LAPORAN PRATIKUM BIOKIMIA
UJI PEROKSIDA LIPID DALAM CAIRAN BIOLOGIS
KELOMPOK 1 :
Dosen Pembimbing : dr. Sylvia Riannissa Putri, M.Sc
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Lemak dan minyak adalah golongan dari lipida (latin yaitu lipos yang artinya lemak). Lipida larut dalam pelarut nonpolar dan tidak larut dalam air. Sifat kelarutan ini yang membedakan lipida dari golongan senyawa alam penting lain seperti protein dan karbohidrat yang pada umumnya tidak larut dalam pelarut nonpolar.
Lipid atau Lemak adalah senyawa yang merupakan ester dari asam lemak dengan gliserol yang kadang-kadang mengandung gugus lain. Lipid tidak larut dalam air, tetapi larut dalam pelarut organic se[erti eter, aseton, kloroform, dan benzene. Lipid tidak memiliki rumus molekul yang sama, akan tetapi terdiri dari beberapa golongan yang berbeda. Berdasarkan kemiripan struktur kimia yang dimiliki, lipid dibagi menjadi beberapa golongan, yaitu Asam lemak, Lemak dan fosfolipid (Salirawati et al, 2007).
Lemak dan minyak merupakan zat makanan yang penting untuk menjaga kesehatan tubuh manusia. Selain itu lemak dan minyak juga merupakan sumber energi yang lebih efektif dibanding dengan karbohidrat dan protein.
Lemak merupakan bahan padat pada suhu ruang disebabkan kandungannya yang tinggi akan asam lemak jenuh yang tidak memiliki ikatan rangkap, sehingga mempunyai titik lebur yang lebih tinggi, sedangkan minyak merupakan bahan cair pada suhu ruang disebabkan tingginya kandungan asam lemak yang tidak jenuh, yang memiliki satu atau lebih ikatan rangkap diantara atom-atom karbonnya, sehingga mempunyai titik lebur yang rendah (F.G Winarno, 2004).
radikal hidroksil dan radikal peroksil. Radikal bebas secara berkesinambungan dapat dibuat oleh tubuh kita. Setiap radikal bebas yang terbentuk oleh tubuh dapat memulai suatu reaksi berantai yang akan terus berlanjut sampai radikal bebas ini dihilangkan oleh radikal bebas lain dan oleh sistem antioksidan tubuh. Peroksida lipid selanjutnya mengalami dekomposisi menjadi malondialdehid (MDA). MDA produk akhir proses peroksidasi lipid dan yang paling sering digunakan untuk mengukur proses peroksidasi lipid. Adanya malonaldehid dapat diidentifikasi dengan asam tiobarbiturat (TBA) yang akan membentuk kompleks berwarna merah, sehingga dapat ditetapkan secara spektrofotometri. Pengujian MDA dilakukan dengan TBA diukur menggunakan spektrofotometri dengan serapan cahaya pada panjang gelombang 532 nm, juga dapat diukur dengan HPLC (High Performance Liqiud Chromatography) (Halliwell & Gutteridge 1999). Reaksi yang terjadi antara malonaldehid dengan TBA adalah sebagai berikut:
Uji ini penting dilakukan karena selain menetapkan kadar peroksida lipid dalam cairan biologis kita juga dapat mempelajari bagaimana proses peroksidasi lipid dan apa saja yang mempengaruhi proses peroksidasi lipid tersebut.
1.2 Tujuan
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Uji Peroksida Lipid dalam Cairan Biologis
Peroksida lipid merupakan reaksi berantai yang terus menghasilkan pasokan radikal
bebas sehingga terjadi reaksi-reaksi peroksidasi berikutnya. Keseluruhan proses tersebut dapat diganbarkan sebagai berikut:
1. Inisiasi
Xo+ RH → Ro + XH
Pada tahap ini dengan adanya oksigen bebas akan terjadi pengambilan atom H dari PolyUnsaturated Fatty Acid (PUFA) yang terdapat pada membran sel sehingga menyebabkan kerusakan pada sel.
2. Propagasi Ro+ O2→ROOo
ROOo + RH →ROOH + Ro ,danseterusnya
Hasildarireaksiiniakanmenjadiinisiatorbaruuntukbereaksidengan PUFA yang lain sehinggamenghasilkanprodukradikalbaru.
3. Terminasi
ROOo + ROOo → ROOR + O2 ROOo + Ro→ ROOR
Ro + Ro → RR
Tahapinimengkombinasikanduaradikalmenjadisuatuproduk non radikal (Murray dkk., 2000).
