LAPORAN AKHIR
HIBAH BERSAING
PENGEMBANGAN OBAT ANTIKANKER PAYUDARA
DARI LEMPUYANG GAJAH DAN LEMPUYANG EMPRIT
DENGAN KONTROL KUALITAS BERBASIS SENYAWA
PENANDA ZERUMBONE DAN AKTIVITAS ANTIKANKER
PADA SEL T47D
TIM PENGUSUL
Dedi Hanwar, M.Si., S.Si., Apt. (KETUA, 0607037401 ) Rosita Melannisa, M.Si., S.Si., Apt. (ANGGOTA, 0607037602) Ika Trisharyanti, M.Farm., S.Si., Apt. (ANGGOTA, 0619037901)
Tahun ke 1 dari rencana 2 tahun dibiayai oleh:
Koordinasi Perguruan Tinggi Wilayah VI, Kemendikbud RI, sesuai dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Hibah Penelitian Nomor:
008/K6/KL/SP/2013, Tanggal 16 Mei 2013
UNIVERSITAS MUHAMMADYAH SURAKARTA
DESEMBER 2013
iii RINGKASAN
Penelitian awal menunjukkan efek sitotoksik ekstrak etanol rimpang lempuyang gajah (Zingiber zerumbet) dan lempuyang emprit (Zingiber littorale) terhadap sel kanker payudara (T47D) dan identifikasi
zerumbone sebagai senyawa mayor secara KLT. Pengembangan obat herbal sebagai antikanker payudara memerlukan penelusuran mekanisme molekuler sehingga menghasilkan obat yang selektif pada sel kanker dan aman. Selain itu, kontrol kualitas obat herbal perlu dilakukan melalui standarisasi ekstrak, penentuan kadar senyawa penanda dan profil metabolitnya. Penelitian pada tahun pertama meliputi: (1). Pembuatan ekstrak (2). Standarisasi ekstrak (parameter spesifik dan non spesifik) (3). Kontrol kualitas ekstrak berbasis senyawa penanda zerumbone dengan validasi metode KCKT dan analisis profil metabolit dengan KG dan (4). aktivitas antikanker payudara terhadap sel T47D dengan pengamatan morfologi sel dan apoptosis. Tahun kedua meliputi: (1). Uji toksisitas akut dan (2). Uji toksisitas subkronis. Tujuan penelitian tahun pertama adalah mengembangkan metode kontrol kualitas ekstrak Z. zerumbet dan Z. littorale
berbasis senyawa penanda zerumbone dan aktivitas antikankernya. Tahun kedua ditujukan untuk pengembangan formulasi dan desain produk OHT serta pengujian toksisitas akut-subkronisnya. Target luaran khusus dari penelitian ini adalah metode kontrol kualitas ekstrak terstandar (tahun pertama) dan ekstrak Z. zerumbet dan Z. littorale sebagai obat antikanker yang selektif, aman dan bermutu (tahun kedua).
Ekstrak lempuyang emprit dan lempuyang gajah sudah memenuhi persyaratan parameter non spesifik dan spesifik. Kadar zerumbone pada ekstrak lempuyang emprit berbeda untuk setiap daerah (18,24 s/d 27,24 %b/b), dan kadarnya pada ekstrak lempuyang gajah jauh lebih bervariasi untuk setiap daerah (8,37 s/d 32,31 %b/b). Profil metabolit dari ekstrak lempuyang emprit dan lempuyang gajah berbeda pada setiap daerah, dengan kandungan metabolit mayornya berupa asam-asam organik dan zerumbone. Ekstrak lempuyang gajah memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel T47D yang jauh lebih kuat (IC50 < 50 μg/mL) dibandingkan ekstrak lempuyang emprit (IC50 > 50 μg/mL).
iv
PRAKATA
Assalamu’alaikum wr. wb.
Alhamdulillahirabbil’alamin, puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala limpahan rahmat, taufik dan hidayah-Nya, sehingga penulis dapat menyusun dan menyelesaikan laporan akhir dari penelitian yang berjudul “Pengembangan Obat Antikanker Payudara Dari Lempuyang Gajah Dan Lempuyang Emprit Dengan Kontrol Kualitas Berbasis Senyawa Penanda
Zerumbone Dan Aktivitas Antikanker Pada Sel T47D”. Penyelesaian laporan ini tentu tidak lepas dari dukungan dan bantuan berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada : 1. Arifah Sri Wahyuni M.Sc., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi
2. Prof. Dr. Harun Joko Prayitno, M.Hum., selaku kepala LPPM
3. Dosen, laboran dan mahasiswa Farmasi UMS yang membantu penelitian
Wassalamualaikum wr. wb.
