POTENSI ANTIKANKER EKSTRAK DAUN SIRIH MERAH
(
Piper crocatum
) TERHADAP SEL HeLa
DHIAN ANUGERAH PURNAMA SUCI
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Potensi Antikanker Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap Sel HeLa adalah benar karya saya denganarahan dari komisi pembimbing dan dibiayai oleh DIKTI dalam bentuk PKMP tahun 2013 dan BPOPTN 2013. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
ABSTRAK
DHIAN ANUGERAH PURNAMA SUCI. Potensi Antikanker Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap Sel HeLa dibimbing oleh MEGA SAFITHRI dan SILMI MARIYA.
Kanker serviks merupakan kanker penyebab kematian kedua terbesar pada wanita di Indonesia setelah kanker payudara. Salah satu upaya pengobatan kanker dapat dilakukan dengan memanfaatkan senyawa dari bahan alam. Salah satu tanaman yang mempunyai potensi sebagai antikanker adalah daun sirih merah. Berdasarkan penelitian sebelumnya ekstrak methanol daun sirih merah memiliki nilai IC50 44.25µg/mL pada sel kanker payudara (T47D). Tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui aktivitas antikanker ekstrak air, etanol 30%, dan simplisia daun sirih merah terhadap sel Chang dan sel HeLa secara in vitro dengan uji Microculture Tetrazolium Technique (MTT). Hasil uji menunjukkan potensi antikanker terbaik adalah simplisia daun sirih merah yang dapat menghambat 86 % pertumbuhan sel HeLa dibandingkan dengan ekstrak air dan etanol 30% dengan nilai % inhibisi masing-masing 46% pada konsentrasi 800 ppm dan 39% pada konsentrasi 400 ppm.
Kata kunci: kanker serviks, % inhibisi, MTT, sel HeLa, Sirih merah
ABSTRACT
DHIAN ANUGERAH PURNAMA SUCI. Anticancer Activity OfPiper crocatum Leaves Extract In Hela Cells. Supervised by MEGA SAFITHRI and SILMI MARIYA.
Cervical cancer is the most common death cause of cancer in Indonesian after human breast cancer. One of the efforts of cancer treatment is the utilization of natural materials compounds. Some plants have potential as anticancer for example leaves of Piper crocatum. Base of previous study methanol extract Piper crocatum has IC50 values 44.25 µg/mL on breast cancer cells (T47D). The purpose of this study was to determine inhibition activity of Piper crocatum ethanol, waters extract and Piper crocatum leaves powder against HeLa and Chang cells by Microculture Tetrazolium Technique (MTT) assay. The result showed that Piper crocatum leaves powder has higher inhibition with value 86% at 800 ppm which was higher than water and ethanol 30% with % inhibition 46% at 800ppm and 39% at 400 ppm.
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
POTENSI ANTIKANKER EKSTRAK DAUN
SIRIH MERAH (
Piper crocatum
) TERHADAP SEL HeLa
DHIAN ANUGERAH PURNAMA SUCI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Skripsi : Potensi Antikanker Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap Sel HeLa
Nama : Dhian Anugerah Purnama Suci NIM : G84090073
Disetujui oleh
Dr.Mega Safithri, S.Si, M.Si Pembimbing I
Silmi Mariya, S.Si, MSi Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc Ketua Departemen
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan judul Potensi Antikanker Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap Sel HeLa. Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan September 2012 sampai Agustus 2013. Bertempat di Laboratorium Biokimia, FMIPA IPB untuk persiapan ekstrak dan pengujian MTT dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi Lembaga Penelitian dan Pengembangan Masyarakat Pusat Studi Satwa Primata (LPPM-PSSP), Institut Pertanian Bogor (IPB).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Mega Safithri, S.Si, M.Si dan Silmi Mariya S.Si, M.Si selaku komisi pembimbing atas segala kesabarannya dalam memberikan bimbingan, arahan serta masukan kepada penulis dalam penyusunan karya ilmiah ini. Ungkapan terima kasih juga dipersembahkan kepada kedua orang tua Bapak Agus Tisna Purwana dan Ibu Siti Yenny Chodijah, dan adik tercinta Dwi Cheppy Dharmawan atas doa, kasih sayang dan dukunganya.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Mba Iin, Yayuk, Suhe, Nofa, Anes, dan Hana atas bantuan, saran serta semangat. Ucapan terimakasih juga penulis berikan kepada Deni Suhendar, Zakiya, Yusti, Wuri, Utti, Inong, Indah, Novi, Mina atas doa, semangat, kasih sayang, dukungan moril serta segala motivasi untuk selalu berusaha membuat penulis menjadi lebih baik. Tidak lupa ucapan terima kasih kepada teman-teman Biokimia 46 atas segala doa, nasihat dan dukungan yang telah diberikan. Semoga karya ilmiah ini dapat memberikan manfaat bagi seluruh pembaca serta dapat menjadi langkah awal penulis untuk mencapai impiannya.
