KANDIDAT VAKSIN IRADIASI Streptococcus agalactiae UNTUK
PENCEGAHAN MASTITIS SUBKLINIS PADA RUMINANSIA
BOKY JEANNE TUASIKAL
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi yang berjudul: “Kandidat Vaksin Iradiasi Streptococcus agalactiae Untuk Pencegahan Mastitis Subklinis pada Ruminansia” adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Agustus 2012
BOKY JEANNE TUASIKAL. Streptococcus agalactiae Irradiated Vaccine Candidate for Subclinical Mastitis Prevention in Ruminants. Under supervision of Fachriyan H. Pasaribu, Sri Estuningsih, I Wayan T. Wibawan.
Subclinical mastitis (SCM) is a disease that often infects dairy cow, which then decline milk production. Streptococcus agalactiae is well known as a dominant causative agent of SCM.
An experiment to obtain gamma irradiated candidates vaccine of S. agalactiae for the prevention of subclinical mastitis in ruminants have been conducted. S. agalactiae bacteria selected for the
irradiated vaccine material was isolated from dairy cows of subclinically mastitis from dairy farm in Bogor and Garut area. The S. agalactiae used in this experiment was group B (GBS) type, which is uncapsulated and has haemaglutynine (Hn+) property. Based on dose irradiation orientation, 17 Gy dose was found to weaken the GBS bacteria to have 50% lethal dose (LD50), which therefore, utilized to manufacture live vaccine. Irradiated GBS surface protein was characterized by SDS-PAGE and resulted to find more than 75 kDa of the protein’s molecular weight, where minimun of antigenically substance is 10 kDa. Infecting of the irradiated GBS using mice resulted in lack pathogenic properties of the bacteria, which is histophatology drawn that the mammary gland alveolly of mice grouped vaccinated with irradiated GBS and vaccinated then challenge, were remain producing milk, and significantly not different as compare to control animal. GBS vaccine irradiation did not cause inflammation of the mammary glands of mice tested, evidences showed that number of udder interstitial inflammatory cells around alveolly and gland epithelial cells in vaccinated mice groups were not significantly different as compare to the control group. Most interstitial inflammatory cells in challenged groups are found in mice that were challenged with virulent GBS and significantly different to be found more as compare to vaccine and control groups. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) to Ig-G serum showed levels of higher immune response in mice vaccinated group compare to control group. The overall experiment confirmed that attenuated GBS using gamma ray irradiation capable to induce immune response. This evidences were confirmed by an observation result in the application of GBS irradiated vaccine at Etawah dairy-goat, where immune responses are induced in those dairy-goats, and also were showed by the evidences found of higher concentration of Ig-G serum by ELISA in the vaccinated group than the control group. Milk production of vaccinated goat had no effect by vaccination. In summarize, irradiated SGB vaccine does not affect milk yield.
BOKY JEANNE TUASIKAL. Kandidat Vaksin Iradiasi Streptococcus agalactiae untuk Pencegahan Mastitis Subklinis pada Ruminansia. Dibawah bimbingan Fachriyan H. Pasaribu, Sri Estuningsih, I Wayan T. Wibawan.
Mastitis subklinis (MSK) adalah penyakit yang sering menyerang sapi perah sehingga menyebabkan turunnya produksi susu. Streptococcus agalactiae dikenal sebagai bakteri dominan yang umum menyebabkan MSK. Untuk mengantisipasi kasus ini, telah dilakukan suatu penelitian untuk memperoleh kandidat vaksin iradiasi gamma S. agalactiae untuk pencegahan MSK pada ruminansia. Sebanyak 65 ekor sapi perah yang terdiri dari 19 ekor berasal dari Kunak Kabupaten Bogor, serta 25 ekor dari Cisurupan dan 21 ekor dari Bayongbong Kabupaten Garut, telah diuji untuk MSK menggunakan reagen California Mastitis Test (CMT). Total sampel susu yang diambil dari tiap puting sapi adalah sebanyak 240 sampel yang berasal dari Kunak (66 sampel), Cisurupan (97 sampel) dan Bayongbong (77 sampel). Hasil uji CMT menunjukkan bahwa proporsi kejadian MSK berturut-turut dari daerah terinfeksi tertinggi ke daerah terendah
yaitu Kunak (100%), Cisurupan (94,84%) dan Bayongbong (93,50%). Dari sampel susu kasus MSK tersebut diperoleh 57 genus Streptococcus sp. dari hasil uji Gram positif dan katalase negatif dengan persentase kehadiran dalam sampel dari Kunak (40,90%), Cisurupan (15,22%) dan Bayongbong (22,22%). Selanjutnya 34 isolat S. agalactiae diperoleh dengan uji keberadaan faktor Christie, Atkins, Munch-Petersen (CAMP) pada media agar darah. Hasil pengelompokkan dengan Streptococcal grouping kit diperoleh 14 isolat S. agalactiae group-B (SGB). Ekspresi fenotip protein permukaan bakteri tanpa kapsul diidentifikasi dengan penanaman SGB pada media soft agar (SA), sedangkan sifat adhesi SGB diuji dengan reaksi hemaglutinasi. Bakteri terpilih untuk bahan vaksin iradiasi ini diperoleh dari kasus mastitis subklinis di peternakan daerah Kunak Bogor, yaitu satu isolat S. agalactiae group-B (SGB) yang tidak berkapsul dan memiliki sifat Hemaglutinin (Hn+). Berdasarkan orientasi dosis iradiasi gamma dengan sumber
60Co diketahui dosis sebesar 17 Gy untuk melemahkan bakteri SGB terpilih sampai taraf
Lethal dose 50% (LD50) untuk pembuatan vaksin hidup. Dosis iradiasi SGB tersebut diperoleh dari
bersifat antigenik karena BM lebih dari 10 Kda (syarat BM minimal suatu protein bersifat antigenik). Uji patogenitas dan imunitas pada hewan percobaan mencit betina jenis Balb-C, berumur 8 minggu dengan bobot badan kira-kira 50 gram. Sebanyak 12 ekor mencit dibagi kedalam 4 kelompok perlakuan, menjadi 3 ekor untuk tiap kelompok yaitu kelompok vaksin (V)
diberi SGB Hn+ iradiasi, kelompok vaksin dan tantang (VT) diberi vaksin iradiasi lalu ditantang dengan SGB Hn+; kelompok tantang (T) diinfeksi dengan SGB Hn+, dan kelompok kontrol (K) tanpa vaksin dan tanpa tantang. Hasil perhitungan alveol produktif kelenjar mamae mencit adalah 70,9±13,2; 77,1±13,7; 72,5±17,8; 60,4±14,0, masing-masing untuk kelompok hewan coba K, V, VT, dan T. Hasil tersebut menunjukkan bahwa SGB iradiasi tidak patogen, terbukti dari gambaran histopatologi (HP) bahwa sel-sel pada alveol kelenjar mamae dari kelompok yang diberi vaksin SGB iradiasi (V) dan kelompok vaksin kemudian ditantang dengan SGB tanpa iradiasi (VT), masih memproduksi susu dan jumlah alveol kelenjar tidak berbeda nyata dibanding dengan kelompok kontrol (K) atau mencit normal; jumlah alveol kelenjar mamae yang paling sedikit berproduksi ada pada kelompok mencit yang ditantang dengan SGB ganas tanpa divaksin (T). Hasil perhitungan sel epitel terdeskuamasi dari kelenjar mamae mencit K=8,8±7,2; V=8,1±0,7; VT=5,9±2,3; T=9,7±3,1 ; sedangkan perhitungan sel radang interstisial disekitar kelenjar mamae mencit K=23,0±1,1; V=11,8±6,4; VT=14,5±10,7; T=41±5,9. Hasil pemeriksaan kedua parameter tersebut menunjukkan bahwa vaksin SGB iradiasi juga tidak menimbulkan peradangan pada kelenjar mamae mencit yang diuji, dibuktikan dari jumlah sel radang interstisial disekitar alveol mamae dan sel epitel kelenjar yang terdeskuamasi pada kelompok mencit yang divaksin (V) tidak berbeda nyata bahkan lebih sedikit dibanding dengan kelompok kontrol (K); sel radang interstisial terbanyak pada kelompok mencit yang ditantang dengan SGB ganas (T),
pemberian vaksin iradiasi SGB tidak mengganggu produksi susu.
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritikan, atau
tinjauan suatu masalah.
Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
PENCEGAHAN MASTITIS SUBKLINIS PADA RUMINANSIA
BOKY JEANNE TUASIKAL
B361070021
Disertasi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor pada Mayor Ilmu Biomedis Hewan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Penguji Luar Komisi Pembimbing
Ujian Tertutup:
1. Drh. Kamaluddin Zarkasie, Ph.D. 2. Dr. drh. Agustin Indrawati M.Biomed
Ujian Terbuka:
Nama : Boky Jeanne Tuasikal
NRP : B361070021
Program Studi : Mayor Ilmu Biomedis Hewan
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. drh. Fachriyan Hasmi Pasaribu Ketua
Dr. drh. Sri Estuningsih, M.Si., APVet Prof. Dr. drh. I Wayan T. Wibawan, MS
Anggota Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Mayor Ilmu Biomedis Hewan
drh. Agus Setiyono, MS. PhD.APVet Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr.
