PERKEMBANGAN
IN VITRO
SEL BETA PANKREAS TIKUS
(
Rattus norvegicus
) DALAM MEDIUM KULTUR YANG
DIBERI EKSTRAK JINTAN HITAM (
Nigella sativa
)
DENY PUTRA ROMADHON
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Perkembangan In Vitro Sel Beta Pankreas Tikus (Rattus norvegicus) dalam Medium Kultur yang Diberi Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
ABSTRAK
DENY PUTRA ROMADHON. Perkembangan In Vitro Sel Beta Pankreas Tikus (Rattus norvegicus) dalam Medium Kultur yang Diberi Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa). Dibimbing oleh KUSDIANTORO MOHAMAD dan WAHONO ESTHI PRASETYANINGTYAS.
Nigella sativa (jintan hitam) adalah tanaman obat yang banyak digunakan dalam mengobati berbagai penyakit, termasuk diabetes melitus. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis proliferasi dan deferensiasi sel-sel pankreas tikus (Rattus norvegicus) setelah pemberian ekstrak jintan hitam secara in vitro. Sel pankreas diisolasi dari anak tikus usia lima hari dan dikultur secara in vitro dalam medium dulbecco modified eagle medium dengan penambahan ekstrak Nigella sativa (NS) sebagai perlakuan (NS 0% [kontrol], NS 1%, dan NS 10%). Sel diinkubasi dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37 oC selama tujuh hari dan diamati population doubling time (PDT), persentase dan diameter pulau Langerhans, serta ekspresi sel pankreas dalam menghasilkan insulin setelah pewarnaan dithizone. Penelitian menunjukkan pemberian ekstrak jintan hitam (NS) secara nyata (P < 0,05) mampu memperpendek PDT (4.66 ± 0.24, 3.98 ± 0.20, dan 3.66 ± 0.21 hari berturut-turut untuk NS 0%, NS 1%, dan NS 10%), meningkatkan persentase dan diameter pulau Langarhans (6.00 ± 1.80, 14.33 ± 3.01, dan 18.67 ± 1.25% berturut-turut untuk NS 0%, NS 1%, dan NS 10%), meningkatkan diameter pulau Langerhans (66.11 ± 2.09, 101.66 ± 0.83, dan 142.77 ± 1.73 µm berturut-turut untuk NS 0%, NS 1%, dan NS 10%), serta meningkatkan persentase ekspresi sel pankreas dalam menghasilkan insulin (4.67 ± 0.57, 9.67 ± 2.08, dan 17.33 ± 3.21% berturut-turut untuk NS 0%, NS 1%, dan NS 10%). Berdasarkan hasil keseluruhan dapat disimpulkan bahwa pemberian ekstrak jintan hitam mampu meningkatkan proliferasi dan deferensiasi sel-sel pankreas secara in vitro.
ABSTRACT
DENY PUTRA ROMADHON. In Vitro Development of Pancreatic Beta Cells of Rat (Rattus norvegicus) in Culture Medium Supplemented by Black Seed (Nigella sativa) Extract. Supervised by KUSDIANTORO MOHAMAD and WAHONO ESTHI PRASETYANINGTYAS.
Nigella sativa (black seed) is a medicinal plant that is widely used for treating various diseases, including diabetes mellitus. This study examined the proliferation and differentiation of pancreatic cells of rats (Rattus norvegicus) after in vitro culture in medium supplemented by Nigella sativa extracts (NS). Pancreatic cells were isolated from five days old rat (Rattus norvegicus) and cultured in dulbecco modified eagle medium suplemented with Nigella sativa (NS) exstract (NS 0% [control], NS 1%, and NS 10% for treatment groups). The cell were incubated in 5 % CO2 incubator at 37 oC for seven days and observed cell population doubling time (PDT), percentage and diameter of Langerhans islets, and percentage of expression the cell producing insulin in Langerhans islets after dithizone staining. The result showed that NS significantly (p < 0.05) decreased the population doubling time (4.66 ± 0.24, 3.98 ± 0.20, and 3.66 ± 0.21 days for NS 0%, NS 1%, and NS 10%, respectively), increased the percentage of Langerhans islets (6.00 ± 1.80, 14.33 ± 3.01, and 18.67 ± 1.25% for NS 0%, NS 1%, and NS 10%, respectively), increased the diameter of Langerhans islets (66.11 ± 2.09, 101.66 ± 0.83, and 142.77 ± 1.73 µm for NS 0%, NS 1%, and NS 10%, respectively), and increased the percentage of expression the cell producing insulin (4.67 ± 0.57, 9.67 ± 2.08, and 17.33 ± 3.21% for NS 0%, NS 1%, and NS 10%, respectively). It was concluded that the supplementation of NS in culture medium can improve the proliferation and differentiation of pancreatic cells in vitro.