Parameter yang digunakan untuk mengevaluasi nilai biologis lemak, antara lain: 1. Bilangan peroksida
2. Bilangan TBA 3. Bilangan iod
4. Kadar asam lemak trans dan asam lemak esensial
7. Pengujian daya hipokolesterolemik in vitro
8. Pengujian kapasitas pengikatan asam empedu atau kolesterol in vitro 9. Kadar asam empedu sekum
2.2 Kadar Malondialdehid (MDA) Sebagai Indikator Peroksidasi Lipid
MDA terbentuk dari peroksidasi lipid (lipid peroxidation) pada membran sel yaitu reaksi radikal bebas (radikal hidroksi) dengan Poly Unsaturated Fatty Acid (PUFA). Reaksi tersebut terjadi secara berantai, akibat akhir dari reaksi rantai tersebut akan terbentuk hidrogen peroksida. Hidrogen peroksida tersebut dapat menyebabkan dekomposisi beberapa produkal dehid yang bersifat toksik terhadap sel dan berbeda panjang rantainya, antara lain MDA, yang merupakan salah satu aldehid utama yang terbentuk (Edyson, 2003).
Pengukuran kinetika peroksidasi lipid secara in vitro dapat dilakukan dengan mengukur berapa banyak oksigen yang dibutuhkan. Ada beberapa metode yang dapat digunakan, salah satunya TBA (Thiobarbituric Acid) reactivity test, yang dapat dilakukan baik secara in vivo maupun in vitro. Tes ini didasarkan pada reaksi kondensasi antara satu molekul MDA dengan dua molekul TBA pada kondisi asam. Hasilnya adalah pigmen berwarna merah yang dapat diukur pada panjang gelombang 532 nm. Jumlah MDA yang terdeteksi menggambarkan banyaknya peroksidasi lipid yang terjadi (Janero, 1990).
MDA merupakan suatu produk akhir peroksidasi lipid, yang biasanya digunakan sebagai biomarker biologis peroksidasi lipid dan menggambarkan derajat stres oksidatif.
Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki sebuah elektron yang tidak berpasangan di orbit luarnya (unpaired electron). Zat ini sangat reaktif, dan struktur yang demikian membuat radikal bebas cenderung “mencuri” atau mengekstraksi satu elektron dari molekul lain di dekatnya untuk melengkapi dan selanjutnya mencetuskan reaksi berantai yang dapat mengakibatkan cedera sel.
dikarenakan sifat radikal bebas memiliki reaktivitas tinggi dan kecenderungan membentuk radikal yang baru sehingga terjadi reaksi rantai (chain reaction) dan akan berhenti apabila dapat diredam oleh antioksidan.
Strategi yang digunakan anti-oksidan dalam meredam oksidan adalah strategi 2 tahap, yaitu:
1. Mencegah terhimpunnya senyawa-senyawa oksidan secara berlebihan 2. Mencegah reaksi rantai berlanjut
Asam lemak jenuh jamak (PUFA) dapat mengalami proses peroksidasi menjadi peroksida lipid yang kemudian mengalami dekomposisi menjadi malondialdehid (MDA). MDA akan membentuk senyawa berwarna merah muda bila direaksikan dengan asamtiobarbiturat (TBA). Jumlah MDA yang terbentuk dapat diketahui berdasarkan kemampuan penyerapan cahaya pada A532 nm. Jumlah MDA yang terbentuk dapat menggambarkan proses peroksidasi lipid.
MDA sebagai salah satu produk lipid peroksidasi yang bersifat toksik terhadap sel merupakan senyawa dialdehid yang memiliki tiga rantai karbon serta memiliki berat molekul (BM) rendah dan dapat diproduksi oleh mekanisme yang berbeda-beda.
karbohidrat kompleks, pentosa, dan heksosa serta berasal dari produk radikal bebas yang dihasilkan oleh iridasi gamma.
2.3 Latihan Fisik
Latihan fisik berlebih untuk mendapatkan hasil maksimal dan risiko minimal pada pelatihan, diperlukan kondisi lingkungan yang memadai dan takaran pelatihan yang tepat untuk setiap individu meliputi FITT, yaitu Frequency, Intencity, Tipe, Time. Frekuensi pelatihan yang dianjurkan tiga hingga lima kali per minggu dengan intensitas kurang lebih 60-85% dari denyut jantung maksimal: 220 - umur (dalam tahun). Latihan didahului pemanasan selama 3-5 menit, dilanjutkan latihan inti 15-60 menit, diakhiri pendinginan 3-5 menit.