Penulis memanjatkan puji dan syukur ke Hadirat Allah SWT Yang Maha Kuasa, Maha Pengasih dan Penyayang, atas berkat rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan pascasarjana program doktor serta melaksanakan tugas penelitian dan penulisan disertasi ini.
Pada kesempatan yang membahagiakan ini, penulis menyampaikan penghargaan yang sangat dalam dan hormat, serta rasa terima kasih yang tulus kepada yang terhormat Bapak Prof. Dr. drh. Fachriyan H. Pasaribu, selaku ketua Komisi Pembimbing yang telah memberikan bimbingan dan pengarahan sejak penulis mempersiapkan judul disertasi, membuat proposal, melaksanakan penelitian, dan membuat laporan berupa disertasi ini. Penghargaan yang dalam, rasa hormat yang tinggi disertai rasa terima kasih yang tulus ditujukan pula kepada Ibu Dr. drh. Sri Estuningsih, M.Si.APVet. dan Bapak Prof. I Wayan T. Wibawan, MS selaku anggota komisi pembimbing atas segala bimbingan, arahan, nasihat, dan dorongan semangat yang telah diberikan dengan penuh tanggung jawab selama penulis belajar, mempersiapkan, dan melakukan penelitian di Institut Pertanian Bogor hingga penulisan disertasi ini selesai.
Penulis menyampaikan terima kasih dan penghargaan kepada Ketua Mayor Ilmu Biomedis Hewan, Bapak drh. Agus Setiyono, MS. PhD. APVet. dan Ketua Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan IPB, Bapak Prof. drh. Bambang Pontjo
Priosoeryanto, MS, PhD. yang telah berkenan memberikan ijin kepada penulis untuk mengikuti program doktor pada Mayor Ilmu Biomedis Hewan di Departemen Klinik, Reproduksi dan
Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan IPB.
Kepada yang terhormat Bapak Rektor Institut Pertanian Bogor beserta jajarannya, Direktur Program Pascasarjana beserta staf, penulis menyampaikan rasa hormat dan terima kasih serta penghargaan atas ijin dan kesempatan yang diberikan untuk mengikuti pendidikan program doktor di IPB sejak tahun 2007.
maupun bantuan secara moril dan materil yang telah diberikan kepada penulis. Demikian pula rasa terima kasih penulis sampaikan kepada yang terhormat Dekan Fakultas Kedokteran Hewan IPB, Bapak drh. Srihadi Agungpriyono, PhD, PAVet., Penanggung jawab Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Hewan IPB, Penanggung jawab Laboratorium Hewan Percobaan Bagian
Patologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB, dan Penanggungjawab Laboratorium Mikrobiologi Medis Fakultas Kedokteran Hewan IPB atas ijin dan kesempatan yang diberikan untuk menggunakan fasilitas laboratorium selama penulis melakukan penelitian. Terima kasih penulis sampaikan kepada semua staf pengajar, para teknisi laboratorium di lingkungan Institut Pertanian Bogor yang telah membantu terselenggaranya penelitian ini.
Penulis sampaikan pula rasa terima kasih dan penghargaan kepada Deputi Bidang Dinamika Masyarakat selaku penanggungjawab Program Pascasarjana Kementrian Negara Riset dan Teknologi (KMNRT) yang telah memberikan beasiswa kepada karya siswa untuk melanjutkan Program Doktor di Pascasarjana IPB.
Kepada ayahanda (alm) dan ibunda serta kakak dan adik-adik tercinta, penulis menyampaikan rasa terima kasih yang sedalam-dalamnya dan penghargaan yang setinggi-tingginya atas doa restu, bimbingan, didikan, serta dorongan semangat sejak lahir hingga penulis mencapai jenjang pendidikan ini.
Terima kasih yang tulus dan penghargaan setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada suami dan anak-anak tercinta yang dengan setia, penuh kasih, sabar, dan penuh pengertian mendoakan, memberikan dorongan semangat, berkorban, serta mendampingi penulis sehingga penulis dapat menghargai waktu dan kesempatan yang diberikan dalam menyelesaikan penelitian dan disertasi ini.
Penulis menyadari, bahwa karya ilmiah ini belum sempurna, oleh sebab itu dengan rendah hati, penulis mengharapkan kepada seluruh pembaca untuk memberikan saran-saran yang bermanfaat demi kesempurnaan karya tulis ini sehingga dapat bermanfaat bagi semua pihak yang membutuhkannya.
Bogor, Agustus 2012
Penulis dilahirkan pada tanggal 13 Agustus 1963 di Jakarta, sebagai anak kedua dari
enam bersaudara dari ayah H. Umar Tuasikal (alm) dan ibu Hj. Syarifah Hadiyati. Penulis
menikah dengan drh. Zainul Zakir pada tahun 1989 dan dikaruniai seorang putra, Muhammad
Hafizh Dewantara, S.Ked. dan seorang putri, Hanifah Septianti.
Setelah lulus SMA Negeri 2 Bandung pada tahun 1982, penulis melanjutkan pendidikan
di Tingkat Persiapan Bersama Institut Pertanian Bogor. Pada tahun 1983, penulis melanjutkan
pendidikan di Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor dan lulus sebagai Sarjana
Kedokteran Hewan pada tahun 1986. Kemudian penulis mengikuti Program Pendidikan Profesi
Dokter Hewan dan lulus sebagai Dokter Hewan pada tahun 1987. Penulis melanjutkan
pendidikan Program Magister pada bidang studi Sains Veteriner Program Pascasarjana IPB dan
lulus pada tahun 2005.
Sejak tahun 1989 hingga sekarang, penulis adalah staf peneliti di Kelompok Kesehatan
dan Reproduksi Ternak, Bidang Pertanian, Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi, Badan
Tenaga Nuklir Nasional. Pada tahun 2007, penulis melanjutkan pendidikan program Doktor pada
bidang Ilmu Biomedis Hewan di Sekolah Pascasarjana IPB. Selama studi S3 penulis mendapat
bantuan beasiswa dari Program Pascasarjana Kementrian Negara Riset dan Teknologi
Halaman
7. Vaksin Iradiasi Sinar Gamma ………... 15
BAHAN DAN METODE ………
191. Tempat dan Waktu Penelitian ………... 19
2. Sampel Susu ……….. 19
3. Pemeriksaan Mastitis Subklinis Secara Tidak Langsung ……….. 19
4. Pemeriksaan Mastitis Subklinis Secara Langsung ……… 20
5. Identifikasi dan Isolasi S. agalactiae……….. 20
5.1. Pemeriksaan Morfologi Koloni Bakteri ………. 21
5.3. Uji Katalase ……… 22 5.4. Uji Christie, Atkins and Munch-Petersen (CAMP) ..………. 22 5.5. Uji Serogrup S. agalactiae ………. 23 5.6. Ekspresi Fenotipe SGB in vitro……….. 23
5.7. Uji Hemaglutinasi ……….. 24
6. Orientasi Dosis Iradiasi Sinar Gamma SGB untuk LD50 ……….. 24
7. Karakterisasi Antigenik Permukaan SGB dengan SDS PAGE …………. 25 8. Uji Patogenitas dan Imunitas dengan Hewan Model Mencit ……… 26 9. Aplikasi Kandidat Vaksin Iradiasi Terpilih pada Kambing Perah ……… 27
10. Rancangan Penelitian ……… 27
HASIL DAN PEMBAHASAN ………
291. Kejadian Mastitis Subklinis di Daerah Pengambilan Sampel Susu …….. 29 2. Isolat SGB Terpilih sebagai Bahan Vaksin Iradiasi Mastitis Subklinis…. 33 3. Orientasi Dosis Iradiasi SGB untuk LD50 ... 43
4. Hasil Uji Patogenitas dan Imunitas pada Hewan Model Mencit ……….. 45 5. Hasil Uji Respon Imun dan Produksi Susu pada Kambing Perah……….. 51
SIMPULAN DAN SARAN ………
551. Simpulan ……… 55
2. Saran ……….. 55
DAFTAR PUSTAKA
………
57DAFTAR TABEL
Halaman
1. Kejadian MSK pada Wilayah Cisurupan, Bayongbong dan KUNAK…… 30
2. Jumlah Mikroba dalam Sampel Susu dari Uji Total Plate Count (TPC)…. 32
3. Presentasi Kehadiran Streptococcus sp. pada Susu dengan Uji Katalase… 36
4. Jumlah Isolat S. agalactiae dengan uji CAMP ………... 36
5. Jumlah Isolat S. agalactiae dari Uji Grouping Kit………. 38
6. Pola Pertumbuhan S. agalactiaepada Media SA, SSA dan THB ……….. 39
7. Pengamatan persen viabilitas SGB akibat iradiasi sinar gamma pada
berbagai dosis untuk LD50……….. 43
8. Hasil perhitungan kelenjar mamae mencit pada empat kelompok
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Phenomena “Gunung es” pada mastitis subklinis……… 10 2. Hasil CMT memperlihatkan kekentalan yang terbentuk akibat