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
DAFTAR ISI vii
PENDAHULUAN 1
METODE 2
Waktu dan Tempat Penelitian 2
Bahan 2
Alat 2
Prosedur Percobaan 2
HASIL DAN PEMBAHASAN 4
Hasil 4
Pembahasan 9
SIMPULAN 11
SARAN 11
DAFTAR PUSTAKA 11
LAMPIRAN 14
DAFTAR GAMBAR
1 Aktivitas Inhibisi simplisia pada sel Chang 5
2 Aktivitas Inhibisi simplisia pada sel HeLa 5
3 Aktivitas Inhibisi ekstrak etanol 30% pada sel Chang 6 4 Aktivitas Inhibisi ekstrak etanol 30% pada sel HeLa 6
5 Aktivitas Inhibisi ekstrak air pada sel Chang 7
6 Aktivitas Inhibisi ekstrak air pada sel HeLa 7
7 Aktivitas Inhibisi kontrol positif 8
8 Sel Chang 8
9 Sel HeLa 9
DAFTAR LAMPIRAN
1 Strategi penelitian 14
2 Kadar air simplisia daun sirih merah 15
3 Rendemen ekstrak daun sirih merah 16
4 Aktivitas % inhibisi pada sel Chang 17
5 Aktivitas % inhibisi pada sel HeLa 18
6 Analisis statistik % inhibisi simplisia dan ekstrak daun sirih merah
terhadap sel Chang menggunakan program SPSS 19
7 Analisis statistik % inhibisi simplisia dan ekstrak daun sirih merah
PENDAHULUAN
Penyakit kanker merupakan penyakit yang menjadi salah satu ancaman utama terhadap kesehatan karena merupakan penyebab kematian kedua setelah penyakit jantung. Setiap tahunnya sekitar 7,6 juta orang di seluruh dunia meninggal karena kanker (WHO 2008). Kanker serviks menduduki peringkat kedua yang diderita oleh perempuan. Setiap tahunnya sekitar 53.000 kasus kanker serviks terjadi, 85% kasus kanker serviks berasal dari negara berkembang (Asiancancer 2012). Menurut Sistem Informasi Rumah Sakit (SIRS) tahun 2008, kanker serviks merupakan jenis kanker tertinggi kedua di Indonesia dengan persentasi pasien rawat inap sebesar 10,3 %. Berdasarkan Yayasan Kanker Indonesia tahun 2006 kanker serviks menempati urutan pertama dengan angka 16 persen, yang kemudian disusul dengan kanker payudara 15 persen.
Pengobatan konvensional yang paling sering digunakan untuk mengobati kanker serviks diantaranya adalah histerektomi, radiasi dan kemoterapi. Histerektomi adalah cara yang paling sering digunakan. Terdapat dua jenis histerektomi yaitu histerektomi pengangkatan leher rahim dan rahim dan histerektomi radikal yaitu pengangkatan leher rahim, rahim, vagina bagian atas, ovarium, saluran telur, kelenjar getah bening yang terkena. Radioterapi adalah terapi dengan sinar radiasi yang dapat merusakan sel kanker. Kekurangan radioterapi adalah efek radiasinya dapat merusak fungsi dari ovarium terutama pada wanita yang belum menopause. Kemoterapi pada pasien kanker serviks lebih dianjurkan bagi para penderita kanker serviks stadium lanjut maupun pasien dengan kasus kekambuhan. Namun dampak negatif yang dihasilkan kemoterapi sangatlah besar, bagi pasien kanker serviks dengan kondisi tubuh yang lemah umumnya tidak tahan dengan pengobatan seperti ini (Asiancancer 2012). Efek samping dari kemoterapi dan radioterapi diantaranya adalah mual, muntah, dan rambut rontok, masalah kulit, dan kelelahan (Semuel 2008).
Berbagai kendala dan efek samping yang ditimbulkan dari berbagai cara pengobatan kanker memicu perlunya suatu terobosan cara pengobatan kanker dengan efektifitas tinggi dan efek samping yang minimal. Salah satu upaya untuk mengatasi penyakit kanker ini adalah mengembangkan pembuatan obat herbal dari tumbuh-tumbuhan yang memiliki senyawa antikanker. Indonesia sebagai negara dengan kekayaan biodiversitas yang tinggi memiliki banyak tumbuhan yang dapat digunakan sebagai obat-obatan. Departemen Perdagangan Indonesia (2011) menyebutkan Indonesia memiliki sebanyak 30.000 tanaman obat dari total 40.000 tanaman obat di dunia. Eksplorasi tumbuhan yang berpotensi sebagai antikanker perlu terus dikembangkan karena ancaman penyait kanker yang semakin hari semakin meningkat dan semakin tingginya biaya yang harus dikeluarkan untuk pengobatan kanker.