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan
pada
Fakultas Kedokteran Hewan
PERKEMBANGAN
IN VITRO
SEL BETA PANKREAS TIKUS
(
Rattus norvegicus
) DALAM MEDIUM KULTUR YANG
DIBERI EKSTRAK JINTAN HITAM (
Nigella sativa
)
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2014
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2014 ini ialah Perkembangan In Vitro Sel Beta Pankreas Tikus (Rattus norvegicus) dalam Medium Kultur yang Diberi Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Drh Kusdiantoro Mohamad, MSi PAVet dan Drh Wahono Esthi Prasetyanigtyas, MSi PAVet selaku pembimbing, serta Dr Drh Ita Djuwita, MPhil PAVet (alm) yang telah merancang, membimbing, dan memberikan bantuan dana penelitian. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Wahyudin, AMd selaku staf dan teknisi Laboratorium Embriologi Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor, Devi Syafrianti, SPd, MSi, dan Ria Ceriana, SSi, MSi, serta teman-teman sesama penelitian (Dwi Budiono, Juita Siregar, Fitri Susana, Siti Khadijah, Putri Ekandini dan Fatimah) atas bantuan dan kerjasamanya selama penelitian berlangsung. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, dan seluruh keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ix
DAFTAR GAMBAR ix
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Tujuan Penelitian 1
Perumusan Masalah 2
Manfaat Penelitian 2
TINJAUAN PUSTAKA Jintan Hitam (Nigella sativa) 2
Pankreas 3
Kultur In Vitro 3
METODE Waktu dan Tempat 4
Bahan 4
Alat 4
Tahapan dan Prosedur Kerja 4
Evaluasi Hasil Kultur 6
Rancangan Percobaan dan Analisis Data 7
HASIL DAN PEMBAHASAN 8
SIMPULAN DAN SARAN 11
Simpulan 11
Saran 12
DAFTAR PUSTAKA 12
DAFTAR TABEL
1. Population doubling time (PDT) sel pankreas pada kultur in vitro yang diberi ekstrak Nigella sativa 8 2. Persentase pulau Langerhans terhadap sel pankreas pada kultur in vitro
yang diberi ekstrak Nigella sativa
9
3. Diameter pulau Langerhans yang tumbuh dalam medium yang diberiekstrak Nigella sativa 9 4. Persentase pulau Langerhans dengan sel-sel beta pankreas yang
menunjukkan ekspresi terhadap pewarnaan DTZ dalam medium yang diberi ekstrak Nigella sativa 11
DAFTAR GAMBAR
1. Alur pengamatan dan penghitungan pulau Langerhans dan sel-sel
pankreas 7 2. Pengukuran diameter pulau Langerhans 7 3. Populasi sel-sel pankreas pada H-0 dan H-7 kultur in vitro 8 4. Pulau Langerhans dengan sel-sel beta pankreas yang menunjukkan
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Penyakit diabetes melitus (DM) merupakan penyakit yang ditemukan di seluruh dunia, termasuk Indonesia. Penelitian epidemiologis oleh Perkumpulan Endokrinologi Indonesia (PERKENI) menyebutkan beberapa wilayah di Indonesia memiliki prevalensi penyakit DM yang terus meningkat setiap tahun. Berdasarkan pola pertambahan penduduk, diperkirakan pada tahun 2020 dari 178 juta penduduk berusia di atas 20 tahun dengan asumsi prevalensi DM sebesar 4 % akan didapatkan 7 juta pasien DM (PERKENI 2011).
Hormon insulin merupakan hormon penting yang dihasilkan oleh sel beta pankreas dan berfungsi mengatur metabolisme glukosa dengan mengubah glukosa dalam darah menjadi glikogen. Apabila terjadi kerusakan pada sel-sel beta pankreas, maka akan terjadi ketidak-seimbangan kadar hormon insulin dan proses metabolisme glukosa. Hal ini dapat menimbulkan penyakit degeneratif DM, terutama DM tipe 1 (ADA 2013).
Terapi DM tipe 1 karena kerusakan sel beta dapat dilakukan dengan pemberian insulin harian atau transplantasi organ pankreas. Meskipun demikian, jumlah donor organ masih sangat sedikit dan mahal, serta efek samping dari imunosupresan yang digunakan untuk mencegah reaksi imunologik saat transplantasi masih menjadi kendala dalam pengobatan DM dengan teknik transplantasi (Setiawan 2006). Alternatif lain yang menjadi pilihan dalam pengobatan DM tipe 1 adalah dengan menggunakan obat herbal, diantaranya adalah Nigella sativa. Terapi lain melalui penerapan bioteknologi untuk menggantikan sel pankreas yang rusak dapat dilakukan dengan teknik kultur in vitro dan transplantasi sel-sel hasil kultur.