pencampuran susu dengan reagen uji ………... 30 3. Tampilan koloni Streptococcus sp. pada media BAP ………... 34 4. Pola hemolisis Streptococcus sp. pada media BAP ………... 34 5. Tampilan mikroskopik Streptococcus sp. Gram positif ………... 35 6. Hasil uji CAMP positif dan negatif ………... 37 7. Bentuk koloni S. agalactiae pada media SA dan SSA ………... 40 8. Perhitungan Dosis Iradiasi gamma untuk melemahkan SGB
sampai taraf LD50 ………. 43
9. Visualisasi pita protein SGB iradiasi 0 Gy dan 17 Gy
pada BM 75 – 225 kDa………. 44 10. Gambaran Histopatologi Kelenjar Mamae Mencit Kelompok Kontrol…… 47 11. Gambaran Histopatologi Kelenjar Mamae Mencit Kelompok Vaksin……. 47 12. Gambaran Histopatologi Kelenjar Mamae Mencit Kelompok
Vaksin+Tantang ……….. 48 13. Gambaran Histopatologi Kelenjar Mamae Mencit Kelompok Tantang…... 48 14. Titer Ig-G kelompok mencit yang divaksin SGB iradiasi
dibanding kelompok mencit kontrol ……… 50 15. Titer Ig-G kelompok vaksin SGB iradiasi kemudian ditantang
dibandingkan dengan kelompok kontrol ……….. 50 16. Konsentrasi Ig-G serum kambing yang telah divaksin
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Identifikasi S. agalactiae Grup-B ……… 67
2. Karakterisasi SGB tanpa kapsul, keberadaan Antigen Protein dan
Hemaglutinin positif (Hn+) ………... 68
3. Pengamatan Pertumbuhan SGB Hn+ ………... 69
4. Prosedur Orientasi Dosis Iradiasi untuk Penentuan LD50………. 70
5. Iradiator Gamma Chamber dengan Sumber Isotop 60Co ………... 71
6. Jadwal Perlakuan dan Parameter Penelitian pada Hewan Model Mencit... 72
7. Pembuatan Preparat Histopatologi Kelenjar Mamae Mencit ………... 73
8. Ekstraksi Antigen SGB untuk coating Ag pada ELISA ……… 75
PENDAHULUAN
1. Latar Belakang
Usaha peternakan mempunyai potensi untuk dapat berkembang pesat di Indonesia, mengingat cukupnya ketersediaan pakan dan keragaman jenis ternak yang
ada. Salah satu upaya pemerintah untuk meningkatkan konsumsi protein hewani bagi penduduk Indonesia adalah dengan mengembangkan peternakan sapi perah, yang telah dimulai sejak zaman Hindia Belanda hingga saat ini (Subandriyo dan Adiarto 2009). Hal ini terlihat dengan meningkatnya populasi sapi perah dari tahun ke tahun, yaitu dari 369.008 ekor pada tahun 2006 menjadi 457.577 ekor pada tahun 2008, dan terus meningkat menjadi 597.129 ekor pada tahun 2011 (Dirjen Peternakan dan Kesehatan Hewan 2011). Kesadaran masyarakat yang meningkat tentang nilai gizi serta kebutuhan konsumsi akan protein hewani, khususnya susu juga turut mendukung berkembangnya usaha peternakan rakyat. Susu merupakan sekresi yang dihasilkan oleh kelenjar mamae mamalia termasuk manusia, dan merupakan bahan makanan sempurna serta mempunyai nilai gizi yang tinggi. Bayi membutuhkan susu sebagai satu-satunya bahan makanan dalam beberapa bulan di awal kehidupannya. Hingga saat ini susu sapi masih dianggap sebagai sumber makanan utama yang dapat menggantikan air susu ibu (ASI). Susu sapi merupakan bahan makanan istimewa bagi manusia karena kelezatan dan komposisinya yang ideal yaitu mengandung banyak zat yang dibutuhkan oleh tubuh seperti lemak, protein terutama casein, laktosa, vitamin, mineral seperti kalsium, dan lain-lain (De Laval 2008, Mirdhayati dkk. 2008). Konsumsi susu penduduk Indonesia semakin meningkat dari tahun ke tahun, yaitu 6,50 kg/ kapita/ tahun pada tahun 2004 menjadi 16,42 kg/ kapita/ tahun pada tahun
2
Kendala yang sering menghambat keberhasilan suatu usaha peternakan adalah serangan penyakit. Salah satu penyakit penting yang dapat menurunkan produksi susu pada ternak sapi perah yaitu Mastitis yang dikenal juga sebagai penyakit radang kelenjar air susu (mamae). Penurunan produksi susu merupakan masalah bagi peternak sapi perah Indonesia yang umumnya hanya memelihara 3-4 ekor sapi tiap peternak. Sebagian besar peneliti setuju bahwa kerugian ekonomi akibat mastitis pada usaha sapi perah minimal sebanyak 70% yang diakibatkan oleh penurunan produksi susu dan dibuangnya susu yang berasal dari sapi mastitis (Bogni et al. 2011). Penyakit mastitis secara garis besar dibagi menjadi 2 tipe, pertama yaitu mastitis klinis yang menunjukkan gejala kesakitan pada mamae ternak maupun kerusakan
pada susu, dan kedua adalah mastitis subklinis yang tidak menampakkan gejala peradangan pada mamae kecuali bila dilakukan pemeriksaan pada air susu dengan uji khusus contohnya California Mastitis Test (CMT) (Dirkeswan. 2001). Sebagaimana negara-negara lain, di Indonesia-pun kasus yang lebih banyak terjadi yaitu mastitis subklinis (Supar 1997, Subronto 2003, Hashemi et al. 2011). Kasus mastitis terutama mastitis subklinis di Indonesia sampai akhir tahun 2006, tercatat sekitar 75% - 83% (Sudarwanto dkk. 2006).
Mastitis dapat disebabkan oleh beberapa faktor, yakni cara pemerahan yang salah, sanitasi yang buruk, kandang yang kurang bersih dan lantai kandang yang tidak memenuhi persyaratan untuk sapi perah. Penyebaran penyakit ini dapat melalui pemerahan yang tidak mengindahkan kebersihan, alat pemerahan, kain pembersih puting dan pencemaran dari lingkungan. Kuman penyebab mastitis dari kandang yang kotor akan masuk ke dalam mamae melalui lubang dan kanal puting saat pemerahan atau ketika sapi duduk di lantai kandang. Kuman yang potensial menyebabkan mastitis adalah Streptococcus agalactiae, Streptococcus digalactiae, Steptococcus uberis dan Staphylococcus aures (Dirkeswan. 2001). Streptococcus agalactiae adalah salah satu agen utama penyebab mastitis subklinis pada sapi perah. Hasil studi Estuningsih dkk. (2002) menyebutkan bahwa 83 isolat bakteri yang diisolasi dari 3 area peternakan sapi perah di pulau Jawa, seluruhnya teridentifikasi sebagai
Grup- B (SGB). S. agalactiae lebih banyak dikenal di dalam dunia kedokteran hewan sedangkan SGB populer di kedokteran manusia. Diketahui pula bahwa S. agalactiae grup B (SGB) merupakan bakteri utama penyebab mastitis subklinis pada sapi perah dan merupakan parasit obligat pada mamae (Wahyuni dkk. 2006). S. agalactiae juga dilaporkan dapat menginfeksi anjing, babi, kelinci, kuda, dan merpati. Bakteri ini menyebabkan abortus dan servitis pada kuda dan babi, bahkan dapat menyerang ikan (Pasaribu et al. 1993, Evans et al. 2006).
Berbagai macam antibiotik untuk mengatasi permasalahan mastitis telah banyak digunakan seperti penisilin, streptomisin, ampisilin, kloksasilin, dan lain sebagainya. Pengobatan mastitis dengan menggunakan antibiotik terutama ditujukan
untuk membunuh bakteri penyebab mastitis, namun dengan banyaknya macam obat antibiotik yang dipergunakan dan cara pemberian dosis yang tidak terkontrol, maka dikhawatirkan menimbulkan permasalahan baru berupa resistensi kuman penyebab mastitis (Wu et al. 2007) dan terdapat residu obat pada susu yang dihasilkan. Hasil penelitian Sudarwanto dkk. (1992) menunjukkan 32,52% susu pasteurisasi dan 31,10% susu segar di wilayah Jakarta, Bogor dan Bandung mengandung residu antibiotik dalam jumlah yang cukup tinggi. Keberadaan residu antibiotik pada susu yang dikonsumsi dapat menyebabkan terjadinya reaksi alergis dan gangguan terhadap mikroflora saluran pencernaan manusia yang mengkonsumsi susu tersebut. Susu yang akan diekspor-pun diharuskan bebas dari residu antibiotik oleh negara pengimpor. Penggunaan dan pemilihan antibiotik yang tidak tepat, ditinjau dari aspek indikasi, dosis, waktu dimulainya dan lamanya terapi, serta penggunaan kombinasi antibiotik dapat mempercepat terjadinya resistensi bakteri. Mastitis subklinis yang disebabkan oleh bakteri Gram posisif semakin sulit ditangani dengan antibiotik karena bakteri ini sudah banyak yang resisten terhadap berbagai jenis antibiotik (Wibawan 1998, Maricato et al. 2005).