2
menyatakan bahwa ektrak etanol daun sirih merah memiliki aktivitas antioksidan dengan menghambat oksidasi asam lemak dengan daya hambat 80.40%, selain itu juga memiliki aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase. Penelitian Wicaksono (2009) ekstrak methanol daun sirih merah dapat menghambat proliferasi sel kanker payudara (T47D).
Penelitian ini diharapkan bisa dijadikan sebagai informasi penting tehadap khasiat ekstrak air, etanol 30%, dan serbuk simplisia sirih merah sebagai antikanker. Penelitian ini juga diharapkan dapat dikembangkan dan diaplikasikan untuk dijadikan sebagai obat tradisional antikanker. Sampai saat ini belum ada laporan penelitian tentang aktivitas ekstrak air dan etanol 30% sirihmerah (Piper crocatum) terhadap sel kanker serviks baik secara in vitro maupun in vivo. Penelitian ini bertujuan menguji potensi antikanker terbaik dari ekstrak air, etanol 30% dan simplisia daun sirih merah terhadap sel hati (Chang) sebagai kontrol sel normal dan sel kanker serviks (HeLa) secara in vitro dengan metode MTT assay.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan mulai bulan September 2012 hingga Agustus 2013 yang dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi Pusat Studi Satwa Primata LPPM IPB, Bogor.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sirih merah (Piper crocatum), etanol 30%, akuades, sel kanker servik (HeLa, ATCC-CCL 2) dan sel hati normal (Chang, ATCC-CCL 13) didapat dari American Type Culture Collection., Doxorubicin dan Cisplatin sebagai kontrol positif, Fetal Bovine Serum (FBS), Media Dulbecco’s Modifed Eagle Medium (D-MEM), kanamisin, 3-(4-,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT), larutan SDS 10%, HCl, kristal formazan, kertas saring Whatmann No.1.
Alat
Alat-alat yang digunakan adalah, penggiling, pipet tetes, pipet volumetrik, pipet mikro, neraca analitik, blender, rotavapor, microplate, Biosafety cabinet class II, sentrifuse, inkubator CO2, perangkat sumur kultur, mikropipet, microplate reader, dan alat gelas.
Prosedur Percobaan Pengeringan bahan uji
3
Penentuan Kadar air (metode SNI 01-2891-1992 yang dimodifikasi)
Cawan porselin dikeringkan dalam oven 105 °C selama 3 jam, kemudian ditempatkan dalam desikator selama 1 jam. Setelah itu ditimbang dengan neraca sartorius (a). Lalu ke dalam cawan ditambahkan sebanyak 2.0-2.5 g sampel (b). Cawan yang berisi sampel ditempatkan dalam oven 105 °C selama 3 jam. Setelah itu ditempatkan dalam desikator selama 1 jam. Bobot cawan dan sampel ditimbang (c). Pengeringan dilakukan beberapa kali sampai bobot sampel yang diperoleh konstan. Analisis dilakukan 3 kali ulangan untuk masing-masing sampel.
% Bobot kering (BK) = x 100% % Kadar air = 100 - %BK
Pembuatan ekstrak daun sirih merah (Depkes RI 2000)
Serbuk kering daun sirih merah diekstrak dengan metode refluks. Serbuk kering daun sirih merah sebanyak 20 g diekstrasi dengan 200 ml akuades dan 200 ml etanol 30% selama 2 jam pada suhu 100 °C untuk ekstrak air dan 70 °C untuk ekstrak etanol 30% menggunakan refluks. Ekstrak yang diperoleh kemudian disaring dengan kertas saring. Ekstraksi diulang tiga kali selama 6 jam. Kemudian ekstrak dilakukan freeze dry sehingga diperoleh ekstrak kasar.
Uji Sitotoksisitas dan Antikanker Ekstrak Daun Sirih Merah terhadap Sel Chang dan Sel Hela (Hsu et al.. 2010).
Pengujian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi Pusat Studi Satwa Primata LPPM-IPB, Bogor.
Media Sel Kanker (LCAG 2009). Media DMEM bubuk dimasukkan ke dalam botol steril dan ditambahkan 3.7 gram NaHCO3, antibiotik penisilinstreptomisin 1%, dan 10% FBS, kemudian dihomogenisasi dan ditambahkan akuabides sampai larutan media menjadi 1000 mL.