Nigella sativa diketahui mempunyai banyak efek farmakologi, salah satunya adalah antidiabetik (efek hipoglikemik) (Yulianti dan Junaedi 2006). Nigella sativa mengandung thymoquinone yang dapat memperbaiki kerusakan sel beta pankreas sehingga mampu meningkatkan sekresi insulin (Kanter 2003). Selain itu, Nigella sativa juga memiliki kandungan seng yang cukup tinggi (Yulianti dan Junaedi 2006). Seng (Zn) berfungsi sebagai bagian dari enzim atau sebagai kofaktor pada aktivitas lebih dari dua ratus jenis enzim (Almatsier 2001). Menurut El-Dakhakhny et al. (2002) Nigella sativa mampu memperbaiki metabolisme glukosa pada tikus model diabetes in vivo. Selain itu, Nigella sativa mampu meningkatkan proliferasi dan regenerasi sel pankreas yang rusak secara in vivo, dengan demikian insulin dalam darah dapat meningkat (Kanter et al. 2003). Namun belum ada pembuktian secara empiris Nigella sativa berperan dalam menginduksi proliferasi (pertumbuhan) serta diferensiasi (perkembangan) sel pankreas secara in vitro.
Tujuan Penelitian
2
Perumusan Masalah
Nigella sativa telah banyak dikonsumsi masyarakat karena dipercaya memilki berbagai khasiat, misalnya untuk mangatasi penyakit DM tipe 1. Nigella sativa diketahui mampu meningkatkan populasi sel pankreas serta sekresi insulin secara in vivo, namun belum ada data empiris yang membuktikan bahwa Nigella sativa berperan dalam pertumbuhan dan perkembangan sel-sel ß pankreas secara in vitro. Sistem kultur in vitro dapat digunakan untuk membuktikan peranan Nigella sativa dalam menginduksi proses proliferasi (pertumbuhan) dan diferensiasi (perkembangan) sel-sel ß pankreas.
Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah memberikan data ilmiah mengenai potensi ekstrak Nigella sativa dalam meningkatkan proliferasi (pertumbuhan) dan diferensiasi (perkembangan) sel-sel pankreas tikus secara in vitro berdasarkan data-data empiris, khususnya untuk pengobatan diabetes melitus tipe 1.
TINJAUAN PUSTAKA
Jintan Hitam (Nigella sativa)
Nama atau sebutan bagi tanaman jintan hitam berbeda-beda di setiap tempat. Di negara-negara barat tanaman ini sering disebut dengan black caraway, black seed, dan coriander seeds. Di negara-negara Arab, tanaman ini dikenal dengan nama habbatussauda (hitam) atau habbatuk baraka (yang diberkati). Semantara di Persia tanaman ini dikenal dengan shonaiz, di Turki dikenal dengan cotu siyah, dan dalam bahasa Hindi dikenal dengan nama kalounji. Di Indonesia dan Malaysia dikenal dengan nama jintan hitam (Yulianti dan Junaedi 2006).
3
Nigella sativa diketahui mempunyai banyak efek farmakologi, salah satunya adalah anti-diabetes (efek hipoglikemik) (Yulianti dan Junaedi 2006). Nigella sativa diketahui mengandung thymoquinone yang dapat memperbaiki kerusakan sel beta pankreas sehingga mampu meningkatkan sekresi insulin (Kanter 2003). Selain itu, Nigella sativa juga memiliki kandungan seng yang cukup tinggi (Yulianti dan Junaedi 2006). Seng (Zn) berfungsi sebagai bagian dari enzim atau sebagai kofaktor pada aktivitas lebih dari dua ratus jenis enzim (Almatsier 2001).
Pankreas
Pankreas merupakan kelenjar endokrin yang memiliki fungsi sebagai penghasil hormon insulin dalam tubuh. Pankreas terdiri dari sel-sel yang tersusun mengelompok atau yang disebut pulau Langerhans. Pulau Langerhans tersusun atas berbagai macam sel-sel endokrin membentuk bingkai yang saling beranastomose, yaitu sel alfa (α, menghasilkan glukagon), sel beta ( , menghasilkan insulin), sel-epsilon (δ, menghasilkan somatostatin), dan sel gamma ( , menghasilkan polipeptida pankreas) (Criscimanna et al. 2011).Pankreas juga memiliki sel-sel duktus yaitu sel-sel progenitor yang berperan dalam neogenesis (proliferasi dan deferensiasi) (Bonner et al. 1993, Rosenberg 1998). Pada rodensia (mencit dan tikus), pulau-pulau Langerhans memiliki morfologi berupa kumpulan sel berbentuk bola (spheroid), sel terletak di tengah dan dikelilingi oleh sel-sel α, serta sel-sel tersebar di antara sel dan α (Ramiya et al. 2000).
Pankreas merupakan salah satu organ yang memiliki kemampuan terbatas dalam melakukan proliferasi (Soria et al. 2001), namun secara in vitro sel-sel pankreas masih memiliki kemampuan dalam melakukan proliferasi dan diferensiasi (Demeterco et al. 2000).