4
terhadap antibiotik dan residunya pada susu, serta masih banyaknya kejadian mastitis subklinis, maka menjadikan perlu untuk mencari alternatif lain dalam pencegahan penyakit ini, salah satunya dengan pembuatan vaksin. Pemanfaatan iradiasi dalam pembuatan vaksin dimaksudkan untuk melemahkan patogenitas S. agalactiae sebagai bakteri dominan penyebab mastitis, namun bakteri ini diharapkan masih dapat menimbulkan respon tanggap kebal sebagai bahan vaksin iradiasi. Sumber-sumber sinar gamma yang digunakan untuk iradiasi kandidat vaksin dihasilkan dari radioisotop 60Co. Penggunaan sinar gamma memiliki keunggulan dibandingkan dengan teknik konvensional seperti pemanasan atau penggunaan zat kimia. Sinar gamma yang menembus tidak merusak dinding sel bakteri tempat protein antigenik
sehingga mampu mempertahankan imunogenitasnya (Kochman 2006). Sel yang terpapar radiasi gamma akan kehilangan kemampuan replikasinya di dalam tubuh inang, namun tidak menghentikan aktivitas metaboliknya. Sel tetap mempunyai metabolik aktif, sehingga mampu menghasilkan senyawa imunogenik untuk menstimulasi respon imun protektif pada inang (Sanakkayala 2005).
2. Perumusan Masalah
Berbagai aspek mengenai mastitis secara umum telah banyak diteliti tetapi belum ada cara pencegahan mastitis yang efektif diaplikasikan pada ternak sapi perah, sehingga kasus mastitis subklinis yang merugikan masih tetap terjadi di Indonesia. Penelitian ini mencoba turut berkontribusi dalam penyelesaian masalah tersebut dengan pembuatan bahan vaksin iradiasi dari bakteri terpilih S. agalactiae untuk pencegahan mastitis subklinis pada ternak ruminansia.
3. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan kandidat vaksin guna pencegahan mastitis subklinis pada ruminansia dengan memanfaatkan teknik radiasi terhadap bakteri dominan penyebab mastitis subklinis S.agalactiae.
1. Mengisolasi S. agalactiae sebagai bakteri terpilih dengan sifat-sifat atau karakter yang cocok untuk bahan vaksin iradiasi mastitis subklinis.
2. Orientasi dosis iradiasi sinar gamma untuk melemahkan S. agalactiae Group -B sampai taraf lethal dose 50% (LD50).
3. Menguji pengaruh iradiasi SGB dengan mempelajari patogenitasnya pada mencit.
4. Menguji imunitas hewan coba mencit dan kambing perah setelah divaksin dengan SGB iradiasi.
4. Hipotesis Penelitian
Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
1. Diperoleh isolat lokal S. agalactiae dari kasus mastitis subklinis sebagai bakteri terpilih untuk bahan vaksin iradiasi MSK.
2. Iradiasi sinar gamma dapat melemahkan bakteri S. agalactiae Group-B sampai taraf LD50.
3. Kandidat vaksin iradiasi SGB tidak bersifat patogen pada hewan coba mencit namun menimbulkan kekebalan.
4. SGB iradiasi mampu menginduksi timbulnya respon imun pada hewan coba mencit dan kambing perah.
5. Manfaat Penelitian
Manfaat yang diharapkan adalah sebagai berikut:
1. Penelitian ini dapat memperoleh kandidat vaksin SGB terpilih dengan karakter yang cocok sebagai bahan vaksin mastitis subklinis.
2. Teknik nuklir iradiasi sinar gamma dapat bermanfaat untuk melemahkan dan menghilangkan patogenitas SGB tetapi masih mampu menimbulkan respon imun pada hewan percobaan yang digunakan.
6
produksi susu sebagai sumber protein hewani dalam mendukung ketahanan pangan di Indonesia.
6. Kebaruan
Kebaruan dari penelitian dalam disertasi ini adalah aplikasi teknik nuklir untuk vaksin iradiasi S. agalactiae dalam pencegahan mastitis subklinis. Pemanfaatan iradiasi sinar gamma dimaksudkan untuk mengatenuasi bakteri S. agalactiaeGroup-B sebagai bakteri dominan penyebab mastitis subklinis, namun kandidat vaksin ini diharapkan masih dapat menimbulkan respon imun pada ternak perah.
7. Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian terdiri dari empat tahap. Pertama dilakukan isolasi dan identifikasi isolat S. agalactiae yang termasuk ke dalam group-B (SGB) yang tidak berkapsul dan memiliki sifat Hemaglutinin (Hn+). Bakteri terpilih diperoleh dari sampel susu sapi perah yang mengalami mastitis subklinis dengan uji tapis CMT. Tahap kedua yaitu atenuasi SGB terpilih dengan teknik iradiasi sinar gamma dari sumber isotop Cobalt-60 (60Co). Orientasi dosis iradiasi dilakukan untuk melemahkan bakteri SGB sampai taraf Lethal dose 50% (LD50) dalam
TINJAUAN PUSTAKA
1.Mastitis
Mastitis merupakan peradangan di dalam parenkim kelenjar mamae, yang dapat menurunkan produksi dan kualitas susu. Penyakit ini tersebar luas pada peternakan perah di Indonesia maupun di berbagai belahan dunia, sehingga mastitis menjadi penyakit utama pada sapi perah dan sangat merugikan (Supar dan Ariyanti
2008, Rinaldi et al. 2010).
Mastitis dapat disebabkan oleh berbagai hal, mulai dari trauma mekanis pada
kelenjar mamae atau puting susu, akibat mikroorganisme patogen, hingga kekurangan unsur nutrisi pada pakan ternak. Sebagian besar kasus mastitis disebabkan oleh mikroorganisme patogen, diantaranya Streptococcus agalactiae, S. disgalactiae, S. uberis, S. zooepidemicus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa (Dirkeswan 2001).
Berdasarkan perubahan patologi anatomi kelenjar mamae, mastitis dapat dibedakan menjadi dua tipe, yaitu mastitis klinis (MK) dan mastitis subklinis (MSK) (Hashemi et al. 20011). Perubahan patologi mastitis klinis dapat jelas digambarkan dari perubahan patologi anatomis kelenjar mamae dan air susu. Kelenjar mamae membengkak edematus berisi cairan eksudat, disertai tanda-tanda peradangan lainnya (kemerahan, terasa panas, kesakitan dan penurunan fungsi). Perubahan penting yang terjadi di dalam susu mencakup perubahan warna, konsistensi dan penurunan jumlah produksi susu.
8
2. Patogenesa Mastitis
Mastitis merupakan peradangan internal mamae yang sebagian besar disebabkan oleh mikroorganisme (80% disebabkan oleh bakteri) terutama pada kasus mastitis subklinis (Lukman et al. 2009). Menurut Jayarao (2006) ada 3 faktor utama yang berperan dalam terjadinya mastitis yaitu kondisi hewan/ternak, kondisi lingkungan dan agen penyebab.
Duval (1997) menjelaskan bahwa proses infeksi pada mastitis terjadi melalui beberapa tahap, yaitu adanya kontak dengan mikroorganisme dimana sejumlah mikroorganisme mengalami multiplikasi di sekitar lubang puting (sphincter), kemudian dilanjutkan dengan masuknya mikroorganisme akibat lubang puting yang
terbuka ataupun karena adanya luka. Tahap berikutnya, terjadi respon imun pada induk semang. Respon pertahanan pertama ditandai dengan berkumpulnya leukosit-leukosit untuk mengeliminasi mikroorganisme yang telah menempel pada sel-sel mamae. Apabila respon ini gagal, maka mikroorganisme akan mengalami multiplikasi dan sapi dapat memperlihatkan respon yang lain, misalnya demam. Hal ini kembali pada daya tahan tubuh ternak. Ternak yang dipengaruhi kondisi lingkungan yang buruk dan berkembangnya mikroorganisme akan memudahkan terjadinya mastitis.
Penularan mastitis dari mamae yang terinfeksi ke mamae yang sehat dapat terjadi melalui peralatan pemerahan yang kotor, higiene personal yang buruk dari pemerah dan urutan pemerahan yang salah (Jayarao, 2006).