Surakarta, 5 Desember 2013
v
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA 4
A. Kanker Payudara dan Target Terapinya 4
B. Lempuyang Gajah 6
C. Lempuyang Emprit 9
D. Senyawa Penanda Zerumbone 10
E. Pengembangan Tanaman Obat Tradisional sebagai Antikanker 12
F. Hasil yang Ditargetkan 15
BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN 18
A. Tujuan penelitian 18
B. Manfaat penelitian 18
BAB IV. METODE PENELITIAN
A. Tahapan penelitian tahun 1 21
B. Tahapan penelitian tahun 2 24
BAB V. HASIL DAN PEMBAHASAN 27
A. Pembuatan Ekstrak B. Standarisasi Ekstrak
C. Aktivitas Antikanker Payudara terhadap Sel T47D D. Validasi Metode dan Penetapan Kadar Zerumbone E. Profil Metabolit Ekstrak Lempuyang
BAB VI. RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA BAB VII. KESIMPULAN DAN SARAN
vii DAFTAR TABEL
Tabel 1. Rekapitulasi penetapan parameter non spesifik ekstrak lempuyang gajah dan lempuyang emprit
Tabel 2. Rekapitulasi Penetapan Parameter Spesifik Ekstrak Lempuyang Gajah dan Lempuyang Emprit
Tabel 3. Hasil Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol Lempuyang Emprit dan Lempuyang Gajah Pada Sel T47D
Tabel 4. Kurva Baku zerumbone Hubungan antara Konsentrasi dan Luas Area
Tabel 5. Hasil analisis presisi dan presisi antara
Tabel 6. Kadar Zerumbone pada Ekstrak Etanol Lempuyang Emprit dan Lempuyang Gajah dan Hubungannya dengan Aktivitas Kankernya terhadap Sel T47d
Tabel 7. Perbandingan kualitatif jenis metabolit-metabolit pada ekstrak lempuyang emprit
Tabel 8. Perbandingan kualitatif jenis metabolit-metabolit pada ekstrak lempuyang gajah
28
30
33
34 36
38
44
viii DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Target-target molekular pada kanker payudara Gambar 2. Tanaman dan Rimpang Lempuyang Gajah Gambar 3. Tanaman dan Rimpang Lempuyang Emprit Gambar 4. Struktur Kimia Zerumbone
Gambar 5. Target aktivitas antikanker dari bahan alam
6 8 9
11
14
Gambar 6. Fishbone penelitian yang akan dilakukan selama 2 tahun 26
Gambar 7. Morfologi Sel hidup T47D 31
Gambar 8. Morfologi Sel T47D setelah perlakuan dengan berbagai ekstrak
Gambar 9. Kromatogram zerumbone hasil optimasi fase gerak Gambar 10. Kurva Baku zerumbone diperoleh dari plot antara
Konsentrasi dan Luas Area
Gambar 11. Kromatogram ekstrak lempuyang emprit Gambar 12. Kromatogram ekstrak lempuyang gajah
Gambar 13. Profil hubungan antara kadar zerumbone dalam ekstrak lempuyang gajah dengan aktivitas antikanker terhadap sel T47d
Gambar 14. Profil hubungan antara kadar zerumbone dalam ekstrak lempuyang emprit dengan aktivitas antikanker terhadap sel T47d
Gambar 15. Kromatogram Ion Total (TIC) dari ekstrak lempuyang emprit yang diderivatisasi dengan BSTFA yang berasal dari A. Solo, B. Semarang, C. Yogyakarta
ix DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Laporan Penggunaan Dana Tahap II Lampiran 2. Data Standarisasi Ekstrak
Lampiran 3. Data aktivitas sitotoksik ekstrak lempuyang emprit dan lempuyang gajah terhadap sel T47D
56 59
1 BAB I
PENDAHULUAN
A.Latar belakang
Penggunaan obat-obat herbal mengalami peningkatan di seluruh dunia terutama di negara berkembang termasuk pada pengobatan kanker. Selain murah, penggunaan obat herbal dalam perawatan kesehatan untuk mencegah dan mengobati berbagai macam penyakit lebih mudah diterima oleh tubuh dengan efek samping yang minimal. Sekitar 7-48% pasien yang telah didiagnosis kanker menggunakan pengobatan herbal (Gratus, 2009). Bukti ilmiah mengenai keamanan dan efektivitas terapi dengan produk herbal dapat memperkuat penggunaanya sebagai alternatif dari pengobatan modern (Pal & Shukla, 2003) khususnya pada pengobatan kanker (Haruyo et al., 2007).
Kanker merupakan salah satu penyakit yang menyebabkan angka kematian cukup tinggi di Indonesia maupun di dunia. Insidensi berbagai jenis kanker mengalami peningkatan di negara-negara berkembang (Garcia et al., 2007). Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang paling sering terjadi pada wanita di Indonesia (Tjindarbumi & Mangunkusumo, 2002). Perkembangan kanker payudara seringkali dijumpai sudah dalam stadium lanjut (metastatis) dan melibatkan mekanisme molekuler yang komplek sehingga menimbulkan masalah dalam terapinya. Peningkatan ilmu pengetahuan terkait mekanisme molekuler dan patofisiologi kanker payudara mendorong pengembangan obat antikanker pada target molekuler sehingga diharapkan dapat menghasilkan obat antikanker dengan efektifitas yang lebih besar dan toksisitas yang lebih rendah (Gibbs, 2000).
2 (Dewoto, 2007). Saat ini, produk obat herbal antikanker yang sudah dapat dipasarkan kebanyakan masih dalam bentuk jamu (219 produk), sedangkan dalam bentuk obat herbal terstandar baru 3 jenis dan dalam bentuk fitofarmaka belum ada (DRN, 2011). Pengembangan ini memerlukan kontrol kualitas terhadap sediaan meliputi kandungan dan efikasinya serta penelusuran mekanisme molekulernya.
Dua rimpang species Zingiber yaitu lempuyang gajah (Z. zerumbet) dan lempuyang emprit (Z. littorale) telah dikenal luas penggunaannya dalam sediaan obat tradisional. Skrining awal aktivitas sitotoksik ekstrak etanol lempuyang gajah dan lempuyang emprit terhadap sel kanker payudara T47D oleh tim dengan mahasiswa S1 menunjukkan aktivitas sitotoksik yang lebih besar pada lempuyang gajah (Andasari, 2011). Secara kemotaksonomi lempuyang emprit memiliki hubungan kekerabatan dengan lempuyang gajah dan kemungkinan memiliki khasiat yang sama (Marsusi et al., 2001). Penelitian lain melaporkan aktivitas sitotoksik lempuyang gajah dan isolat zerumbone dari rimpang tersebut pada beberapa sel kanker seperti MCF-7,
HT-29, HeLa, dan CaCo-2 (Murakami et al., 1999; Kirana et al., 2003; Abdul et al., 2008) dengan mekanisme penghambatan proliferasi dan pemacuan
apoptosis (Wahab et al., 2009; Sakinah et al., 2007).
Zerumbone sebagai senyawa mayor dan senyawa aktif dalam
lempuyang gajah dan lempuyang emprit dapat dikembangkan sebagai senyawa penanda pada kontrol kualitas ekstrak untuk pengembangan ke arah OHT dan fitofarmaka. Penelitian oleh tim mengidentifikasi zerumbone sebagai senyawa mayor secara KLT (Kromatografi Lapis Tipis) dengan indikasi kadar yang lebih tinggi pada lempuyang gajah dibanding lempuyang emprit. Sementara itu, kandungan selain zerumbone ditengarai lebih banyak pada lempuyang emprit (Andasari, 2011). Metode standarisasi kadar zerumbone pada ekstrak etanol kedua rimpang ini belum dikembangkan
3 kandungan dan efikasi sangat diperlukan bagi pengembangannya menjadi obat antikanker dalam pengobatan formal. Pengembangan produk OHT memerlukan data pengujian toksisitas akut-subkronis.