Kultur In Vitro
Kultur sel didefinisikan sebagai teknik untuk menumbuhkan dan memelihara sel-sel dari organisme multiseluler di luar tubuh dengan mengunakan wadah khusus yang ditempatkan pada kondisi lingkungan menyerupai kondisi tubuh, seperti: temperatur, kelembaban, nutrisi, serta kondisi bebas kontaminasi. Tujuan dilakukan kultur sel adalah untuk digunakan dalam riset dan terapi medis (Halim et al. 2010). Menurut Butler (2004) riset kultur sel asal hewan memiliki beberapa tujuan, antara lain: (1) mengetahui fisiologi normal atau proses biokimia yang terjadi dalam sel, misalnya metabolisme sel; (2) menguji pengaruh senyawa kimiawi ataupun obat pada tipe sel yang spesifik, misalnya senyawa metabolit, hormon, senyawa toksik, senyawa mutagenik, dan lain-lain; (3) mempelajari kombinasi variasi tipe sel sehingga menghasilkan jaringan buatan; serta (4) mensintesis produk biologis pada kultur sel skala besar.
4
utama, antara lain: medium, serum, antibiotik, dan faktor pertumbuhan. Medium berperan penting untuk menciptakan suatu kondisi lingkungan yang memiliki pH, tekanan osmotik, dan faktor pendukung lainnya yang serupa untuk pertumbuhan dan perkembangan sel. Serum berperan penting sebagai sumber nutrisi sel. Antibiotik diperlukan untuk menghindari kontaminasi mikroorganisme yang dapat mengganggu pertumbuhan dan bersifat patogen jika diperuntukkan untuk terapi. Untuk menginduksi pertumbuhan, mempertahankan pluripotensi, atau merangsang terjadinya diferensiasi, maka faktor pertumbuhan perlu ditambahkan dalam medium kultur (Halim et al. 2010).
METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari sampai dengan April 2014 di Laboratorium Embriologi, Bagian Anatomi, Histologi, dan Embriologi, Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan antara lain tikus (Rattus norvegicus) strain Sprague Dawley (SD) umur 5 hari, serbuk jintan hitam (Nigella sativa), medium kultur dulbecco modified eagle medium suplemented (DMEM) yang dimodifikasi dengan penambahan asam amino non-esensial (NEAA Sigma, USA), new born calf serum (NBCS Sigma, USA), NaHCO3 (Sigma, USA), insulin transferrin selenium (ITS Sigma, USA), dithizone (DTZ Sigma, USA), dimetil sulfoxide (DMSO Sigma, USA), alkohol 70%, Dubelcco Phosphate Buffered Saline (DPBS Sigma, USA), dan gentamycin.
Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain gunting bedah, pinset, mortar beserta penggerus, timbangan digital, pipet mikro, inkubator, laminar flow (clean bench), mikroskop Olympus Ix70-S8F2 yang dilengkapi dengan kamera, cawan petri, gelas obyek, gelas penutup, membran filter 0,22 µm, spoit 1 mL dan 10 mL, gelas ukur, gelas piala, haemositometer Improved Neubeuer, alat penghitung, centrifuge rotor fixed, hot plate, dan vortex.
Tahapan dan Prosedur Kerja
Persiapan ekstrak Nigella sativa
5
perlakuan Nigella sativa 1% dan 10%. Selanjutnya larutan ekstrak dihomogenkan dengan menggunakan pipet dan dibiarkan sampai hingga dingin. Setelah homogen dan dingin, larutan difilter menggunakan membran filter berpori-pori 0.22 µm. Larutan ekstrak Nigella sativa disimpan pada suhu -4 °C dan siap untuk digunakan.
Persiapan cawan petri
Cawan petri disertai cover glass steril direndam dengan gelatin 0.1% sebanyak 1 mL dan didiamkan selama satu jam. Setelah satu jam, gelatin dibuang dengan menggunakan mikropipet, selanjutnya cawan petri dibilas menggunakan Dulbecco’s phosphate saline buffered (DPBS) yang telah dimodifikasi dengan penambahan gentamycin 50 µg/mL. Setelah dibilas, cawan petri didiamkan selama 5 menit hingga kering.