Disamping faktor-faktor mikroorganisme yang terdiri dari berbagai jenis, jumlah dan virulensinya, faktor ternak dan lingkungannya juga menentukan mudah tidaknya terjadi radang mamae pada sapi perah. Faktor predisposisi radang mamae dilihat dari segi ternak, meliputi : bentuk mamae, misalnya mamae yang sangat menggantung, atau mamae dengan lubang puting terlalu lebar (Subronto 2003). Demikian pula bentuk puting, ada dan tidaknya lesi pada puting mempengaruhi kejadian mastitis. Hasil penelitian Sori et al. (2005) menunjukkan bahwa prevalensi mastitis pada puting pendulous mencapai 77,78%, sedangkan pada puting non pendulous mencapai 50%. Puting yang mengalami lesi memungkinkan prevalensi mastitis sebesar 84%, sedangkan pada puting normal sebesar 47,74%.
Letak kuartir juga mempengaruhi kejadian mastitis. Kuartir kiri belakang dan kanan depan lebih sering mengalami mastitis daripada kedua puting lainnya. Pada kiri belakang, mastitis mencapai 34,3%, sedangkan kanan depan mencapai 30,06% (Sori et al. 2005).
Faktor umur dan tingkat produksi susu sapi juga mempengaruhi kejadian mastitis. Semakin tua umur sapi dan semakin tinggi produksi susu, maka semakin mengendur pula spinchter putingnya. Puting dengan spincter yang kendur memungkinkan sapi mudah terinfekesi oleh mikroorganisme, karena fungsi spinchter adalah menahan infeksi mikroorganisme. Semakin tinggi produksi susu seekor sapi betina, maka semakin lama waktu yang diperlukan spinchter untuk menutup sempurna (Subronto 2003).
Faktor lingkungan dan pengelolaan peternakan yang banyak mempengaruhi terjadinya radang mamae meliputi : pakan, perkandangan, banyaknya sapi dalam satu kandang, ventilasi, sanitasi kandang dan cara pemerahan susu. Pada ventilasi yang buruk, mastitis mencapai 87,5%, sedangkan ventilasi yang baik mencapai 49,39% (Sori et al. 2005).
3. Mastitis Subklinis
10
susu) dan ditemukan bakteri patogen pada susu yang berasal dari kwartir dalam masa laktasi normal. Kejadian mastitis subklinis diperkirakan 20-50 kali kejadian mastitis klinis. Hal ini sering digambarkan sebagai Fenomena Gunung Es atau Iceberg Phenomena (Lukman et al. 2009).
Gambar 1. Phenomena “Gunung es” pada mastitis subklinis (Hurley and Morrin 2000).
4. Streptococcus agalactiae
S. agalactiae merupakan jenis bakteri yang termasuk ke dalam famili Streptococcaceae dari ordo Lactobacillales. Bakteri ini berbentuk bulat (coccus) dan tersusun seperti rantai yang panjangnya bervariasi, diameter selnya sekitar 0,6-1,2 µm. Sifatnya Gram positif yang terlihat berwarna keunguan pada pewarnaan Gram, non motil, tidak membentuk spora, dan dapat membentuk kapsul. Sifat lainnya adalah katalase negatif, anaerob fakultatif, oksidase negatif, dapat memfermentasikan beberapa jenis karbohidrat namun tidak menghasilkan gas (Carter 1984, Quinn et al. 2006).
Tahun 1896 Lehman dan Naumann mengklasifikasikan bakteri ini
berdasarkan taksonomi sebagai berikut (Bruckner and Colonna 1997): Kingdom : Bacteria
Filum : Firmicutes Kelas : Bacilli
Ordo : Lactobacillales Famili : Streptococcaceae Genus : Streptococcus Spesies : S. agalactiae
Biakan S. agalactiae yang ditumbuhkan pada media agar darah terlihat membentuk koloni-koloni halus, basah, konveks, terang tembus, dan menghemolisis sel darah merah. Hemolisis yang ditimbulkan berupa -hemolisis, dan beberapa tidak menghemolisis (Daignault 2003). Strain yang menghemolisis darah hanya mengasilkan zona hemolitik tidak lebih dari 1 mm pada agar darah, sedangkan yang tidak menghemolisis dapat menghasilkan pigmen bewarna kehijauan pada media agar darah.
Secara umum Streptococcus sp memiliki antigen terstruktur pada permukaannya seperti kapsul, dinding sel, dan antigen protein. Keberadaan antigen polisakarida pada dinding sel dijadikan sebagai dasar pengklasifikasian genus
12
serologis dari antigen polisakarida yang ditemukan oleh Lancefield pada 1933. Terdapat sekitar 20 grup Streptococcus sp sampai saat ini yang dinamai sesuai abjad mulai dari A-V; S. agalactiae dikelompokan kedalam grup B oleh Lancefield. Pengelompokan ini didasari oleh substansi C polisakarida spesifik yang terdapat pada diding sel (Cowan 2003). Secara serologis Grup ini dikelompokan lagi kedalam serotipe-serotipe. Serotipe tersebut berdasarkan antigen polisakarida dan antigen protein yang dihasilkan. Beberapa serotipe tersebut terdiri dari 9 serotipe yang berbeda antara lain 1a, 1b, II, III, IV, V, VI, VII, VIII dari antigen polisakarida dan c, R dan X berdasarkan antigen proteinnya (Henrichsen et al. 1984). Wibawan dan Lammler (1991) menyatakan isolat S. agalactiae dapat memiliki serotipe dengan antigen poliskarida dalam bentuk kombinasi atau hanya berdiri sendiri tanpa antigen protein, misalnya Ia/c, II/X. Ada juga isolat yang belum bisa diklasifikasikan kedalam serotipe yang ada disebut sebagai nontypeable (NT). Antigen protein X dominan ditemukan pada S. agalactiae yang diisolasi dari sapi sedangkan antigen protein R lebih banyak ditemukan pada S. agalactiae yang berasal dari manusia. Kedua antigen ini erat hubungannya dengan patogenitas bakteri terhadap inangnya (Wibawan 1990). Wahyuni et al. (2006) menyimpulkan dari beberapa tempat di pulau jawa S. agalactiae yang berasal dari mamae yang menderita masititis subklinis ditemukan sebanyak 52% didominasi oleh S. agalactiae serotipe NT dan protein antigen yang muncul paling banyak adalah antigen protein X.
Virulensi dari Streptococcus sp dipengaruhi oleh pemukaan sel, sekresi protein yang dihasilkan dan strukturnya yang secara langsung atau tidak langsung dapat menghambat fagositosis, terlibat dalam proses adhesi dan mengakibatkan pelepasan sitokin proinflamasi (Timoney and Kumar 2010).
Streptococcus juga memiliki komponen nonstruktural seperti protein antigen. Protein tersebut dihasilkan selama masa perkembangbiakan dan membantu selama proses infeksi. Protein ini berupa enzim ekstraseluler hasil metabolisme seperti hemolisin, streptokinase, nuklease, protease, dan hyaluronidase. Hemaglutinin sebagai adhesin pada permukaan bakteri berperan mempengaruhi tingkat virulensi (Wahyuni dkk. 2005).
Adhesi adalah kemampuan menempelnya bakteri pada permukaan mukosa yang bersifat irreversibel dan stabil. Kemampuan bakteri untuk menempel (adhesi) pada sel inang diperantarai oleh komponen adesin bakteri yang membantu perlekatan bakteri pada reseptor spesifik dari sel inang. Sifat hidrofobitas permukaan bakteri berperan dalam mekanisme perlekatan dengan sel inang. Sifat ini dipengaruhi oleh jumlah protein permukaan. Semakin hidrofobik permukaan sel maka akan semakin tinggi kemampuan adhesi pada sel inang (Lämmler et al. 1998).
Derajat hidrofobitas permukaan S. agalactiae dapat ditentukan secara langsung dengan melihat pertumbuhan koloni pada media padat, cair dan agar lunak
(soft agar). Koloni yang tumbuh dengan permukaan yang kasar pada media agar dan kompak pada agar lunak merupakan bakteri yang bersifat hidrofob, sedangkan bakteri yang tumbuh difus pada media agar lunak dan permukaan mukoid pada media padat menunjukan sifat yang hidrofil (Wibawan dan Lämmler 1992).
14
keterkaitan, oleh karena itu ada peluang untuk pembuatan suatu produk pencegahan mastitis yang cukup besar (Dian dkk. 2010).