B.Rumusan Masalah
Perumusan masalah yang dapat disampaikan berdasarkan uraian di atas adalah:
1. Berapakah kadar zerumbone dalam ekstrak etanol lempuyang gajah dan lempuyang emprit?
2. Apakah kadar zerumbone dalam ekstrak tersebut berpengaruh terhadap aktivitas antikankernya?
3. Bagaimanakah profil metabolit ekstrak etanol lempuyang gajah dan lempuyang emprit?
4. Bagaimana formulasi sediaan OHT dari ekstrak etanol lempuyang gajah dan lempuyang emprit?
4
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A.Kanker Payudara dan Target Terapinya
Kanker merupakan salah satu penyakit yang menyebabkan angka
kematian cukup tinggi di Indonesia maupun di dunia. Penyakit kanker terdiri
dari paling sedikit 100 jenis, di Amerika jumlah pasien meninggal mencapai
553.400 dari total penderita 1.268.000 (Greenlee et al., 2001). Penelitian
yang sama menunjukan bahwa kanker menempati peringkat ke dua sebagai
penyebab kematian setelah penyakit jantung. Kanker leher rahim dan kanker
payudara memiliki tingkat insidensi tinggi pada wanita di Indonesia dari
berbagai jenis kanker (Tjindarbumi & Mangunkusumo, 2002).
Insidensi kanker payudara mengalami peningkatan di negara-negara
berkembang (Garcia et al., 2007). Angka kejadian kanker payudara jauh lebih
besar pada wanita dibanding laki-laki. Kemungkinan laki-laki terkena kanker
ini adalah 1/100 dari wanita (King, 2000). Di negara-negara maju, 1 dari 8
wanita menderita kanker payudara. Menurut WHO, lebih dari 1.000.000 juta
kasus terjadi setiap tahun dan lebih dari setengahnya terdapat di
negara-negara berkembang (Aapro, 2001). Berdasarkan sepuluh kanker primer pada
wanita di Indonesia, kanker payudara juga menempati posisi kedua (17,77%)
setelah kanker leher rahim (28,66%) (Tjindarbumi & Mangunkusumo, 2002).
Selain itu, kanker payudara merupakan penyebab utama kematian pada
wanita di berbagai belahan dunia (Walker et al., 1997). Kebanyakan
penderita kanker payudara (60-70%) terlambat mendapat pengobatan
sehingga mengakibatkan kematian.
Kanker merupakan pertumbuhan sel yang tidak terkontrol diikuti
dengan proses invasi ke jaringan sekitar dan penyebaran (metastasis) ke
bagian tubuh yang lain. Kanker pada dasarnya merupakan sel dengan
proliferasi yang tak terkendali akibat kerusakan gen, utamanya pada
5
mendasar dalam fisiologi sel yang akhirnya tumbuh menjadi malignan.
Secara umum, ciri-ciri dari sel kanker adalah: a) Memiliki kemampuan
mencukupi sinyal pertumbuhan sendiri yang dapat memacu daur sel. b)
Insensitivitas terhadap anti faktor pertumbuhan yang menyebabkan daur sel
tidak terhenti. c) Kehilangan kemampuan apoptosis (kemampuan melakukan
program bunuh diri), sehingga sel tersebut terus bertambah. d) Invasi ke
jaringan lain dan masuk ke peredaran darah, sehingga dapat mengalami
metastasis. e) Potensi replikasi yang tidak terbatas (immortal). f)
Kemampuan untuk membentuk saluran darah ke sel kanker (angiogenesis)
(Hanahan & Weinberg, 2000).
Kemoterapi merupakan pilihan pengobatan yang paling
memungkinkan untuk pengobatan kanker pada stadium lanjut (sudah
metastasis) dengan menggunakan senyawa kimia yang bekerja langsung
pada sel kanker. Kegagalan yang sering terjadi dalam usaha pengobatan
kanker, utamanya melalui kemoterapi, lebih dikarenakan rendahnya
selektifitas obat-obat anti kanker dan sensitivitas sel kanker itu sendiri
terhadap agen kemoterapi. Usaha penemuan obat baru yang aman dan
selektif terhadap pengobatan dan pencegahan kanker dengan mengetahui
pengaruh molekuler terhadap sel kanker perlu untuk dilakukan.
Target-target molekular penting untuk pengembangan anti kanker
payudara dapat disusun berdasarkan karakteristik kanker payudara.
Berdasarkan fungsinya, dapat diklasifikasikan menjadi 2 grup yaitu (1) target
hormonal dan (2) target non-hormonal seperti terlihat pada Gambar 1.
Target hormonal direpresentasikan oleh ER. Target non-hormonal dibagi
menjadi beberapa kategori yaitu (a) pengaturan signal transduksi, (b)
regulator cell-cycle dan apoptosis, dan (c) pengaturan angiogenesis
(Cristofanilli and Hortobagyi, 2002).
Pengembangan obat-obat antikanker payudara dapat diarahkan target
hormonal dengan antiestrogen (Hilakivi-Clarke et al., 2004), penghambatan
6
(Hilakivi-Clarke et al., 2004), faktor pertumbuhan dan growth factor
signaling (Sledge and Miller, 2003), peningkatan ekspresi protein
pro-apoptosis seperti p53 dan Bax dan penghambatan protein anti-pro-apoptosis
seperti Bcl-2 (Los et al., 2003), serta penghambatan faktor angiogenik seperti
VEGF (Cristofanilli and Hortobagyi, 2002).
Gambar 1. Target-target molekular pada kanker payudara
(Cristofanilli and Hortobagyi, 2002)
Kanker payudara memiliki kemampuan mencukupi signal
pertumbuhan sendiri. Anggota dari keluarga EGFR terutama HER1 dan HER2
terkait dengan patogenesis kanker payudara (Cristofanilli and Hortobagyi,
2002). Overekspresi HER2 terjadi pada 20–25% kanker payudara (Sledge
and Miller, 2003). Seperti halnya kanker lain, pada kanker payudara juga
terjadi proliferasi yang tidak terkontrol dan penurunan apoptosis,
diantaranya disebabkan overekspresi Cyclin D yang dijumpai pada 30-50 %
kanker payudara (Hilakivi-Clarke et al., 2004). Salah satu strategi
pengembangan obat anti kanker payudara adalah penemuan senyawa baru
7
yang mendasarkan target aksinya pada gen-gen yang mengatur
pertumbuhan, diferensiasi, dan kematian sel.
B.Lempuyang Gajah
Lempuyang Gajah (Zingiber zerumbet L.) juga dikenal sebagai
Lempuyang kebo atau lempuyang kapur (Jawa) dan lampojang paek
(Madura) mempunyai klasifikasi sebagai berikut:
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Liliopsida
Anak kelas : Zingiberidae
Bangsa : Zingiberales
Suku : Zingiberaceae
Marga : Zingiber
Jenis : Zingiber zerumbet L. (Cronquist, 1981)
Sinonim : Amomum zerumbet L. (Anonim, 2009).