Masing-masing cawan petri yang telah kering dimasukkan 2 mL medium kultur dulbecco modified eagle medium (DMEM) yang dimodifikasi dengan penambahan NaHCO3 1%, non-essential amino acids (NEAA) 1%, gentamycin dimodifikasi. Tikus dikorbankan dengan cara dianastesi dan kemudian didislokasi leher (cervicalis dislocation). Pankreas yang diisolasi dicuci dalam larutan DPBS yang mengandung gentamisin 50 µg/mL dan NCBS 0.1% (mPBS) sambil dibersihkan dari selaput dan pembuluh darah. Setelah bersih, jaringan dipotong-potong kurang dari 2 mm secara manual dengan gunting steril, kemudian didisosiasi lebih lanjut menggunakan enzim kolagenase 0.1% sebanyak 50 µL/mL mPBS dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 15-30 menit. Tujuan pemotongan tersebut adalah meningkatkan luas permukaan sehingga kerja enzim kolagenase efektif mendisosiasi dengan mengurangi jaringan ikat yang mengelilingi pulau Langerhans (Ru et al. 2004). Selanjutnya suspensi sel pankreas dicuci dengan sentrifugasi selama 10 menit (kecepatan 200 g) dalam medium DPBS dan DMEM, masing-masing 3 dan 2 kali pencucian. Suspensi sel-sel pankreas yang telah dicuci ditaman dalam cawan petri yang telah disiapkan, dengan konsentrasi akhir 5 x 104 sel/mL.
6
Pewarnaan sel beta pankreas yang mensekresikan insulin
Pewarnaan sel beta pankreas dilakukan pada hari ketujuh kultur, yaitu setelah dilakukan evaluasi persentase pulau Langerhans dan pengambilan gambar untuk evaluasi diameter pulau Langerhans. Pewarnaan menggunakan pewarna dithizone (DTZ) berdasarkan metode Shiroi et al. (2002).
Stok DTZ dibuat dengan melarutkan 50 mg DTZ ke dalam 5 mL dimethyl sulfoxide. Larutan pewarnaan siap pakai dibuat dengan melarutkan 1 µL larutan stok dalam 1 mL DPBS yang mengandung 1.25 µL/mL gentamycin dan difilter menggunakan membran filter dengan ukuran pori-pori 0.22 µm.
Sel kultur yang akan diwarnai dicuci terlebih dahulu dalam larutan mDPBS. Selanjutnya dilakukan proses pewarnaan dengan cara menginkubasi sel dalam larutan DTZ selama 15 menit pada suhu 37 °C. Setelah proses inkubasi selama 15 menit, sel dicuci dengan menggunakan larutan DPBS dan siap untuk diamati menggunakan mikroskop. Sel beta pankreas dalam pulau Langerhans yang mensekresikan insulin akan menunjukkan warna merah, sedangkan sel beta yang tidak mensekresikan insulin tidak berwarna setelah dilakukan pewarnaan (Shiroi et al. 2002).
Evaluasi Hasil Kultur
Tingkat proliferasi sel berdasarkan population doubling time
Population doubling time (PDT) adalah waktu yang diperlukan oleh populasi sel untuk menjadi jumlah dua kali dari jumlah sel semula (Davis 2011). Tingkat proliferasi dievaluasi dengan menghitung jumlah sel pada saat akan diinkubasi (H0) dan setelah kultur selama tujuh hari (H7). Pada hari ketujuh setelah pewarnaan DTZ, medium dibuang lalu sel hasil kultur dicuci dengan DPBS kemudian dimasukkan larutan enzim kolagenase 0.1% sebanyak 50 µL/mL DPBS dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 15-30 menit. Selain dilakukan disosiasi menggunakan enzim, disosiasi dilakukan secara manual dengan menggunakan mikropipet. Sel yang telah terdisosiasi disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 200 g. Selanjutnya sel dihitung menggunakan hemositometer Improved Neubeuer. Perhitungan PDT dilakukan menurut Davis (2011) dengan rumus sebagai berikut:
Persentase pulau Langarhans
Penghitungan persentase pulau Langerhans terhadap sel-sel pankreas dilakukan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 40 x 10 dengan alur pengamatan seperti pada Gambar 1. Penghitungan dilakukan terhadap 100 sel-sel pankreas yang diamati dan dilakukan sebanyak dua kali pengulangan.
PDT= 1
7
Gambar 1 Alur pengamatan dan penghitungan pulau Langerhans dan sel-sel pankreas.
Pengukuran diameter pulau Langerhans
Diameter pulau Langerhans dihitung dengan menggunakan mikrometer yang diamati pada hasil foto mikroskop pada perbesaran 40 x 10. Penghitungan dilakukan pada enam pulau Langerhans pada tiap perlakuan.
Gambar 2 Pengukuran diameter pulau Langerhans. A. Pengukuran diameter pulau Langerhans yang simetris; B. Pengukuran diameter pulau Langerhans yang tidak simetris, penjumlahan diameter terpanjang dan terpendek dibagi dua. Bar = 50 µm.
Penghitungan persentase ekspresi sel beta penghasil insulin
Penghitungan persentase ekspresi sel beta pada pulau Langerhans yang menghasilkan insulin dengan pewarnaan DTZ dan diamati dengan mikroskop pada perbesaran 40 x 10. Penghitungan dilakukan terhadap 100 agregat sel-sel pankreas dan/atau pulau Langerhans pada tiap perlakuan.