Kultur Sel (Li et al.. 2011). Sel Chang dan sel HeLa ditumbuhkan menggunakan flask dalam media DMEM. Setelah sel tumbuh (menempel pada dinding flask), medianya dibuang dan sel HeLa dalam flask dibilas dengan larutan PBS. Setelah itu, ditambahkan enzim tripsin sebanyak 5 mL, lalu dinkubasikan selama 5 menit, dan kemudian ditambahkan media penumbuh. Suspensi tersebut disentrifus pada kecepatan 700g selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh dibuang dan pellet (sel) yang diperoleh ditambah dengan 5 mL DMEM. Setelah itu, dilakukan perhitungan jumlah sel. Jumlah sel dihitung hingga masing-masing sumur ditumbuhkan 5.000 sel dalam 100 μL kultur sel tiap sumur sebanyak 96 sumur. Kultur sel tersebut diinkubasi selama 24 jam (overnight) dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37oC.
Perlakuan Ekstrak. Setelah kultur sel diinkubasi selama 24 jam medianya dibuang, kemudian dilanjutkan dengan perlakuan ekstrak. Ekstrak yang diuji meliputi ekstrak air, ekstrak etanol 30%, dan simplisia. Masing-masing larutan ekstrak terdiri atas 5 konsentrasi akhir pada microplate. Tahap awal perlakuan ekstrak adalah dengan membuat stok larutan ekstrak dengan konsentrasi masing-masing 10000 ppm, yang dibuat dengan cara melarutkan 10 mg ekstrak
dengan 50 μL DMSO, kemudian ditambah dengan 950 μL DMEM. Masing
4
mendapatkan konsentrasi akhir pada microplate. Konsentrasi akhir yang digunakan pada ekstrak air, etanol 30%, dan simplisia adalah 6.25, 12.5, 25, 50, dan 100, 200, 400, dan 800 ppm. Sumur microplate yang berisi sel dari tahap sebelumnya (kultur sel), ditambahkan 100 μL larutan ekstrak uji di atas sebagai perlakuan, dan ditambahkan 100 μL DMEM sebagai kontrol negatif. Campuran dalam microplate tersebut diinkubasi selama 48 jam dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37oC.
Uji MTT assay (CCRC 2000). Setelah diinkubasi 48 jam, dimasukkan garam tetrazolium 5mg/ml sebanyak 10 μL tiap sumur. Warna campuran menjadi kuning. Inkubasi selama 4 jam pada inkubator CO2 5% pada suhu 37oC. Setelah diinkubasi dan telah terbentuk kristal formazan, larutan ekstrak dibuang. Kristal formazan yang terbentuk dilarutkan dengan 100 μL etanol 96% pada tiap sumur. Warna larutan menjadi ungu. Nilai absorban dari formazan yang terbentuk diukur dengan microplate reader pada panjang gelombang 595 nm. Semua perlakuan dilakukan triplo.
Analisis Data
Data yang diperoleh dari uji sitotoksisitas dengan MTT berupa nilai absorban tiap sumur, kemudian nilai absorban tersebut dikonversi menjadi % inhibisi dengan menggunakan rumus (Zhang et al.. 2005):
% Inhibisi =
x100%
.Analisis statistik untuk membandingkan inhibisi tiap ekstrak dilakukan
dengan menggunakan One-Way ANOVA dengan SPSS. Jika terdapat perbedaan
yang nyata, maka analisis dilanjutkan dengan uji Duncan menggunakan program SPSS.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Kadar air dan Rendemen Ekstrak Daun Sirih Merah
5 Tabel 1 Rendemen ekstrak daun sirih merah
Pelarut Rendemen
(%)
Etanol 30 % 31.42
Air 17.42
Aktivitas Sitotoksisitas Sel Chang dan Antikanker Sel HeLa Daun Sirih Merah
Hasil % inhibisi dan beda nyata untuk simplisia daun sirih merah dapat dilihat pada Gambar 1 untuk uji sitotoksisitas daun sirih merah terhadap sel Chang dan Gambar 2 untuk hasil aktivitas antikanker daun sirih merah. Baik hasil uji sitotoksisitas maupun hasil aktivitas antikanker daun sirih merah ditandai dengan % inhibisi sel. Hasil uji % inhibisi simplisia daun sirih merah terhadap sel Chang menunjukan hasil yang fluktuatif antara konsentrasi dan % inhibisi sel Chang. Hasil % inhibisi tertinggi pada sel Chang terlihat pada konsentrasi 800 ppm dengan % inhibisi 84.11%, hasil ini berbeda nyata dengan konsentrasi yang lainnya. Hasil % inhibisi pada sel HeLa juga menunjukan hasil yang fluktuatif antara konsentrasi dan % inhibisi (Gambar 2). Hasil % inhibisi tertinggi pada sel HeLa terlihat pada konsentrasi 800 ppm dengan inhibisi 85.74%.