Morfologi rimpang (Gambar 2) adalah berbau aromatik dengan rasa
pedas mirip mentol dan agak pahit. Rimpang berbentuk agak pipih atau agak
bulat telur terbalik, bagian ujung bercabang-cabang pendek, pada tiap
cabang terdapat parut melekuk ke dalam dengan potongan sepanjang 7-18
cm dan tebal 2,5-5 cm. Bagian luarnya berwarna coklat kekuningan sampai
kuning pucat dan beralur-alur memanjang serta memberikan bekas patahan
tidak rata dan berserat (Dep.Kes.RI, 1978).
Rimpang mengandung minyak menguap seperti zerumbone, humulene,
camphene (Faizah et al., 2002) dan α-caryophyllene (Purwanti dkk., 2003).
Selain itu, mengandung saponin, flavonoida dan polifenol (Syamsuhidayat
dan Hutapea, 2000). Uji fitokimia dari ekstrak etanol rimpang tersebut
positif adanya komponen fenolik, tanin, asam amino, karbohidrat, dan
alkaloid (Somchit et al., 2005). Hasil isolasi dari tanaman ini diperoleh
adanya dua senyawa se-isomer yaitu 6-methoxy-2E,9E-humuladien-8-one
1,5,5,8-8
tetrametil-12-oksabisiklo [9.1.0] dodeka-3,7-dien (Murakami et al., 1999;
Abdul et al., 2008; Bhuiyan et al., 2009).
Gambar 2. Tanaman dan Rimpang Lempuyang Gajah
Rimpang dimanfaatkan dalam ramuan sebagai obat pelangsing,
penambah nafsu makan (stomakik), penghangat badan, obat pusing, obat
disentri, dan membantu mengeluarkan gas (karminatif) pada perut
kembung (Mursito, 2001). Penelitian terhadap ekstrak etanol dari rimpang
memiliki aktivitas analgesik dan antipiretik yang mampu menghambat
inflamasi akibat induksi prostaglandin (Somchit et al., 2005). Zerumbone dan
α-caryophyllene terdapat dalam rimpang dan daun serta kedua senyawa ini pada konsentrasi tinggi menunjukkan aktivitas antiinflamasi, antiulkus,
antioksidan dan antimikroba (Jaganath dan Ng, 2000; Somchit et al., 2005;
Mascolo et al, 1989; Agrawal et al., 2000; Bhuiyan et al., 2009). Senyawa
utama zerumbon yang diisolasi dari lempuyang gajah menunjukkan potensi
sebagai anti kanker leher rahim, dibuktikan dengan uji sitotoksisitas pada
sel HeLa dengan metode MTT assay IC50 sebesar 11,3 μM (2,5 μg∕ml) (Abdul
et al., 2008). Zerumbon juga terbukti bersifat toksik pada sel HT-29, CaCo-2,
9
C. Lempuyang Emprit
Klasifikasi lempuyang emprit atau lempuyang pahit (Zingiber littorale
Val.) adalah sebagai berikut:
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Liliopsida
Anak kelas : Zingiberidae
Bangsa : Zingiberales
Suku : Zingiberaceae
Marga : Zingiber
Jenis : Zingiber littorale Val. (Cronquist, 1981)
Rimpangnya (Gambar 3) memiliki rasa pahit dengan bau aromatik
khas. Rimpang berbentuk kepingan pipih, ringan, bentuk tidak beraturan,
tebal sampai 5 mm dengan permukaan luar tidak rata, berkerut dan
berwarna kuning pucat kecoklatan. Bidang irisannya berwarna lebih muda
dari permukaan luar dengan korteks sempit (lebar ± 2 mm). Bekas
patahannya tidak rata dan berserat. (Departemen Kesehatan Republik
Indonesia, 1978).
Gambar 3. Tanaman dan Rimpang Lempuyang Emprit
Rimpang lempuyang emprit mengandung minyak atsiri, sterol, asam
10
dkk., 2000) dan flavonoida (Syamsuhidayat dan Hutapea, 2000). Komponen
penyusun minyak atsiri dalam lempuyang emprit antara lain linalool,
α-caryophyllene, pinena, norpinena, 1,2-benzene dicarboxylyc acid (Purwanti
dkk., 2003) serta zerumbone (Riyanto, 2007). Selain itu, minyak atsiri juga
mengandung komponen fitosterol seperti kolesterol, kampesterol,
stigmasterol, dan β-sitosterol (Riyanto, 2007).
Rimpang tersebut berkhasiat sebagai obat demam, rematik dan obat
sakit perut (Syamsuhidayat dan Hutapea, 2000). Selain itu, juga menambah
nafsu makan serta mengobati radang tenggorokan (Falaha, 2009). Hasil
penelitian dari infus rimpang lempuyang emprit menunjukkan adanya efek
analgesik (Pudjiastuti dkk., 2000). Aktivitas sitotoksik lempuyang emprit
masih jarang dilaporkan. Skrining awal oleh tim dengan mahasiswa S1
menunjukkan aktivitas sitotoksik ekstrak etanol lempuyang gajah dan
lempuyang emprit terhadap sel kanker payudara T47D (Andasari, 2011).
Secara kemotaksonomi lempuyang emprit memiliki hubungan kekerabatan
dengan lempuyang gajah dan kemungkinan memiliki khasiat yang sama
(Marsusi et al., 2001).
D.Senyawa Penanda Zerumbone
Seperti halnya species Zingiberaceae, rimpang lempuyang gajah dan
lempuyang emprit memiliki kandungan minyak atsiri yang tinggi di samping
senyawa fenolik dan flavonoid. Minyak atsiri dari rimpang lempuyang gajah
dan lempuyang emprit mengandung zerumbone, humulene dan camperen,
dengan zerumbone sebagai komponen terbesar (Riyanto, 2007; Faizah et al.,
2009). Hasil penelitian oleh tim juga mengindikasikan zerumbone sabagai
senyawa mayor dalam ekstrak etanol rimpang lempuyang gajah dan
lempuyang emprit secara KLT (Andasari, 2011).
Zerumbon memiliki struktur yang unik (Mathes et al., 2002) dan
bertanggungjawab terhadap aktivitas biologi rimpang lempuyang gajah
11
tersebut. Komponen minyak atsiri dalam rimpang lempuyang gajah dan
lempuyang emprit bervariasi (Purwanti dkk., 2003). Zerumbone memiliki
gugus α,β-unsaturated carbonyl (Gambar 4) (Keong et al., 2010). Zerumbon
dilaporkan memiliki aktivitas menghambat proliferasi sel kanker kolon dan
kulit melalui apoptosis (Murakami et al., 2002), menginduksi proses
apoptosis dalam sel hepG2 (Sakinah et al., 2007), dan antiinflamasi
(Murakami et al., 2002).