Rancangan Percobaan dan Analisis Data
8
HASIL DAN PEMBAHASAN
Population doubling time (PDT) adalah waktu yang diperlukan oleh populasi sel untuk menjadi jumlah dua kali dari jumlah sel semula. Semakin kecil nilai PDT, maka semakin cepat proliferasi sel yang terjadi (Davis 2011). Hasil PDT kultur sel pankreas yang diberi perlakuan ekstrak Nigella sativa dapat dilihat pada Tabel 1 dan Gambar 3.
Tabel 1 Population doubling time (PDT) sel pankreas pada kultur in vitro yang diberi ekstrak Nigella sativa
* Penghitungan berdasarkan metode Davis (2011).
Ekstrak Nigella sativa (NS); Kontrol (dMEM), NS 1% (2 mL dMEM + 100 µL NS 0.01 g/mL); NS 10% (2 mL dMEM + 100 µL NS 0.1 g/mL).
Huruf superskrip yang berbeda pada baris yang sama berbeda nyata pada taraf uji 5% (p < 0.05).
Gambar 3 Populasi sel-sel pankreas pada H-0 dan H-7 kultur in vitro. (A,B) NS 0% (kontrol), (C,D) NS 1%, dan (E,F) NS 10%. (A,C,E) kultur pankreas pada H-0, (B,D,F) kultur pankreas pada H-7. Tanda panah solid = sel pankreas, tanda panah kosong = pulau Langerhans. Bar = 20 µm.
Ulangan Population doubling time (PDT)*
Kontrol NS 1 % NS 10 %
1 4.47 3.96 3.47
2 4.58 3.79 3.61
3 4.93 4.18 3.88
9
Nilai PDT pada kontrol adalah 4.66 ± 0.24 hari, sedangkan nilai PDT pada pemberian ekstrak Nigella sativa 1% dan 10% masing-masing secara berturut-turut adalah 3.98 ± 0.20 dan 3.66 ± 0.21 hari. Pemberian ekstrak Nigella sativa pada kultur sel pankreas dengan konsentrasi 1% dan 10% mampu memperkecil nilai PDT jika dibandingkan dengan kontrol (p < 0.05). Nilai PDT yang semakin kecil menandakan pemberian ekstrak Nigella sativa dapat meningkatkan proliferasi pada sel pankreas yang dikultur secara in vitro.
Persentase pulau Langerhans yang terbentuk menunjukkan peningkatan pada setiap peningkatan konsentrasi Nigella sativa jika dibandingkan dengan kontrol (p < 0.05). Hasil persentase pulau Langerhans dapat dilihat pada Tabel 2. Persentase pulau Langerhans yang terbentuk pada kontrol adalah 6.00 ± 1.80%, sedangkan persentase pulau Langerhans pada pemberian ekstrak Nigella sativa 1% dan 10% masing-masing adalah 14.33 ± 3.01% dan 18.67 ± 1.25%.
Diameter pulau Langerhans setelah pemberian Nigella sativa pada kultur sel-sel pankreas dengan konsentrasi 1% dan 10% mampu meningkatkan diameter pulau Langerhans jika dibandingkan dengan kontrol (p < 0.05). Hasil evaluasi diameter pulau Langerhans dapat dilihat pada Tabel 3. Diameter pulau Langerhans pada kontrol adalah 66.11 ± 2.09 µm sedangkan diameter pulau Langerhans pada pemberian ekstrak Nigella sativa 1% dan 10% masing-masing adalah sebagai berikut 101.66 ± 0.83 µm dan 142.77 ± 1.73µm.
Tabel 2 Persentase pulau Langerhans terhadap sel pankreas pada kultur in vitro yang diberi ekstrak Nigella sativa
Ekstrak Nigella sativa (NS); Kontrol (dMEM), NS 1% (2 mL dMEM + 100 µL NS 0.01 g/mL);
NS 10% (2 mL dMEM + 100 µL NS 0.1 g/mL).
Huruf superskrip yang berbeda pada baris yang sama berbeda nyata pada taraf uji 5% (p < 0.05).
Tabel 3 Diameter pulau Langerhans yang tumbuh dalam medium yang diberi ekstrak Nigella sativa
Ekstrak Nigella sativa (NS); Kontrol (dMEM), NS 1% (2 mL dMEM + 100 µL NS 0.01 g/mL);
NS 10% (2 mL dMEM + 100 µL NS 0.1 g/mL).