Gambar 1 Inhibisi simplisia pada sel Chang pada variasi konsentrasi (%)
Gambar 2 Inhibisi simplisia pada sel HeLa pada variasi konsentrasi (%)
6
Hasil % inhibisi dan beda nyata untuk ekstrak etanol 30% daun sirih merah dapat dilihat pada Gambar 3 untuk uji sitotoksisitas daun sirih merah terhadap sel Chang dan Gambar 4 untuk hasil aktivitas antikanker daun sirih merah. Hasil uji % inhibisi etanol 30% daun sirih merah terhadap sel Chang menunjukan nilai yang fluktuatif antara konsentrasi dan % inhibisi sel Chang yang dapat dilihat pada Gambar 3. Hasil % inhibisi tertinggi pada sel Chang terlihat pada konsentrasi 800 ppm dengan % inhibisi 84.30%, hasil ini berbeda nyata dengan konsentrasi yang lainnya. Hasil % inhibisi etanol 30% pada sel HeLa juga menunjukan hasil yang fluktuatif antara konsentrasi dan % inhibisi (Gambar 4). Hasil % inhibisi tertinggi pada sel HeLa terlihat pada konsentrasi 800 ppm dengan inhibisi 38.09%.
Gambar 3 Inhibisi ekstrak etanol 30% pada sel Chang pada variasi konsentrasi (%)
7
Hasil % inhibisi dan beda nyata untuk ekstrak air daun sirih merah dapat dilihat pada Gambar 5 untuk uji sitotoksisitas daun sirih merah terhadap sel Chang dan Gambar 6 untuk hasil aktivitas antikanker daun sirih merah. Hasil uji % inhibisi ekstrak air daun sirih merah terhadap sel Chang menunjukan hasil yang fluktuatif antara konsentrasi dan % inhibisi sel Chang yang dapat dilihat pada Gambar 5. Hasil % inhibisi tertinggi pada sel Chang terlihat pada konsentrasi 800 ppm dengan % inhibisi 39.21%, hasil ini berbeda nyata dengan konsentrasi yang lainnya. Hasil % inhibisi pada sel HeLa juga menunjukan hasil yang fluktuatif antara konsentrasi dan % inhibisi (Gambar 6). Hasil % inhibisi tertinggi pada sel HeLa terlihat pada konsentrasi 800 ppm dengan % inhibisi 45.56%.
Gambar 5 Inhibisi ekstrak air pada sel Chang pada variasi konsentrasi (%)
Gambar 6 Inhibisi ekstrak air pada sel HeLa pada variasi konsentrasi (%)
8 inhibisinya 16.28% dan 42.84% Berdasarkan data tersebut dapat terlihat bahwa baik doxorubicin ataupun cisplatin lebih banyak membunuh sel Chang daripada sel HeLa.
Gambar 7 Inhibisi kontrol positif (%)
Morfologi sel Chang dan sel HeLa diamati dibawah mikroskop (Gambar 1 dan 2). Bentuk sel Chang dan sel HeLa yang tanpa perlakuan tampak melekat pada bagian permukaan tempat tumbuh sel, selain itu sel juga masih berbentuk epithelial-like (CLS 2013). Sedangkan sel Chang dan sel HeLa yang telah mendapat perlakuan dan mengalami inhibisi <50% masih akan tetap sama dengan bentuk sel hidup, namun pada beberapa sel akan terlihat telah mengalami kerusakan. Pada sel yang mengalami inhibisi >50% akan jelas terlihat perubahan morfologinya diantaranya sel sudah tidak lagi terlihat berkoloni dan telah terlepas dari tempat tumbuhnya.
(a) (b) (c)
9
Gambar 9 Sel HeLa (a) inhibisi 0%, (b) inhibisi <50%, (c) inhibisi >50%; 1: sel hidup, 2: sel mati
Pembahasan
Kadar air dan Rendemen Ekstrak Daun Sirih Merah
Daun sirih merah yang digunakan adalah daun sirih merah segar yang telah dicuci, dikeringkan, lalu digiling sehingga diperoleh ukuran 60 mesh. Selanjutnya dilakukan analisis kadar air. Analisis kadar air dilakukan untuk menentukan masa simpan dari serbuk simplisa. Berdasarkan Keputusan Menteri Kesehatan RI nomor 661/MENKES/SK/VII/1994 tentang persyaratan obat tradisional, kadar air simplisia yang diperbolehkan adalah kurang dari 10%. Rerata kadar air simplisia daun sirih merah yang diperoleh sebesar 8.41%. Hasil tersebut menunjukan bahwa simplisia daun sirih merah dapat digunakan sebagai obat tradisional. Kadar air juga digunakan sebagai faktor koreksi dalam perhitungan rendemen ekstrak.