5.Sistem Imun
Manusia dan hewan multiseluler memiliki suatu sistem imun yang melindungi dirinya terhadap unsur-unsur patogen yang masuk ke dalam tubuh. Respon imun tubuh terhadap unsur-unsur patogen sangat bergantung pada kemampuan sistem imun untuk mengenal molekul-molekul asing atau antigen yang terdapat pada permukaan unsur patogen, dan kemampuan dalam melakukan reaksi yang tepat untuk menyingkirkan antigen. Kemampuan ini dimiliki oleh komponen-komponen sistem
imun yang terdapat dalam jaringan limforetikuler yang letaknya tersebar di seluruh tubuh, misalnya di dalam sumsum tulang, kelenjar limfe, thymus, sistem saluran nafas, saluran cerna, peredaran darah dan organ-organ lain. Bila antigen masuk ke dalam tubuh, maka dapat terjadi dua macam reaksi imun yang berlainan, yaitu imun humoral dan imun seluler (Baratawijaya dan Rengganis 2009). Dalam reaksi imun
humoral terjadi sintesa dan masuknya antibodi berupa Imunoglobulin (Ig) ke dalam aliran darah dan cairan tubuh lainnya (antibodi humoral). Antibodi ini akan mengikat dan menetralisir antigen, misalnya toksin kuman atau dapat membungkus kuman untuk persiapan fagositosis. Bila kita menyuntikkan antigen misalnya vaksin ke tubuh hewan percobaan, maka setelah beberapa hari sampai seminggu dapat ditemukan antibodi di dalam darah. Sel utama dalam hal ini adalah Sel-B yang diproduksi oleh sumsum tulang. Reaksi imun seluler ditengahi oleh sel-sel limfosit dan tidak tergantung pada antibodi. Seri reaksi yang terlibat dalam jenis imunitas ini dikaitkan dengan reaksi-reaksi sel sasaran efektor yang terlibat, terutama yang berkaitan dengan penolakan tumor. Pada masing-masing keadaan ini, antigen berada intraseluler atau karena tempatnya tidak dapat dicapai, sehingga reaksi antigen-antibodi tampak secara relatif tidak efisien. Sel utama yang berperan dalam hal ini adalah Sel-T yang dihasilkan oleh Thymus.
paling banyak dalam kolostrum dari semua hewan piara adalah Ig G, yang meliputi 65-95% dari semua imunoglobulin yang ada. Sementara laktasi berkembang, kolostrum berubah menjadi susu, perbedaan terjadi diantara jenis hewan. Pada primata dan manusia, Ig A merupakan bagian terbanyak baik dalam kolostrum maupun susu. Pada ruminansia, Ig G1 merupakan imunoglobulin terbanyak baik dalam kolostrum maupun dalam susu (Tizard 1988).
6. Radiasi
Radiasi merupakan energi yang dipancarkan dalam bentuk partikel atau gelombang. Radiasi diklasifikasikan sebagai radiasi non pengion (energi rendah) atau
pengion (energi tinggi). Jenis radiasi non pengion seperti sinar ultraviolet, cahaya tampak, radiasi inframerah, radiasi frekuensi radio dan gelombang mikro. Radiasi pengion dari matahari (sinar kosmik), bahan radioaktif, dan mesin X-ray. Empat jenis utama dari radiasi pengion (1) alpha partikel. bermuatan positif terdiri dari dua neutron dan dua proton, relatif berat dan bergerak lambat dari emisi radioaktif lainnya, (2) partikel beta merupakan partikel bermuatan negatif terdiri dari elektron dan lebih ringan serta cepat dibandingkan partikel alpha, (3) sinar gamma adalah radiasi gelombang elektromagnetik pendek yang dipancarkan oleh peluruhan radioaktif yang dipancarkan oleh atom dengan kecepatan tinggi dan mempunyai penetrasi yang tinggi pula, dan (4) sinar X mempunyai energi lebih rendah dan kemampuan penetrasinya kurang daripada sinar gamma. Sinar X yang dipancarkan berasal dari proses luar inti, sementara sinar gamma berasal dari inti (Soeminto 1989).
7. Vaksin Iradiasi Sinar Gamma
16
langsung adalah terjadinya pemutusan ikatan senyawa-senyawa penyusun sel. Efek tidak langsung terjadi karena materi sel terbanyak adalah air yang apabila terkena sinar gamma akan mengalami hidrolisis dan menghasilkan radikal bebas. Radikal bebaslah yang akan menyebabkan kerusakan materi sel. Target utama bagian sel adalah DNA yang merupakan sumber informasi genetik sel. Perubahan genetik sel akan berakibat pada terganggunya kinerja atau kematian sel (Alatas 2007).
Pemanfaatan sinar gamma umumnya digunakan untuk sterilisasi alat-alat medis dari cemaran bakteri (Trampuz et al. 2006), pengawetan makanan dan pengolahan jaringan allografts dan komponen darah, dan menghindarkan kebutuhan suhu tinggi yang dapat merusak suatu produk. Selain itu sinar gamma juga digunakan
untuk membuat vaksin yang lebih efektif daripada pemanasan atau inaktivasi kimiawi.
Penelitian penggunaan vaksin yang dilemahkan dengan memberikan paparan radiasi pengion terhadap suspensi mikroorganisme dilakukan pada metaserkaria iradiasi yang mampu mengurangi jumlah Fasciola hepatica pada anak sapi, penggunaan radiasi sinar X pada larva stadium kedua yang menetas dari telur cacing paru Dictyocaulus viviparus penyebab pneumoni verminosa (Tizard 1988).
Penelitian vaksin iradiasi gamma untuk Venezuelan equine encephalitis (VEE) telah menginduksi dengan tinggi serum netralisasi dan antibodi hemaglutinin-inhibisi pada marmut dan kelinci. Percobaan vaksin iradiasi ini pada kultur jaringan menyebabkan sel-sel dapat bertahan hidup sampai taraf Lethal dose-50 (LD50)
terhadap virus VEE tantangan (Reitman et al. 1970).
Vaksin lain dengan teknik iradiasi yaitu Vaksin bakteri Listeria monocytogenes iradiasi yang dapat meningkatkan respon imun dibandingkan teknik konvensional. Bakteri diiradiasi mendorong respon pelindung dari sel sistem kekebalan sel T (Kochman 2006). Sinar gamma juga digunakan untuk melemahkan Plasmodium (WHO 2001).
Tanggap kebal sapi terhadap Fasciolosis akibat inokulasi metaserkaria
pada sapi yang diinokulasi metaserkaria F. gigantica iradiasi dibandingkan dengan sapi kontrol. Sinar gamma yang dimanfaatan untuk inaktivasi yaitu radiasi elektromagnetik panjang gelombang pendek yang memiliki kemampuan penetrasi tinggi dan memiliki karakteristik tanpa memberikan radiaoaktivitas pada materi yang terpapar (Hall & Giaccia 2006).
Prospek vaksin iradiasi gamma untuk influenza sangat baik karena vaksin inaktif ini dapat diproduksi dengan aman. Inaktifasi vaksin dengan dosis 10 kGy mempunyai potensi respon imun perlindungan silang dalam melawan heterotipe virus tantangan. Iradiasi gamma ini juga mempunyai kemampuan tinggi dalam inaktifasi virus-virus dengan keuntungan yaitu perubahan yang sangat minim pada protein
molekuler dan struktur virus. Dengan adanya perlindungan silang, maka produksi vaksin bisa lebih murah. (Alsharifi dan Mullbacher 2009).
Efek metode inaktifasi dengan sinar gamma pada virus influenza-A yang dapat menginduksi perlindungan silang pada beberapa subtipe virus dan persiapan vaksin komersial ini juga dilakukan oleh Furuya et al. (2010).
BAHAN DAN METODE
1. Tempat dan Waktu Penelitian
Kegiatan dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Medik, Fasilitas Kandang Bagian Hewan Coba untuk hewan model mencit dan Laboratorium Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan - IPB. Perlakuan iradiasi bahan vaksin SGB dilakukan dalam iradiator Gamma chamber dengan sumber isotop 60Co, di Balai Iradiasi, Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi (PATIR), Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN), Jakarta. Aplikasi kandidat vaksin iradiasi SGB dilakukan pada peternakan
kmamae perah Bangun Dioro Farm, desa Palasari, Kabupaten Bogor. Penelitian dilakukan sejak Januari 2010 sampai Februari 2012.
2. Sampel Susu
Sampel susu diperoleh dari kasus mastitis subklinis sapi perah di peternakan rakyat yaitu Kawasan Usaha Ternak (KUNAK) Cibungbulang Kabupaten Bogor dan daerah Cisurupan serta Bayongbong Kabupaten Garut. Penapisan awal menggunakan
California Mastitis Test (CMT) pada 65 ekor sapi perah dengan total sampel susu yang diambil dari tiap puting sapi adalah sebanyak 240 sampel, yang berasal dari Kunak (66 sampel), Cisurupan (97 sampel) dan Bayongbong (77 sampel).
3. Pemeriksaan Mastitis Subklinis Secara Tak Langsung.
Pengujian sampel susu di lapang dilakukan dengan menggunakan uji
20
positif I (tebentuknya lendir tipis), II (terbentuk lendir lebih kental), dan III (lendir sangat kental seperti massa gelatin). Sampel dengan kekentalan positif I, II dan III dipakai sebagai sampel untuk kandidat yang dikultur pada agar darah (Ruegg 2005).