Huruf superskrip yang berbeda pada baris yang sama berbeda nyata pada taraf uji 5% (p < 0.05). Ulangan Pulau Langerhans terhadap Sel Pankreas (%)
Kontrol NS 1% NS 10%
1 5.5 14.0 17.5
2 4.5 11.5 18.5
3 8.0 17.5 20.0
Rata-rata 6.00 ± 1.80a 14.33 ± 3.01b 18.67 ± 1.25c
Ulangan Diameter Pulau Langerhans (µm)
Kontrol NS 1% NS 10%
1 68.33 100.83 140.83
2 65.83 102.50 143.33
3 64.16 101.66 144.16
10
Berdasarkan nilai PDT, persentase, dan diameter pulau Langerhans, ekstrak Nigella sativa mampu meningkatkan proliferasi dan perkembangan sel-sel pankreas secara in vitro. Menurut Kanter et al. (2003) Nigella sativa mampu meningkatkan proliferasi dan regenerasi sel pankreas yang rusak secara in vivo, dengan demikian insulin dalam darah dapat meningkat. Beberapa zat aktif yang terkandung dalam jintan hitam adalah thymoquinone dan seng (Zn). Thymoquinone mempunyai efek antidiabetik yang mampu menurunkan kadar glukosa darah (El-Dakhakhny et al. 2002). Thymoquinone merupakan komponen utama dalam minyak Nigella sativa yaitu hampir 50%. Zat ini diketahui dapat memperbaiki kerusakan sel beta pankreas sehingga mampu meningkatkan sekresi insulin (Kanter et al. 2003). Seng (Zn) adalah kelompok zat gizi mikro yang dibutuhkan dalam jumlah yang sangat kecil untuk memelihara kehidupan optimal. Seng dalam tubuh berperan dalam berbagai aktifitas enzim, pembelahan dan pertumbuhan, diferensiasi sel, serta stabilitas fungsi berbagai jaringan tubuh (Hidayat 1999, Paik 2001).
Hasil persentase pewarnaan dithizone (DTZ) pada kultur primer sel-sel pankreas secara in vitro menunjukkan tidak seluruh pulau Langerhans yang terbentuk dalam kultur mampu terwarnai dengan pewarnaan DTZ. Hal ini disebabkan tidak semua sel pankreas yang terdapat pada pulau Langerhans aktif menghasilkan insulin. Gambar ekspresi sel pankreas terhadap pewarnaan DTZ pada kultur sel-sel pankreas dapat dilihat pada Gambar 4, sedangkan hasil persentase ekspresi sel pankreas terhadap pewarnaan DTZ pada kultur sel pankreas yang diberi perlakuan ekstrak Nigella sativa dapat dilihat pada Tabel 4.
Gambar 4 Pulau Langerhans dengan sel-sel beta pankreas yang menunjukkan ekspresi menghasilkan insulin. A. Pulau Langerhans dengan sel beta negatif ekspresi insulin, B. Pulau Langerhans dengan sel beta positif ekspresi insulin. Pewarnaan dithizone. Bar = 30 µm
11
Tabel 4 Persentase pulau Langerhans dengan sel-sel beta pankreas yang menunjukkan ekspresi terhadap pewarnaan DTZ dalam medium yang diberi ekstrak Nigella sativa
Huruf superskrip yang berbeda pada baris yang sama berbeda nyata pada taraf uji 5% (p < 0.05).
Diferensiasi menggambarkan struktur dan fungsi sel dan jaringan yang berkembang menjadi karakteristik sel yang lebih khusus. Diferensiasi terjadi apabila ada interaksi antar berbagai sel (McGeady et al. 2006). Sel yang mengalami diferensiasi terus berkembang dan terdiferensiasi menjadi jaringan, organ, dan sistem. Pewarnaan insulin dalam penelitian ini dapat menggambarkan proses terjadinya diferensiasi sel pankreas dalam kultur in vitro.
Dithizone (DTZ) adalah pewarnaan khusus sel pankreas dengan cara mengikat seng (zinc-binding subtance) pada insulin, sehingga menghasilkan warna merah muda hingga merah tua pada sel-sel yang mengandung seng (Shiroi et al. β00β). Sel pankreas yang terdapat pada pulau Langerhans merupakan sel yang mengandung seng. Seng dalam sel pankreas berperan penting dalam mengikat insulin sehingga membentuk dimer maupun heksamer yang memudahkan penyimpanan insulin dalam secretory vesicles sel pankreas (Chausmer 1998, Garnuszek et al. 2000).
Tingginya persentase ekspresi insulin oleh sel beta pada pulau Langerhans yang diberi perlakuan dipengaruhi oleh adanya senyawa-senyawa kimia yang dikandung Nigella sativa. Salah satu kandungan nutrisi yang cukup tinggi dikandung Nigella sativa adalah seng. Seng berfungsi sebagai bagian dari enzim atau sebagai kofaktor pada aktivitas lebih dari dua ratu jenis enzim (Almatsier 2001). Seng berperan dalam sintesis, penyimpanan, dan sekresi hormon insulin dan glukagon pada pankreas, namun tidak berperan secara langsung terhadap aktivitas insulin. Selain itu, seng juga berperan dalam proses diferensiasi sel (Paik 2001).