Ekstraksi daun sirih merah dilakukan dengan dua macam pelarut yaitu etanol 30% dan air. Pelarut etanol 30% dan air dipilih karena menurut BPOM (2004) pelarut tersebut aman untuk pangan. Metode ekstraksi yang digunakan adalah refluks. Penggunaan refluks didasari atas kebiasan masyarakat dalam penggunaan daun sirih merah sebagai obat yaitu dengan pemanasan melalui proses perebusan. Berdasarkan penelitian Safithri (2005) rebusan air daun sirih merah mengandung senyawa flavonoid, alkaloid dan tanin. Flavonoid merupakan senyawa aktif yang dapat menghambat pertumbuhan sel kanker (Harlen et al.. 2011). Berdasarkan hasil rendemen tertinggi diperoleh oleh ekstrak etanol 30% yaitu sebesar 31.42%. Hasil ini mengindikasikan bahwa komponen-komponen bioaktif dalam daun sirih merah banyak terdapat pada etanol 30%.
Aktivitas Sitotoksisitas Sel Chang dan Antikanker Sel HeLa Daun Sirih Merah
Aktivitas sitotoksisitas sel Chang dan antikanker sel HeLa menggunakan metode MTT assay. Metode ini dilakukan dalam sebuah microplate (96 sumur) dengan mengukur viabilitas sel berdasarkan prinsip kolorimetri dengan menggunakan microplate reader. Prinsip kerja dari metode MTT assay didasari oleh reduksi garam tetrazolium oleh enzim suksinat dehidrogenase yang berada pada mitokondria sel hidup (Willey 2010). Reaksi tersebut akan menghasilkan kristal formazan yang tidak dapat larut dalam air, oleh karena itu digunakan etanol
(a) (b) (c)
1
10
96% untuk melarutkannya sehingga membentuk warna ungu pada sel yang hidup. Pengukuran inhibisi sel didasari pada pengukuran absorban kristal formazan yang terlarut pada panjang gelombang 595 nm. Absorban yang terukur sebanding dengan jumlah sel yang hidup pada sumur.
Kontrol positif yang digunakan pada penelitian ini yaitu doxorubicin dan cisplastin. Kedua obat tersebut merupakan obat yang digunakan untuk kemoterapi. Kemoterapi merupakan terapi sistematik yang dapat digunakan untuk menghambat pertumbuhan kanker atau untuk membunuh sel sel kanker dengan obat-obat anti kanker yang disebut sitostatika (Sukardja 2000). Kontrol positif diujikan pada sel Chang yang merupakan sel normal dan juga pada sel HeLa yang merupakan sek kanker serviks. Kontrol digunakan sebagai pembanding selektifitas dari simplisia dan ekstrak daun sirih merah terhadap sel HeLa. Hasil pengujian kontrol positif menunjukan bahwa baik doxorubicin ataupun cisplatin lebih banyak menghambat pertumbuhan sel Chang daripada sel HeLa.
Pengujian antikanker pada penelitian ini diawali dengan pengujian sitotoksisitas simplisia ekstrak daun sirih merah terhadap sel normal dengan metode MTT assay. Pengujian sitotoksisitas bertujuan untuk mengetahui keamanan simplisia dan ekstrak daun sirih merah terhadap sel normal. Sel normal yang digunakan pada penelitian ini adalah sel Chang. Sel Chang adalah sel liver manusia dan berbentuk epithelial. Hasil uji sitotoksisitas pada sel chang menunjukan bahwa terdapat hasil yang fluktuatif antara konsentrasi sampel dengan % inhibisi. Hal ini dapat disebabkan oleh perbedaan senyawa yang terdapat terkandung pada setiap konsentrasinya baik pada ekstrak maupun simplisia karena masih banyaknya senyawa yang terdapat dalam simplisia ataupun ekstrak daun sirih merah. Persen inhibisi tertinggi terdapat pada ekstrak etanol 30% dan simplisia daun sirih merah menghambat >80% pertumbuhan populasi sel Chang pada konsentrasi 800 ppm. Nilai ini masih diatas persen inhibisi cisplatin dan doxorubicin 1 ppm. Ekstrak air sendiri pada konsentrasi yang sama hanya menghambat <50% populasi pada sel Chang. Hasil ini menunjukan bahwa ekstrak air lebih aman karena menghambat pertumbuhan sel normal lebih rendah dibandingkan ekstrak etanol 30% dan air pada konsentrasi yang sama.