4. Pemeriksaaan Mastitis Subklinis Secara Langsung
Uji dilakukan dengan metode Total Plate Count (TPC). Pemeriksaan sampel susu terhadap jumlah total bakteri yang dapat ditemukan dalam media Plate Count Agar (PCA). Sebanyak 1 ml sampel susu dimasukkan ke dalam pengencer NaCl fisiologis 9 ml, kemudian dihomogenkan selama 1 menit, campuran ini merupakan pengenceran ke-1 (10-1). Sebanyak 1 ml pengenceran 10-1 dipindahkan ke dalam 9 ml pengencer NaCl fisiologis pada tabung yang berbeda, dan campuran ini merupakan pengenceran ke-2 (10-2). Langkah ini terus dilakukan hingga pengenceran ke-6 (10-6). Pada penelitian ini digunakan metode hitungan cawan dengan cara tuang (pour plate method). Sebanyak 1 ml dari masing-masing pengenceran tersebut di atas dipupuk di dalam cawan petri steril yang telah diberi label sesuai dengan urutan pengenceran, kemudian ditambah dengan media PCA yang telah dicairkan sebanyak 18 ml (suhu 450C). Campuran dihomogenkan dengan membuat gerakan angka 8 pada cawan petri di tempat yang datar lalu didiamkan hingga memadat dan diinkubasi didalam inkubator pada suhu 350C selama 24-48 jam dengan posisi terbalik. Pencatatan terhadap pertumbuhan koloni dilakukan setelah 48 jam pada setiap cawan yang mengandung 25-250 koloni. Langkah ini dilanjutkan dengan penghitungan angka lempeng total dalam cawan tersebut dengan mengalikan jumlah rata-rata koloni pada cawan sesuai dengan faktor pengenceran yang digunakan (Lay 1994).
5. Identifikasi dan Isolasi S. agalactiae
katalase dan keberadaan faktor Christie, Atkins dan Muence Petersen (CAMP) pada media agar darah (Quinn et al. 2006).
5.1.Pemeriksaan Morfologi Koloni Bakteri
Uji dilakukan pada media agar darah (Blood agar plate/ BAP. Kultur bakteri pada media BAP dilakukan secara aseptik untuk mencegah terjadinya pencemaran/kontaminasi pada media yang digunakan. Langkah pertama adalah memberikan label pada cawan-cawan petri yang telah berisi media Blood Agar Plate (BAP). Langkah berikutnya sampel susu kuartir diambil sebanyak 2 mata öse dan digoreskan pada agar darah. Penanaman bakteri secara aseptis dilakukan dalam
kabinet laminair flow dekat nyala api bunsen. Agar darah yang telah ditanami sampel susu kuartir, lalu diinkubasi dalam inkubator selama β4 jam pada suhu γ7˚C. Pengamatan dilakukan terhadap pertumbuhan koloni bakteri dan wilayah jernih di sekitar koloni (hemolisis). Bakteri Streptococcus memiliki bentuk koloni-koloni bulat halus, basah, cembung, terang tembus, dan menghemolisis sel darah merah. Hemolisis yang terjadi di sekeliling koloni bakteri dapat dibedakan menjadi tiga jenis, yaitu hemolisis alpha (α) berupa hemolisis sebagian yang ditunjukkan dengan zona kehijauan disekitar koloni; hemolisis beta ( ) berupa hemolisis komplit yang ditunjukkan dengan zona bening di sekeliling koloni, dan hemolisis gamma ( ) yang tidak menunjukkan perubahan warna di seputar koloni bakteri (Quinn et al. 2006).
5.2. Pemeriksaan Mikroskopi
22
makin keluar. Selanjutnya campuran yang terdapat diatas objek gelas tadi difiksasi diatas bunsen yang menyala. Kemudian preparat ini diteteskan dengan zat warna kristal violet diatas gelas objek hingga preparat tertutup, langkah ini dilakukan selama 1 menit. Setelah itu ditambahkan lugol diatas preparat tadi selama 1 menit. Preparat kemudian dicuci dengan aquadest/air kran diatas bak pewarnaan. Pencucian dilanjutkan dengan aceton alkohol selama 15 detik. Preparat kemudian dibilas sekali lagi dengan aquadest/air kran hingga bersih. Pewarnaan kemudian dilanjutkan dengan meneteskan safranin selama 15 detik pada preparat tersebut dan kemudian dibilas lagi dengan aquadest/air kran hingga bersih. Preparat yang telah dibilas kemudian dikeringkan, lalu ditetesi dengan minyak emersi dan siap untuk diamati dibawah
mikroskop dengan perbesaran 10x100 (Carter 1984). Koloni Streptococccus sp. akan terlihat berbentuk bulat (coccus), bergerombol membentuk rantai, berwarna ungu.
5.3 Uji Katalase
Uji ini dilakukan sebagai acuan untuk identifikasi bakteri yang berkarakteristik dapat memproduksi enzim katalase. Langkah yang pertama yaitu menyiapkan gelas objek atau cawan petri yang sebelumnya telah dibersihkan dengan alkohol 70% dan dikeringkan diatas api Bunsen. Pada gelas objek ini kemudian diteteskan reagen H2O2 3% sebanyak 1 tetes. Langkah berikutnya yaitu mengambil
koloni bakteri yang telah tumbuh dari Blood Agar Plate (BAP) sebanyak 1 Öse dan kemudian dicampurkan pada reagen H2O2 tadi. Reaksi memberikan hasil positif
apabila terbentuk gelembung-gelembung udara, sebaliknya reaksi memberikan hasil negatif apabila tidak terbentuk gelembung. Bakteri Streptococcus sp. akan memberikan hasil berupa katalase negatif (Lay 1994).
5.4. Uji Christie, Atkins, and Munch-Petersen (CAMP)
dengan ose kemudian digoreskan horizontal di sebelah kanan dan kiri goresan
Staphylococcus aureus membentuk seperti garis tegak lurus. Jarak antara kedua goresan kira-kira 0.5 cm dari goresan Staphylococcus aureus. Setelah selesai, agar darah diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37 οC. Uji positif akan menunjukan zona bening seperti anak panah (arrow head) diantara kedua goresan bakteri tersebut (Allen-Mierl et al. 2006).
5.5. Uji Serogrup S. agalactiae
S. agalctiae dari mastitis subklinis umumnya termasuk Grup-B. Identifikasi dilakukan dengan menggunakan Streptococcal Grouping kit (Oxoid®, England). Tiap isolat bakteri CAMP positif yang telah diremajakan pada media agar darah diambil 3-5 koloni menggunakan öse secara aseptis, lalu dimasukan ke dalam tabung-tabung kecil ujung lancip bertutup ukuran 1 ml yang telah berisi ekstrak enzim streptococcal masing-masing sebanyak 200 µl. Suspensi tersebut dipanaskan di dalam penangas air pada suhu 37 οC selama 10 menit. Setiap lima menit tabung-tabung tersebut dikocok. Langkah berikutnya suspensi diambil dengan pipet Pasteur lalu diteteskan sebanyak dua tetes di atas kertas latex. Tambahkan latex reagen group B pada suspensi dan keduanya dicampurkan, dibiarkan selama 10-15 detik sambil diamati reaksi aglutinasi yang terjadi.
5.6. Ekspresi Fenotipe SGB in vitro
Pengujian ekspresi fenotip dilakukan dengan menanam SGB pada media Soft Agar (SA) dan media cair Todd Hewit Broth (THB) untuk diamati pola pertumbuhannya. Isolat SGB yang telah diremajakan pada media agar darah ditanam secara aseptis sebanyak satu öse kedalam tabung reaksi yang berisi 5 ml media brain heart infusion (BHI) broth. Suspensi diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37 οC, kemudian biakan segar diambil dengan öse dan diencerkan dalam 10 ml larutan NaCl
24
dalam suspensi biakan segar SGB yang telah diencerkan, lalu ditanam kedalam 10 ml media soft agar (SA). Setiap suspensi tersebut ditanam dalam dua media SA. Salah satu dari media SA ditambahkan serum kelinci sebanyak 200 µl (serum soft agar/SSA) selanjutnya diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37οC. Pengujian pola tumbuh pada media cair dilakukan dengan menanam 1 öse biakan segar SGB ke dalam 10 ml media cair THB, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam dan diamati pola pertumbuhannya (Wibawan and Lämmler, 1990).
5.7. Uji Hemaglutinasi
Isolat S. agalactiae Group B (SGB) selanjutnya diuji hemaglutinasi menggunakan 1% eritrosit sapi perah dalam NaCl fisiologis. Pengujian hemaglutinasi dilakukan dengan mencampur secara homogen 50 µl suspensi bakteri 108 sel/ml dengan 50 µl eritrosit sapi perah ke dalam mikroplate. Reaksi hemaglutinasi dapat dibaca jika kontrol eritrosit mengendap. Reaksi dikatakan positif apabila terjadi aglutinasi di dasar tabung dan negatif apabila terjadi endapan seperti pada kontrol eritrosit (Wahyuni dkk. 2005).
6. Orientasi Dosis Iradiasi Sinar Gamma SGB untuk LD50
masih bertahan hidup sebanyak 50% sebagaimana penelitian terdahulu (Tuasikal dkk. 2003).