Tenaga aerobik maksimum sebagai ukuran kesegaran fisik yang dinyatakan sebagai kemampuan bekerja berat untuk waktu lama dipengaruhi kerja otot secara aerobik seperti:
1). Tipe pelatihan yang meliputi intensitas, durasi, otot yang terlibat, posisi tubuh
2). Aktivitas otot secara aerobik tergantung jenis kelamin dan umur
3). Lingkungan (ketinggian, dingin, panas)
4). Adaptasi
Tenaga aerobik maksimum dikaitkan dengan pengambilan O2 maksimum yang erat terkait umur. Bila pada permulaan kerja langsung dilakukan pembebanan berat, kebutuhan energi hanya dapat dipenuhi dengan mengaktifkan proses anaerob yang menghasilkan asam laktat dan konsentrasinya tetap meninggi selama kerja berlangsung dan dapat dipertahankan terus-menerus selama 30 menit atau lebih. Pada kerja yang sangat berat terjadi defisit penyediaan O2 yang bertambah besar sehingga konsentrasi asam laktat semakin meningkat. Akumulasi asam laktat dalam otot menyebabkan kelelahan otot.
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Alat dan Bahan 1. Urin
2. Larutan asam trikloroasetat ( TCA) 10 %
3. Larutan TBA 0,67 %
4. Tabung reaksi
5. Tabung kupet
6. Pemanas
7. Spektrofotometri
3.2 Cara Kerja
1. Tabel langkah kerja pada urin sebelum berolahraga
Bahan Uji (mL) Blanko (mL)
Urin Akuades TCA 10% 0,25 -0,5 -0,25 0,5 Kocok, sentrifugasi , ambil
supernatan
TBA 0,67 % 0,75 0,75
Masukkan ke penangas 10 menit, dinginkan, baca serapan pada gelombang 532nm
2. Ulangi langkah kerja di atas dengan menggunakan urin setelah berolahraga selama 15 menit
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
Perhitungan Kadar Malondialdehid (M DA )
MDA UJI 1
M = absorbansi
153.000M−1cm−1
= 0,210 153.000
= 1,375×10−6 M
M = mol L ×10
3
= 1,375×10−6×103
= 1,375×10−3
mmol/L
Kadar MDA 1 = 1,375×10−3×18
= 2,475×10−2
mg/dl
MDA UJI 2
M = absorbansi
153.000M−1cm−1
= 153.0000.277
= 1,8104×10−6
M = molL ×103
= 1,8104×10−3
mmol/L Kadar MDA 2 = 1,8104×10−3
×18 = 5,4312×10−2
mg/dl
No Tabung Nilai Absorbansi Kadar MDA (mg/dl)
1 Tabung Blanko I 0,000 0,000 mg/dl
2 Tabung Uji I 0,210 2,475×10−2 mg/dl
3 Tabung Blanko II 0,000 0,000 mg/dl
4 Tabung Uji II 0,277 5,4312×10−2 mg/dl
4.2 Pembahasan
Pada praktikum uji peroksida lipid dalam cairan biologis. Kita mengukur kadar peroksida lipid di dalam cairan biologis, cairan biologis yang digunakan adalah urin. Peroksidasi lipid adalah reaksi penyerangan radikal bebas terhadap asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) yang mengandung sedikitnya tiga ikatan rangkap. Reaksi ini dapat terjadi secara alami di dalam tubuh yang diakibatkan oleh pembentukan radikal bebas secara endogen dari proses metabolisme di dalam tubuh. Peroksidasi lipid diinisiasi oleh radikal bebas seperti radikal anion superoksida, radikal hidroksil dan radikal peroksil. Radikal bebas secara berkesinambungan dapat dibuat oleh tubuh kita. Setiap radikal bebas yang terbentuk oleh tubuh dapat memulai suatu reaksi berantai yang akan terus berlanjut sampai radikal bebas ini dihilangkan oleh radikal bebas lain dan oleh sistem antioksidan tubuh (Halliwell & Gutteridge 1999).
Peroksida lipid selanjutnya mengalami dekomposisi menjadi malondialdehid (MDA). MDA produk akhir proses peroksidasi lipid dan yang paling sering digunakan untuk mengukur proses peroksidasi lipid. Pengujian MDA dilakukan dengan TBA (Asam tiobarbiturat) yaitu akan membentuk senyawa warna merah muda dan diukur serapan pada panjang gelombang 532 nm, juga dapat diukur dengan HPLC (High Performance Liqiud Chromatography).
Pada percobaan kali ini pengukuran kadar malondialdehid (MDA) dilakukan sebelum OP (orang percobaan) berolahraga (UJI 1) dan sesudah OP melakukan olahraga selama 15 menit (UJI 2). MDA merupakan suatu produk akhir peroksidasi lipid, yang biasanya digunakan sebagai biomarker biologis peroksidasi lipid dan menggambarkan derajat stress oksidatif.
untuk melengkapi dan selanjutnya mencetuskan reaksi berantai yang dapat mengakibatkan cedera sel.