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
12
Saran
Perlu dilakukan analisa fraksi ekstrak jintan hitam (Nigella sativa) yang memiliki potensi meningkatkan perkembangan sel beta pankreas setelah kultur in vitro, analisa kandungan insulin pada conditional medium yang dihasilkan dari kultur in vitro, serta analisa mengenai toksisitas ekstrak jintan hitam (Nigella sativa) secara in vitro dan in vivo.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini merupakan bagian dan didanai dari penelitian Hibah Kompetensi DIKTI a.n Dr Drh Ita Djuwita, MPhil PAVet (alm) dengan kontrak nomor: 035/SP2H/PL/Dit.Litabmas/V/2013.
DAFTAR PUSTAKA
[ADA] American Diabetes Association. 2013. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care. 36 Suplemen 1: S67-S74.
[PERKENI] Perkumpulan Endokrinologi Indonesia. 2011. Konsensus Pengelolaan dan Pencegahan Diabetes Melitus Tipe 2 di Indonesia 2011. [tempat tidak diketahui].
Almatsier S. 2001. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta (ID): Gramedia Pustaka Utama.
Bonner WS, Baxter LA, Schuppin GT. 1993. A second pathway for regeneration of adult exocrine and endocrine pancreas. A possible recapitulation of embryonic development. Diabetes. 42(12):1715-1720.
Butler M. 2004. Animal Cell Culture and Technology. Cornwall (UK): Bios Scientific Publishers.
Chausmer AB. 1998. Zinc, insulin and diabetes. J Am Coll Nutr. 17(2):109-115. Criscimanna A, Bertera S, Esni F, Trucco M, Bottino R. 2011. The enigma of
-cell regeneration in the adult pancreas: self-renewal versus neogenesis, type 1 diabetes complications. Gastroenterology. 141:1451-1462.
Davis JM. 2011. Animal Cell Culture Essential Methods. Chichester (UK): John Wiley and Sons Ltd.
Demeterco C, Beattie GM, Dib AS, Lopes AD, Hayek A. 2000. A role for activin A and beta cellulin in human fetal pancreatic cell differentiation and growth. J Clin Endocrinol Metab. 85(10): 3892-3897.
El-Dakhakhny M, Mady N, Lembert N, Ammon HP. 2002. The hypoglycemic effect of Nigella sativa oil is mediated by extra pancreatic actions. Planta Med. 68(5):465-466.
13
Hidayat A. 1999. Seng (zinc): Esensial bagi kesehatan. J Kedokter Trisakti. 18(1):19-26.
Halim D, Murti H, Sandra F, Boediono A, Djuwantono T, Setiawan B. 2010. Stem Cell: Dasar Teori & Aplikasi Klinis. Jakarta (ID): Penerbit Erlangga.
Johansson M, Matsson G, Anderson A, Jansson L, Carlsson P. 2006. Islet endothelial cell and pancreatic cell proliferation: studies in vitro and during pregnancy in adult rat. Endocrinology. 147(5):2315-2324.
Kanter M, Meral I, Yener H, Ozbek H, Demir H. 2003. Partial regeneration/proliferation of the beta-cell in islet of Langerhans by Nigella sativa in streptozotocin-induced diabetic rats. Tohoku J Exp Med. 201(4):213-219.
Paik IK. 2001. Application of chelated minerals in animalproduction. Asian-Aust J Anim Sci. 14:191-198.
Ramiya VK, Maraist M, Arfors KE, Schatz DA, Peck AB, Cornelius JG. 2000. Reversal of insulin-dependent diabetes using islets generated in vitro from pancreatic stem cells. Nat Med. 6(3):278-282.
Rosenberg L. 1998. Induction of islet cell neogenesis in the adult pancreas: the partial duct obstruction model. Microsc Res Tech. 43(4):337-346.
Ru AH, Peng FR, Xia L, Xiao LY, Hai PQ, Ying DZ. 2005. Isolation, cultivation and identification of pancreatic stem/progenitor cells in rabbit. J Agricul Biotechnol. 3(2):89-94.
Setiawan B. 2006. Aplikasi terapeutik sel stem embrionik pada berbagai penyakit degeneratif. Cermin Dunia Kedokteran. 153:5-8.
Shiroi A, Yoshikawa M, Yokota H, Fukui H, Ishizaka S, Tatsumi K, Takahashi Y. 2002. Identification of insulin-production cell derived from embrionic stem cell by zinc-chelating dithizone. Stem Cell. 20(4):284-292.
Soria B, Skoudy A, Martin F. 2001. From stem cells to beta cells: new strategies in cell therapy of diabetes mellitus. Diabetologia. 44:407-415.
Yulianti S, Junaedi E. 2006. Sembuhkan Penyakit dengan Habbatus Sauda (Jintan Hitam). Tangerang (ID): Agromedia Pustaka.
14