Gambar 4. Struktur Kimia Zerumbone (Keong et al., 2010)
Menurut Wahab et al., (2009) zerumbone akan meningkatkan aktivitas
enzim caspase-3 lebih tinggi pada sel HeLa yang diberi perlakuan dibanding
tanpa perlakuan. Zerumbone juga mampu menurunkan produksi human
IL-12 (human InterLeukin-IL-12) karena kemampuannya sebagai agen
antiinflamasi. IL-12 ini dikenal sebagai pro-inflammatory cytokine, dimana
cytokine berperan dalam mengatur proliferasi dan diferensiasi sel (Keong et
al., 2010) sehingga penghambatan cytokine dapat menghambat proliferasi sel
kanker. Ditambah lagi, zerumbone memiliki aktivitas antiinflamasi melalui
penghambatan ekspresi protein proinflamasi (iNOS/COX-2) dan TNF-α pada
sel RAW 264,7. Penghambatan ini mampu menekan produksi NO yang
berperan pada proses karsinogenesis (Murakami et al., 2002). Zerumbone
menghambat proliferasi sel kanker HepG2 dengan menginduksi apoptosis.
Penghambatan ini disebabkan oleh menurunnya aktivitas protein Bcl-2 dan
up-regulation proapoptosis Bax tanpa melibatkan p53 (Sakinah et al., 2007).
12
T47D oleh ekstrak etanol rimpang lempuyang gajah dan lempuyang emprit
perlu diteliti lebih lanjut guna mendukung pengembangannya sebagai
antikanker payudara yang efektif dan aman.
Kontrol kualitas guna mendukung pengembangan obat herbal menjadi
OHT dan fitofarmaka dapat dilakukan dengan melihat profil kromatografi
untuk identifikasi dan penetapan kadar senyawa tertentu dalam ekstrak
(Yadav & Dixit, 2008). Studi sebelumnya melaporkan variasi kadar zerumbon
dalam rimpang lempuyang gajah dari berbagai lokasi geografis tetapi
kebanyakan sampel yang digunakan adalah minyak atsirinya dengan metode
kromatografi gas/KG atau kromatografi lapis tipis kinerja tinggi/KLTKT
(Tewtrakul et al, 1997; Bhuiyan et al., 2009; Xuan et al, 1993; Rout et al.,
2009). Profil kromatografi ekstrak etanol lempuyang gajah dan lempuyang
emprit dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dan kadar
zerumbone dari rimpang Z. zerumbet yang berasal dari Indonesia belum
dilaporkan. Penelitian ini pada tahun pertama ditujukan untuk menentukan
kadar zerumbone dari ekstrak etanol lempuyang gajah dan lempuyang emprit
dari tiga lokasi di Jawa Tengah dan DIY dengan metode KCKT yang
tervalidasi. Metode KCKT dipilih karena metode ini mempunyai selektivitas
dan sensitivitas yang tinggi. Metabolic profiling dengan KG yang dilengkapi
detektor MS ditujukan untuk melengkapi data keragaman kandungan ekstrak
selain zerumbone dan akan mendukung untuk kontrol kualitas produk.
E. Pengembangan Tanaman Obat Tradisional sebagai Antikanker
Penggunaan obat-obat herbal mengalami peningkatan di seluruh dunia
terutama di negara berkembang. Selain murah, penggunaan obat herbal
dalam perawatan kesehatan untuk mencegah dan mengobati berbagai
macam penyakit lebih mudah diterima oleh tubuh dengan efek samping yang
minimal. Penggunaan tanaman obat tersebut sering kali dikembangkan
berdasarkan penggunaannya secara empiris atau berdasarkan kajian
13
efektivitas terapi dengan produk herbal dapat memperkuat penggunaanya
sebagai alternatif dari pengobatan modern (Pal & Shukla, 2003). Penggunaan
obat herbal untuk penyakit kanker juga mengalami peningkatan. Sekitar
7-48% pasien yang telah didiagnosis kanker menggunakan pengobatan herbal
(Gratus, 2009). Hal ini mendorong tuntutan akan adanya produk herbal yang
terkontrol kualitasnya dari segi kandungan maupun efek.
Sebagian besar penelitian tanaman obat telah diarahkan pada
pemahaman yang lebih baik dari efek farmakologisnya selain kajian
fitokimianya (Heinrich, 2003). Perkembangan penelitian mengenai
pengobatan kanker berupaya untuk meningkatkan selektifitas dan
keamanannya serta mengurangi efek samping pada sel normal. Peningkatan
ilmu pengetahuan terkait mekanisme molekuler dan patofisiologi kanker
manusia mendorong pengembangan obat antikanker pada target molekuler
sehingga diharapkan dapat menghasilkan obat antikanker dengan efektifitas
yang lebih besar dan toksisitas yang lebih rendah (Gibbsb, 2000).
Identifikasi agen antikanker selain didasarkan pada kajian etnobotani
dan fitokimia tetapi juga berbasis uji sitotoksik secara in vitro dan in vivo.
Kelemahan uji sitotoksik yang belum dapat menggambarkan kompleksitas
kanker pada manusia dapat diatasi dengan perkembangan ilmu pengetahuan
khususnya biologi molekuler (Gibbsb, 2000) sehingga penelitian dapat
diarahkan target molekuler yang spesifik seperti sinyal transduksi, regulasi
cell cycle, apoptosis dan angiogenesis (Hanahan & Wienberg, 2000). Uji
sitotoksik secara in vitro dapat dilanjutkan pada pengamatan seluler dan
level molekuler untuk mengetahui target molekuler efek sitotoksik tersebut.
Senyawa-senyawa seperti vincristine, vinblastine dan taxol yang didapat dari
tanaman obat mempunyai target molekuler spesifik pada penghambatan
proliferasi sel kanker (Cragg & Newman, 2005). Pengamatan perubahan
dapat diarahkan pada target molekuler yang spesifik seperti sinyal
transduksi, regulasi cell cycle, apoptosis dan angiogenesis. Senyawa
14
(Gambar 5) (Gupta et al., 2010). Adanya perubahan morfologi karakteristik
dan fragmentasi DNA menunjukkan aktivitas antiproliferatif terjadi karena
induksi apoptosis telah diamati pada penelitian beberapa tanaman obat
(Ueda et al., 2002). Berbagai bahan alam telah terbukti memiliki kemampuan
menginduksi apoptosis pada sel kanker yang berasal dari manusia
(Taraphdar et al., 2001) termasuk di dalamnya adalah senyawa seskuiterpen
seperti zerumbone (Modzelewska et al., 2005).