Pada uji 1 dan 2 masing-masing ditambahkan 0,25 ml urin sedangkan blanko ditambahkan aquadest selanjutnya pada uji 1,2 dan blanko ditambahkan TCA 10% penambahan TCA bertujuan agar protein yang terkandung dalam urin pada uji 1 dan 2 mengalami presipitasi setelah di sentrifugasi pada 3500 rpm. Presipitasi protein dilakukan karena kandungan protein yang terkandung dalam urin akan mengganggu penetapan kadar peroksida lipid.
Mekanisme TCA 10 % sebagai agen presipitasi yakni ion negatif dari TCA akan bergabung dengan protein yang sedang berada pada kondisi sebagai kation (pH larutan dalam kondisi asam hingga pH isoelektrik protein) hingga membentuk garam protein. Beberapa garam yang dihasilkan tersebut tidak larut dengan demikian metode ini dapat digunakan untuk memisahkan protein dari larutan. Umumnya agen presipitasi akan melarut sedangkan garam protein akan terdekomposisi dengan adanya penambahan basa (membentuk protein yang bermuatan negatif atau anionic protein).
Selanjutnya setelah disentrifugasi pada 3500rpm dan supernatantnya diambil dan tambahkan larutan TBA 0,67% yang telah dipanaskan. Tujuan pemanasan adalah agar TBA segera bereaksi dengan supernatant dan memberikan warna merah yang menandakan bahwa mengandung malondialdehida (MDA). Selanjutnya didihkan selama 10 menit, dan setelah dingin dibaca pada panjang gelombang 532 nm.
Malonaldehida, 4-hidroksinonenal, dan heptanal, merupakan aldehida-aldehida hasil dekomposisi senyawa hidroperoksida, yang bereaksi dengan TBA dan menghasilkan warna merah. Warna merah tersebut menyerap cahaya ultraviolet pada panjang gelombang (λ) 532 nm. Kemampuan TBA bereaksi dengan aldehida atau keton, karena adanya atom karbon nomor 5 (C-5) TBA yang reaktif.
Uji TBA hanya mendeteksi MDA bebas dan mengukur jumlah MDA bebas dalam sistem lipid peroksidasi. Pada uji 1 dan 2 menunjukkan warna bening yang berarti negatif terkandung Malondialdehida. Malondialdehida merupakan proses akhir dari peroksidasi lipid dan blanko tidak menunjukkan perubahan warna dan larutan blanko tetap bening.
Dari hasil percobaan ini dapat disimpulkan bahwa ketika kita melakukan olahraga yang berlebihan akan terjadi reaksi radikal bebas, dimana radikal bebas ini nanti akan cenderung mengekstrasikan satu elektron dari molekul lain yang berada di dekatnya untuk melengkapi (reaksi radikal bebas (radikal hidroksi) dengan Poly Unsaturated Fatty Acid (PUFA)) (Diedrich F, dkk., 2001). Dari reaksi tersebut pada membran sel, MDA terbentuk.
BAB V KESIMPULAN
1. MDA merupakan suatu produk akhir peroksidasi lipid, yang biasanya digunakan sebagai biomarker biologis peroksidasi lipid dan menggambarkan derajat stres oksidatif.
2. Kadar MDA yang terkandung di dalam urin sebelum melakukan olahraga pada uji 1 =
2,475×10−2 mg/dl.
3. Kadar MDA yang terkandung di dalam urin sesudah melakukan olahraga pada uji 2 =
4. Peningkatan kadar MDA setelah melakukan olahraga membuktikan bahwa radikal bebas pada saat olahraga lebih besar dari pada sebelum berolahraga.
5. Radikal bebas bereaksi dengan asam lemak di sel (proses peroksidasi lemak) yang mengakibatkan membran sel rusak dan terbentuk MDA.
6. Penambahan TBA 0,67 % tidak memberikan reaksi apapun pada uji dan blanko.
7. Kemampuan TBA bereaksi dengan aldehida atau keton, karena adanya atom karbon nomor 5 (C-5) TBA yang reaktif.
DAFTAR PUSTAKA
Diedrich F, Renner A, Rath W, Kuhn W, Wieland E. 2001. Lipid hydroperoxides and free radical scavenging enzyme activities in preeclampsia and HELLP (hemolysis, elevated liver enzymes, and low platelet count) syndrome: no evidence for circulating primary products of lipid peroxidation. AmJ Obstet Gynecol: 185:166-72.
Halliwel, B., J.M.C. Gutteridge. 1999. Free radicals in Biology and Medicine. Oxford University Press. New york.
Janero DR. 1990. Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury. USA.
Murray, R.K., Bender, D.A., Botham, K.M., Kennelly, P.J., Rodwell, V.W., Weil, P.A. 2009. Biokimia Harper. The McGraw-Hill Companies, Inc, New York.
Salirawati et al. 2007. Belajar Kimia Menarik. Jakarta: Grasind.
Winarno F.G. 2004. Kimia Panngan dan Gizi. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama.
