0,0037 0,0006 0,0104
3.2 1 0 0,0198 0,0162 0,0164 0,0193
3.3 1 0 0,0110 0,0001 0,0039 0,0027
... 1 0 0,0215 0,0000 0,0041 0,0132
N1 0 1 0,0173 0,0096 0,0204 0,3117
N2 0 1 0,0315 0,0164 0,0200 0,3432
N3 0 1 0,0110 0,0068 0,0059 0,3070
22