Gambar 5. Target aktivitas antikanker dari bahan alam (Gupta et al.,
2010)
Penelusuran mekanisme molekuler dapat dilakukan dengan mengamati
level ekspresi protein-protein tertentu (Kuo et al., 2005; Malikova et al.,
2006). Regulasi cell cycle berdasarkan aktivasi cyclins dan cyclin-dependent
kinases (CDKs) yang menginisiasi perpindahan sel dari fase G1 ke fase S dan
dari fase G2 berlanjut ke mitosis. Kanker sering kali disebabkan aktivitas
cyclin-dependent kinase yang tidak terkontrol oleh inhibitor cell cycle seperti
p21 (Malikova et al., 2006). Pengamatan ekspresi protein regulator cell cycle
merupakan salah satu penelusuran mekanisme molekuler yang spesifik.
15
pencegahan kanker. Penelitian ini akan diarahkan pada penelusuran
mekanisme molekuler dengan pengamatan ekspresi gen/protein dengan
metoda immunositokimia dan western blott pada gen/protein yang terlibat
pada regulasi siklus sel fase G2M seperti p53, p21 dan cdc-2 serta
protein-protein yang terlibat pada proses apoptosis seperti p53, BAX, PUMA,
Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9 dan PARP.
Regulasi obat herbal yang semakin berkembang mendorong perlunya
kontrol kualitas berbasis kandungan selain efikasinya. Pengembangan obat
tradisional ke arah obat herbal terstandar dan fitofarmaka memerlukan
standarisasi bahan baku untuk menjamin keamanan, khasiat dan mutu.
Standarisasi perlu dilakukan untuk menjamin konsistensi komposisi
senyawa kimia dari tanaman yang akan mempengaruhi aktivitas biologisnya.
Komposisi kandungan dan kadar yang kurang terkontrol dapat menyebabkan
variasi mutu produk dari batch ke batch yang tentunya sangat tidak
diharapkan. Kualitas produk obat herbal untuk menjamin konsistensi,
keamanan dan kemanjurannya dapat dilakukan berdasarkan komposisi
kandungan (metabolic profiling) maupun kadar senyawa penanda (Li et al.,
2005; Zeng et al., 2008). Penelitian ini akan mengembangkan metode
standarisasi obat herbal dari lempuyang gajah dan lempuyang emprit
berdasarkan kadar senyawa marker dengan metode KCKT yang tervalidasi.
Kompleksitas kandungan metabolit dalam ekstrak tersebut dapat
diidentifikasi dengan metabolic profiling menggunakan KG yang dilengkapi
detektor MS. Fakultas Farmasi UMS telah mempunyai fasilitas tersebut
sehingga penelitian dapat dilakukan di dalam laboratorium yang dimiliki oleh
institusi.
F. Hasil yang ditargetkan
Secara umum, penelitian ini diarahkan untuk mengembangkan produk
OHT dari ekstrak etanol lempuyang gajah dan lempuyang emprit untuk
16
standarisasi kandungan senyawa penanda zerumbone dan profil
metabolitnya serta efikasinya. Keamanan produk OHT ditinjau berdasarkan
uji toksisitas akut-subkronis. Informasi yang didapat merupakan landasan
ilmiah untuk pengembangan ekstrak tersebut sebagai OHT untuk pengobatan
kanker payudara yang aman dan selektif. Secara keseluruhan, penelitian ini
dibagi kedalam 2 tahap, yakni:
Pada tahun pertama, dilakukan (1). Pembuatan ekstrak (2).
Standarisasi ekstrak (parameter spesifik dan non spesifik) (3). Kontrol
kualitas ekstrak berbasis senyawa penanda zerumbone dengan validasi
metode KCKT dan analisis profil metabolit dengan KG dan (4). aktivitas
antikanker payudara terhadap sel T47D dengan pengamatan morfologi sel
dan apoptosis. Pengaruh molekuler penghambatan proliferasi dilakukan
dengan pengamatan morfologi inti sel atau apoptosis di bawah mikroskop
cahaya dan menggunakan metode double staining. Luaran akhir tahap ini
adalah didapatkan ekstrak terstandar, metode kontrol kualitas berbasis
kadar dan efektifitasnya sebagai antikanker secara in vitro dan pengaruhnya
terhadap proliferasi dan apoptosis sel kanker payudara T47D. Hasil tahun
pertama diharapkan dapat dipublikasikan melalui terbitan berkala ilmiah
(TBI) terakreditasi (HAYATI) dengan judul yang direncanakan adalah
“Correlation of Zerumbone Content of Z. Zerumbet with Cytotoxic Activity on
Breast Cancer Cell”. Metode kontrol kualitas akan didaftarkan untuk
memperoleh HKI.
Pada tahun kedua, dilakukan (1). Formulasi dan desain produk OHT
dan (2). Uji toksisitas akut-subkronis. Produk OHT diformulasi dan didesain
dari ekstrak etanol rimpang lempuyang gajah dan lempuyang emprit berupa
kapsul serta data keamanan produk didasarkan uji toksisitas akut-subkronis.
Formulasi dan desain produk OHT tersebut akan didaftarkan sebagai HKI
serta data keamanannya dipublikasikan dalam TBI terakreditasi (Jurnal
17
Keamanan Produk OHT dari Ekstrak Etanol Lempuyang Gajah dan
Lempuyang Emprit’.
Kontrol kualitas obat herbal yang berbasis kandungan pada
penelitian ini diharapkan dapat dimanfaatkan secara luas sehingga
mendorong produksi obat antikanker yang konsisten, aman dan efektif.
Penelitian ini dapat pula digunakan untuk mengembangkan ilmu
pengetahuan khususnya dalam pengembangan obat anti kanker berbasis
tanaman obat. Selain itu, penelitian ini mendukung pengembangan ekstrak
etanol lempuyang gajah dan lempuyang emprit menjadi OHT dan mendukung
pembanguan nasional di bidang kesehatan dalam pengembangan obat herbal
terstandar dan fitofarmaka yang berkualitas. Fakultas Farmasi UMS telah
memiliki sebagian fasilitas pendukung untuk pelaksanaan penelitian ini,
seperti KCKT dan KG. Pengamatan apoptosis dilakukan bekerjasama dengan
49
DAFTAR PUSTAKA
Aapro, M.S., 2001, Meeting report: Adjuvan theraphy of primary breast cancer: A review of key findings from the 7th International Conference, St. Gallen, February 2001, The Oncologist, 6, 376-385.