11 Morfologi sel Chang dan sel HeLa dapat dilihat pada Gambar 8 dan Gambar 9, sel Chang dan sel HeLa yang tanpa perlakuan tampak melekat pada bagian permukaan tempat tumbuh sel, selain itu sel juga masih berbentuk epithelial-like (CLS 2013). Sedangkan sel Chang dan sel HeLa yang telah mendapat perlakuan dan mengalami inhibisi <50% masih akan tetap sama dengan bentuk sel hidup, namun pada beberapa sel akan terlihat telah mengalami kerusakan dan kematian sel. Pada sel yang mengalami inhibisi >50% akan jelas terlihat perubahan morfologinya diantaranya sel sudah tidak lagi terlihat berkoloni dan telah terlepas dari tempat tumbuhnya. Terlepasnya ikatan antar sel dapat disebabkan oleh beberapa faktor diantaranya faktor enzimatis seperti enzim tripsin, protease, colagenase (Freshey 2000).
Mekanisme penghambatan pertumbuhan sel HeLa sendiri tidak diteliti dalam penelitian ini, sehingga belum diketahui secara pasti mekanisme penghambatan simplisia dan ekstrak daun sirih merah terhadap sel HeLa.Sirih merah mengandung senyawa aktif berupa flavonoid, alkaloid, dan tannin ekstrak air dan etanolnya (Safithri 2012). Kandungan flavonoid dan tannin dalam daun sirih merah diduga dapat mengakibatkan efek tosik pada sel HeLa. Flavonoid yang terdapat pada sirih merah diduga dapat menginaktivasi karsinogen, inhibisi angiogenesis, antiproliferasi, menghambat siklus sel, mengembalikan resisten terhadap obat, menginduksi apoptosis dan diferensiasi, juga dapat kombinasi dari mekanisme tersebut (Ren et al. 2003), dan tannin dalam daun sirih merah sendiri dapat meningkatkan p27 yang menyebabkan penghentian siklus sel kemudian terjadi perubahan permeabilitas membran sel HeLa (Nam et al. 2001).
SIMPULAN
Rendemen ekstrak daun sirih merah tertinggi diperoleh oleh ekstrak etanol 30% yaitu sebesar 31.42%. Potensi antikanker terbaik dimiliki oleh Simplisia daun sirih merah yang memiliki aktivitas inhibisi tertinggi yaitu sebesar 85.72% pada sel HeLa dengan konsentrasi 800 ppm. Namun simplisia daun sirih merah juga memiliki aktivitas inhibisi yang cukup tinggi pada sel Chang.
SARAN
Perlu dilakukan pemurnian lebih lanjut untuk mengetahui selektifitas penghambatan daun sirih merah terhadap sel HeLa. Penggunaan simplisia dan ekstrak daun sirih merah sebagai antikanker harus diperhatikan karena pada konsentrasi tertentu daun sirih merah memiliki penghambatan yang lebih tinggi pada sel normal dibandingkan pada sel HeLa.
DAFTAR PUSTAKA
12
[Asian Cancer]. 2012. Kanker Serviks. [internet]. [diunduh pada 2013 Maret 30]. Tersedia pada: http://www.asiancancer.com/indonesian/cancer-topics/cervical-cancer/.
[ATCC] American Type Culture Collection. 2012. HeLa (ATCC-CCL2). [internet]. [diunduh pada 2013 Sept 13]. Tersedia pada: http://www.atcc.org/products/all/CCL-2.aspx.
[CCRC] Cancer Chemoprevention Research Center. 2000. Prosedur Tetap Uji Sitotoksis Metode MTT. Yogyakarta (ID): Fakultas Farmasi, Universitas Gajah Mada.
[CLS] Cells Line Service (DE). Chang-Liver.[internet]. [diunduh pada 2013 Sept 05]. Tersedia pada: http://www. Cells-linesservice.de/content/e3969/e4032/ 4035/index_eng.html.
[Depdag RI].Departemen Perdagangan Republik Indonesia. 2011. Indonesian Herbal : The Traditional Therapy. Jakarta (ID): Depdag RI.
[Depkes RI] Departemen Kesehatan Republik indonesia. 2000. Parameter standar umum ekstrak tumbuhan obat. Jakarta : Depkes RI.
Freshey IR. 2000. Culture of Animal Cells. 4th edition.A manual basic technique. New York: John Wiley and sons inv, pub.
Haarlen KS, Bimlesh K, Sunil P, Prashant T, Manoj S, Pardeep S. 2011. Review of Phytochemistry and Pharmacology of Flavonoids. Internationale Pharmaceutica Sciencia.10: 25-51.
Hsu et al.. 2006.Antioxidant activities of Toona sinensis leaves extracts using different antioxidant models. J. FCT 46: 105-114.
[LCAG] Lonza Cologne AG. 2009. Amaxa® Cell Line Nucleofector® Kit R for HeLa Cells [ATCC® CCL-2™]. Jerman (DE): Lonza Cologne AG.