Abdul, A, B, H., Al-Zubairi, A, S., Tailan, D., Wahab, S, I, A., Zain, Z, N, M., Ruslay, S., and Syam, M, M.. (2008). Anticancer Activity of Natural Compound (Zerumbone) Extracted from Zingiber zerumbet in Human HeLa Cervical Cancer Cells, International Journal of Pharmacology 4 (3): 160-168.
Abdula, A.B.H., Abdelwahab, S.I., Al-Zubairi, A.S., Elhasan, M.M., dan Murali, S.M., 2008, Anticancer and Antimicrobial Activities of Zerumbone from the Rhizomes of Zingiber zerumbet, International Journal of
Pharmacology, 4 (4), 301-304.
Adel, A., Abdul, A.B., Yousif, M., Abdelwahab, S.I., Elhassan, M.M., dan Mohan, S., 2010, In vivo and In vitro Genotoxic Effects of Zerumbone, Caryologia, Vol. 63, No. 1, 11-17.
Agrawal, A.K., Rao, C.V., Sairam, K., dan Joshi, V.K., 2000, Antipyretic dan Analgesic Activities of Zingiber zerumbet Extracts, Indian J Exp Biol, 38. 994-998.
Andasari, SD., 2011, Aktivitas sitotoksik ekstrak Etanol Rimpang Lempuyang Gajah (Zingiber zerumbet (L.) J. E. Smith) dan Rimpang Lempuyang Emprit terhadap sel kanker Payudara T47D, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta, Surakarta.
Ansel, H., 1989, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi, cetakan pertama, diterjemahkan oleh Ibrahim F., Universitas Indonesia Press.
Anonima, 2009, Zingiber littorale Val., Laporan Penelitian Laboratorium
Penetapan Mutu dan Keamanan Ekstrak, Fakultas Farmasi, Universitas
Muhammdiyah Surakarta, Surakarta.
Anonimb, 2009, Zingiber zerumbet L., Laporan Penelitian Laboratorium
Penetapan Mutu dan Keamanan Ekstrak, Fakultas Farmasi, Universitas
Muhammdiyah Surakarta, Surakarta.
50
Cristofanilli, M. and Hortobagyi, G. N., 2002, Molecular targets in breast cancer: current status and future directions, Endocrine-Related Cancer, 9, 249–266.
Cragg, G. M., & Newman, D. J. (2005). Plants as a source of anti-cancer agents.
Journal of ethnopharmacology, 100(1-2), 72-9.
doi:10.1016/j.jep.2005.05.011
Dep. Kes. RI. (1978). Materia Medika Indonesia. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta.
Dewoto, H. R. (2007). Pengembangan Obat Tradisional Indonesia Menjadi Fitofarmaka *. Universitas Stuttgart, 205-211.
DRN. (2011). Laporan Akhir Masa Tugas Dewan Riset Nasional Periode 2009-2011.http://www.drn.go.id/download/Lap%20Akhir%20Masa%20Tug as%20DRN%202009-2011.pdf
Eid, E, E., Abdul, A, B., Al-Zubairi, A., Sukari, M, A., and Abdullah, R., 2010, Validated High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Method for Analysis Zerumbone in Plasma, African Journal of Biotechnology Vol. 9(8), 1260-1265.
Faizah, S., Somchit, MN., and Shukriyah, MH., 2002, Zingiber Zerumbet (Lempoyang): A Potential Anti-Inflammatory Agent, Proceedings of the
Regional Symposium on Environment and Natural Resources 10-11th, Vol
1: 516-520.
Falaha, M., 2009, Lempuyang emprit, (online),
(http://id.shvoong.com/medicine-and-health/alternative-medicine/1883713-tanaman-obat/, diakses 17 agustus 2010).
Jaganath, I.B., dan Ng, L.T., 2000, Herbs: The Green pharmacy of Malaysia, Vinpress Sdn. Bhd. and Malaysia Agricultural Research and Development
Institute, pp 95-99.
Jang, D.S., dan Seo, E.K., 2005, Potentially Bioactive Two New Natural Sesquiterpenoids from the Rhizomes of Zingiber zerumbet, Arch
Pharm Res, Vol. 28, No. 3, 294-296.
51
Gibbs, J. B. (2000). Mechanism-based target identification and drug discovery in cancer research. Science (New York, N.Y.), 287(5460), 1969-73. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10720316
Greenlee, R.T., Hill-Harmon, M.B., Murray,T. and Thun, M. (2001). Cancer Statistics, 2001. CA Cancer J Clin. 51:15-36
Gupta S.B., Kim J.H., Prasad S., and Aggarwal B.B. (2010). Regulation of survival, proliferation, invasion, angiogenesis, and metastasis of tumor cells through modulation of inflammatory pathways by nutraceuticals.
Cancer Metastasis Rev.29(3): 405–434.
Hanahan, D. and Wienberg, R.A. (2000) The Hallmarks of Cancer. Cell. Vol 100. 57-70.
Haruyo, I., Yutaka, N., Yoshiki, K., and Bharat, A.B., (2007). Anticancer Drugs Designed by Mother Nature: Ancient Drugs but Modern Targets.
Current Pharmaceutical Design. 13. 33. 3400-3416(17).
Heinrich, M. (2003). Ethnobotany and natural products: the search for new molecules, new treatments of old diseases or a better understanding of indigenous cultures? Current topics in medicinal chemistry, 3(2), 141-54. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12570770
Hilakivi-Clarke, L., Wang, C., Kalil, M., Riggins, R., and Pestel, R.G., 2004 Nutritional modulation of cell cycle and breast cancer, Endocrine Related Cancer, Preprint of article accepted from endocrinology.org., diakses pada Oktober 2004.
ICH, 2005, Validation Of Analytical Procedures: Text And Methodology, ICH
Harmonised Tripatite Guideline, (Online),
(http://www.ich.org/cache/compo/276-254-1.html, diakses tanggal 24 September 2011).
Jang, D. S., dan Seo E., 2005, Potentially Bioactive Two New Natural
Sesquiterpenoids from the Rhizomes of Zingiber zerumbet, Arch Pharm
Res Vol 28, No 3, 294-296.