Li K, Li Q, Zhang T, Han Z, Li J, Liu Z, Zheng F. 2011. Procyanidins from Pinus koraiensis bark inhibits HeLa cell growth by inducing apoptosis andreducing survivin protein expression. Afr. J. Biotechnol. 10(40):7766-7771.
Nam S, Smith DM., Dou QP, 2001, Tannic Acid Potently Inhibits Tumor Cell Proteosome Activity Increase p27 and Bax Expression, and Induces G1 Arrest and Apoptosis, Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention 10: 1083-1088.
[NCI] National Cancer Institute (US). 2012. Cervical Cancer. [internet]. [diunduh
pada 2013 Maret 30]. Tersedia pada:
http://www.cancer.gov/cancertopics/types/cervix.
Ren W, Qiao Z., Wang H, Zhu L, Zhang L, 2003, Flavonoids: Promising AnticancerAgents,Medicinal research Reviews, 23(4): 519- 534.
Safithri M. 2012. Mekanisme Antihiperglikemik Minuman Fungsional Campuran SirihMerah (Piper Crocatum) dan Kayu Manis (Cinnamonum burmannii Blume). [disertasi]. Bogor (ID) : Program Pascasarjana, InstitutPertanian Bogor. Safithri M, Fatma F. 2005. Potency of Piper crocatumdecocotion as an
antihiperglicemia in rat strain Sprague dawley.Hayati J. Biosci 15(1):45-48. Semuel MY. 2008. Aktivitas antioksidasi dan antikanker ekstrak kulit batang
langsat (Lansium domesticum L.) [Tesis]. Bogor (ID): Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
13 [SNI] Standar Nasional Indonesia. 1992. SNI 01-2891-1992. Cara uji makanan
dan minuman. Jakarta (ID): Dewan Standardisasi Nasional.
[WHO] World Health Organization. 2008. Cancer. [internet]. [diunduh pada 2013
Okt 21]. Tersedia pada:
http://www.who.int/gho/ncd/mortality_morbidity/Cancer/en/index.html.
Wicaksono BD, Handoko YA, Arung ET, Kusuma IW, Yulia D, Pancaputra AN, Sandra F. 2009. Antiproliferasi Effect of the Methanol Extract of Pipper crocatumRuiz&Pav Leaves on Human Breast (T47D) Cell In-Vitro. International Journal of Pharm Tech Reaserch 8:345-352.
14
Lampiran 1 Strategi Penelitian
Preparasi daun sirih merah
Penentuan kadar air daun sirih merah
Pembuatan simplisia daun sirih merah
Uji sitotoksisitas simplisia, ekstrak air dan ekstrak etanol
30% daun sirih merah Ekstraksi daun sirih merah dengan ekstrak air dan etanol
30%
Uji sitotoksisitas simplisia, ekstrak air dan ekstrak etanol
30% daun sirih merah
15 Lampiran 2 Kadar air daun sirih merah
N
Bobot cawan kosong
(g)
Bobot sampel
(g)
Bobot cawan + sampel
(g)
Kadar air (%)
Rerata kadar air
(%)
1 19.15 2.04 21.01 8.82
2 19.17 2.00 20.01 8.00 8.41 3 19.11 2.02 20.96 8.42
Contoh perhitungan:
% bobot kering =
=
= 91.18 %
% kadar air = 100% - 91.18 % = 8.82 %
16
Lampiran 3 Rendemen ekstrak daun sirih merah Pelarut Bobot
Simplisia (g)
Kadar air (%)
Bobot ekstrak (g)
Rendemen (%)
Etanol 30% 50.18 8.41 14.51 31.57
Air 50.77 8.41 8.42 17.42
Bobot simplisia koreksi (etanol 30%) = bobot simplisia – kadar air = 50.18 – 8.41%
= 45.96 g
% rendemen =
=
17
Lampiran 4 Aktivitas % inhibisi pada sel Chang Ekstrak
konsentrasi (ppm) Rerata OD sampel % inhibisi
etanol 30 % 6.25 1.103 6.95
18
Lampira 5 Aktivitas % inhibisi pada sel HeLa
Ekstrak Konsentrasi (ppm) Rerata OD sampel % inhibisi
etanol 30 % 6.25 0.44 0.37
Kontrol kontrol negatif 0.45 0.00
19 Lampiran 6 Analisis statistik % inhibisi simplisia dan ekstrak daun sirih merah
20
21
RIWAYAT HIDUP
Dhian Anugerah Purnama Suci terlahir sebagai anak pertama dari Agus Tisna Purwana dan Siti Yenny Chodijah pada tanggal 30 Maret 1991. Penulis menyelesaikan pendidikan jenjang menengah atas di SMA Sejahtera 1 Depok pada tahun 2009. Pada tahun yang sama penulis melanjutkan pendidikan di Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur SNM-PTN (Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri).