Keong, Y, S., Alitheen, N, B., Mustafa, S., Aziz, S, A., Rahman, M, A., and Ali, A, M., 2010, Immunomodulatory Effects Of Zerumbone Isolated From Roots Of Zingiber Zerumbet, Pak. J. Pharm. Sci, Vol. 23: 75-82.
52
Kuo, P.-L., Hsu, Y.-L., Chang, C.-H., & Lin, C.-C. (2005). The mechanism of ellipticine-induced apoptosis and cell cycle arrest in human breast
MCF-7 cancer cells. Cancer letters, 223(2), 293-301.
doi:10.1016/j.canlet.2004.09.046
Malikova, J., Zdarilova, A., & Hlobilkova, A. (2006). Effects of sanguinarine and chelerythrine on the cell cycle and apoptosis. Biomedical papers of the
Medical Faculty of the University Palacký, Olomouc, Czechoslovakia,
150(1), 5-12. Retrieved from
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16936897
Marsusi, Setyawan, A.D., Listyawati, S., 2001, Studi Kemotaksonomi pad genus Zingiber, Biodiversitas, Vol. 2, No. 1, Hal. 92-97.
Mascolo, N., Jain, R, Jain S.C., dan Capasso F.J., 1989, Ethnopharmacologic Investigation of Ginger (Zingiber officinale), Ethnopharmacology, 27, 129.
Modzelewska, A.; Sur, S.; Kumar, S. K.; Khan, S. R. (2005). Sesquiterpenes: Natural Products That Decrease Cancer Growth. Current Medicinal
Chemistry - Anti-Cancer Agents. 5. 5. 477-499(23)
Murakami, A., Takahashi, M., Jiwajinda, S., Koshimizu, K., dan Ohigashi, H., 1999, Identification of Zerumbone in Zingiber zerumbet as a potent inhibitor of 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced Eipstein-Barr Virus Activation, Biosci.Biostechnol.Bioschem, 63 (10), 1811-1812.
Murakami, A., Takahashi, D., Kinoshita, T., Koshimizu, K., dan Kim, W.H., 2002, Zerumbone, a Southeast Asian ginger sesquiterpene, markedly suppresses free radical generation, proliferation accompanied by apoptosis: The alpha, beta-insaturated carbonyl group is a prerequisite,
Carsinogenesis, 23, 795-802.
Pal, S. K., & Shukla, Y. (2003). MINI-REVIEW Herbal Medicine : Current Status and the Future. Cancer, 4(80), 281-288.
Pudjiastuti, Dzulkarnain, B., dan Nuratmi, B., 2000, Uji Analgetik Infus Rimpang Lempuyang Pahit (Zingiber americana BL) pada Mencit Putih, Cermin Dunia Kedokteran, 39, No. 129.
Purwanti., Suranto., dan Setyaninngsih, R., 2003, Potensi Penghambatan Minyak Atsiri dan Ekstrak Kasar Rimpang Lempuyang (Zingiber spp.) terhadap Pertumbuhan Fusarium oxysporum Schlecht f.sp. cubense,
53
Riyanto, S., 2007, Identification Of The Isolated Compounds from Zingiber
americans Bl. Rhizome, Indo. J. Chem., Vol.7, No.1, Hal. 93-96.
Rout, K.K., Mishra, S.K., and Sherma, J., 2009, Development and Validation of an HPTLC Method for Analysis of Zerumbone, the Anticancer Marker from Zingiber zerumbet, Acta Chromatographica, 443-452.
Sakinah., S.A., Handayani, S.T., dan Azimahtol, L.P., 2007, Zerumbone induced apoptosis in liver cancer cells via modulation of Bax/Bcl-2ratio. Cancer
cell Int., Vol.7, No.4.
Somchit, N.M., Shukriyah, N.M.H., Bustamam, A.A., dan Zuraini, A., 2005, Antipyretic and Analgesic Activity of Zingiber zerumbet, International
Journal of Pharmacology, Vol.1, No.3, 277-280.
Syamsuhidayat, S.S., dan Hutapea, R.J., 2000, Inventaris Tumbuhan Obat
Indonesia (I), Jilid 1, 247-250, Badan Penelitian dan Pengembangan
Kesehatan, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Sher , C.J. (1996). Cancer cell cycles. Science. 274, 1672-1676.
Sledge Jr., G.W. and Miller, K.D., 2003, Review exploiting the hallmarks of cancer: the future conquest of breast cancer, Eur. J. Cancer, 39, 1668– 1675.
Takashi, K., Kaneyoshi, Y., Ryutaro, U., Masahiro, T., Richard, K., Yasushi, K., Seiji, S., and Tadashi, O., 2001, Chemistry of Zerumbone. 2. Regulation of Ring Bond Cleavage and Unique Bacterial Activities of Zerumbone Derivates, Biosci. Biotechnol. Biochem, 2193-2199.
Tanaka, T., Shimizu, M., Kohno, H., Yoshitani, S., dan Ysukio, Y et al., 2001, Chemoprevention azoxymethane-induced rat aberrant cypt foci by dietary zerumbone isolated from Zingiber zerumbet, Life Sci., 69, 1935-1945.
Taraphdar, A.K., Roy, M., Bhattacharya, R.K., 2001, Natural Product as Inducer of Apoptosis: Implication for Cancer Theray and Prevention, Current
Science, Vol. 80, No. 11.
Tjindarbumi, D. and Mangunkusumo, R. (2002). Cancer In Indonesia, Present and Future. Jpn J Clin Oncol. 32(Supplement 1) S17-S21.
54
Plants. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 25(6), 753-760. doi:10.1248/bpb.25.753
Wahab, S.I.A., Abdul, A.B., Alzubairi, A.S., Elhassan, M.M., dan Mohan, S., 2009, In Vitro Ultramorphological Assessment of Apoptosis Induced by Zerumbone on (HeLa), Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2009.
Walker, R.A., Jones, J.L., Chappel, S., Walsh, T., and Shaw, J.A., 1997, Molecular pathology of breast cancer and its aplication to clinical management,
Cancer and Metastatis Rev., 16, 5-27
Xuan, D. N. et al, 1993, Constituents of the rhizome oil of Zingiber zerumbet (L.)
Sm. from Vietnam, Journal of Essential Oil Research, 5-5 : 553-555
Yadav, N.P., and Dixit, V.K., 2008, Recent Approaches in Herbal drug Standardization, IJIB, Vol 2:3, 195-203
Zeng et al. (2008). Recent advances in the compound-oriented and pattern-oriented approaches to the quality control of herbal medicines. Chinese
Medicine. 3:9 doi:10.1186/1749-8546-3-9.