7. Karakterisasi Protein Antigenik Permukaan SGB dengan SDS PAGE
Karakterisasi protein permukaan SGB iradiasi dilakukan dengan dua tahap, yaitu persiapan protein antigenik dan teknik SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamid Gel Electrophoresis) untuk mengukur berat molekulnya (Walker JM 2002).
Protein antigenik diperoleh dari isolat SGB yang sudah ditanam dalam BHI Broth dan diberi perlakuan iradiasi dengan dosis 0 dan 17 Gy, lalu disentrifuge
dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Pelet sel bakteri diambil kemudian dicuci dengan NaCl fisiologis, selanjutnya diencerkan dengan NaCl fisiologis sampai volume 1,5 ml. Suspensi sel dimasukkan ke dalam tabung sonikator untuk memecah dinding sel dan melepas protein. Sonikasi dilakukan selama tiga menit. Sel hasil sonikasi dipindahkan ke dalam tabung mini steril, kemudian disentrifuge pada 10.000 rpm selama 3 menit. Supernatan yang diperoleh dipisahkan dan disimpan pada suhu 0-4 oC sampai akan digunakan dalam pengukuran konsentrasi protein menggunakan metode Bradford.
26
dalamnya sehingga gel-gel yang tersisa di dalam sumuran dapat keluar. Setiap sumuran diisi dengan 10 µl campuran sampel protein dan sampel buffer yang sudah dipersiapkan sebelumnya. Selain sampel digunakan juga marker protein sebagai penanda. Marker protein yang digunakan mempunyai berat molekul 25 sampai 225 kDa. Visualisasi berat molekul protein antigen dilakukan dengan perangkat elektroforesisi yang dihubungkan ke arus listrik pada tegangan 100 volt dengan arus 50 mA selama kurang lebih 3 jam sampai sampel buffer terlihat pada bagian bawah gel (kurang lebih 1 cm di atas batas bawah gel). Elektroforesis dilakukan pada kondisi suhu 4oC. Setelah elektroforesis berakhir, gel diangkat dari lempeng kaca dan direndam di dalam pewarnaan Commasie Brilliant Blue selama 30 menit pada suhu ruang sambil diagitasi perlahan. Pewarna yang tidak terikat pada protein dihilangkan dengan merendam gel pada larutan pemucat metanol dan asam asetat sehingga gel berwarna bening atau pita-pita protein telah terlihat jelas. Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein dari garis awal gel pemisah dengan jarak migrasi pewarna, atau dibandingkan terhadap pewarna marker.
8. Uji Patogenitas dan Imunitas dengan Hewan Model Mencit
µl), kemudian ditunggu hingga terabsorbsi. Nekropsi dilakukan sehari setelah tantangan. Penilaian respon terhadap vaksin yang diberikan, dilakukan dengan pemeriksaan Histopatologi jaringan kelenjar mamae yang difiksasi formalin dengan pewarnaan hematoksilin dan eosin (HE) (Kiernan, 1990). Titer antibodi Ig-G diperiksa dengan teknik Enzyme Linked Immunosorbent Assay secara tak langsung (indirect ELISA) dari sampel serum darah yang dikoleksi tiap minggu (Crowther 2010).
9. Aplikasi Kandidat Vaksin Iradiasi Terpilih pada Kambing Perah
Hewan percobaan yang digunakan sebanyak 6 ekor kambing perah peranakan
etawah yang dibagi menjadi 2 kelompok perlakuan, yaitu 4 ekor untuk kelompok vaksin (V) yang diberi SGB Hn+ iradiasi secara subkutan dengan dosis 108 cfu/ml sebanyak 2 ml/ kambing, dan 2 ekor untuk kelompok kontrol (K) yaitu hewan normal yang tidak diberi vaksin SGB. Vaksin diberikan pada masa kering kandang dengan pemberian booster 3 kali prepartus. Pemeriksaan konsentrasi Ig-G dilakukan dengan teknik ELISA dari serum sampel yang dikoleksi tiap minggu (Crowther 2010). Produksi susu postpartus dicatat setiap hari.
10.Rancangan Penelitian
28
HASIL DAN PEMBAHASAN
1.Kejadian Mastitis Subklinis di Daerah Pengambilan Sampel SusuSampel susu yang digunakan berasal dari 3 wilayah pada 2 daerah yang berbeda yaitu daerah Bogor dengan wilayah Kawasan Usaha Peternakan (Kunak) Cibungbulang dan Garut dengan wilayah Kecamatn Cisurupan dan Kecamatan Bayongbong. Sampel susu dari hewan penderita mastitis subklinis dapat diketahui dengan CMT (California Mastitis Test). Dengan uji ini didapatkan hasil dengan mengamati parameter derajat konsistensi kekentalan dari campuran susu dan reagen uji yang membentuk materi gelatinous kental. Parameter ini diukur dengan melihat
kekentalan yang terjadi untuk positif I akan terbentuk lendir tipis, positif II akan terbentuk lendir yang lebih kental, dan positif III lendir yang terbentuk sangat kental seperti massa gelatin. CMT bekerja berdasarkan 3 prinsip yaitu jumlah leukosit akan meningkat drastis saat jaringan mamae mengalami luka atau infeksi, leukosit terutama polymorphonuclear leukosit (PMNs) mempunyai inti sel yang besar (DNA) bila dibandingkan dengan sel lain atau bakteri yang terdapat didalam susu, selain itu penyusun utama dinding sel leukosit adalah lipid (lemak). Semakin tebal gel yang terbentuk di dalam piring uji CMT, maka semakin banyak juga sel darah putih yang terdapat di dalam sampel susu. Peningkatan penebalan dari gel ini menandakan terdapat peningkatan dalam hal infeksi. Reagen dari CMT merupakan suatu detergen dengan penambahan indikator pH yang menyebabkan terbentuknya warna ungu pada pencampuran dengan sampel susu. Saat sampel susu dan reagen MT dicampur dengan jumlah yang setara, reagen CMT akan melarutkan dinding sel terluar dan dinding sel nuklear dari leukosit yang penyusun utamanya adalah lemak, dimana detergen akan melarutkan lemak. Hal ini mengakibatkan DNA lepas dari inti yang mengarah kepada pembentukan gel oleh sesama DNA ntuk membentuk suatu massa
seperti serabut. Seiring dengan penambahan jumlah leukosit pada setiap quarter akan berbanding lurus dengan peningkatan jumlah pembentukan gel (Ruegg 2005). Hasil
30
Gambar 2. Hasil CMT memperlihatkan kekentalan (a) yang terbentuk akibat pencampuran susu dengan reagen uji.
Berdasarkan hasil uji ini, kejadian mastitis subklinis tertinggi berada pada wilayah Kunak, disusul Cisurupan, dan Bayongbong (Tabel 1).
Tabel 1 Kejadian mastitis subklinis pada wilayah Cisurupan, Bayongbong, dan Kunak
Asal sampel Jumlah sampel Jumlah sampel positif CMT
Kejadian mastitis subklinis
Cisurupan 97 92 94.84%
Bayongbong 77 72 93.50%
Kunak 66 66 100%
Pada Tabel 1 dapat dilihat bahwa tingkat kejadian terjadinya mastitis subklinis di ketiga wilayah peternakan ini sangatlah tinggi, dengan presentasi kejadian pada daerah Cisurupan, Bayongbong dan Kunak, berturut-turut sebesar 94,84%, 93,50%, 100%. Peluang terjadinya mastitis subklinis di peternakan wilayah Kunak adalah
lingkungan, rendahnya tingkat sanitasi perkandangan, dan cara pemerahan mencerminkan higienitas personal yang buruk. Faktor manusia menjadi masalah utama sehingga hal-hal buruk tersebut dapat terjadi.
Tingginya presentasi kejadian mastitis subklinis pada peternakan sapi perah di ketiga daerah ini dapat dikaitkan dengan kondisi lingkungan dan pengelolaan peternakan diantaranya yaitu sanitasi kandang dan cara pemerahan susu (Sori et al. 2005). Sanitasi kandang yang buruk, peralatan yang tidak bersih dan ditambah lagi dengan cara pemerahan susu yang juga tidak bersih kemungkinan besar merupakan faktor utama penyebab terjadinya mastitis subklinis pada ketiga peternakan sapi perah tersebut.
32
Peningkatan biaya perawatan dan pengobatan serta pengafkiran ternak lebih awal (Seegers et al. 2003, Shim et al. 2004).
Selain kondisi lingkungan dan pengelolaan peternakan sebagai faktor utama penyebab mastitis subklinis di ketiga peternakan, faktor penunjang dari sisi ternak juga berperan dalam terjadinya radang mamae ini. Kondisi kesehatan ternak yang kurang baik, luka/lecet pada puting susu yang diakibatkan pemerahan kasar, lantai kasar, lap yang kotor dan sikat yang keras, bentuk mamae yang sangat menggantung, serta mamae dengan lubang puting yang terlalu lebar merupakan faktor predisposisi terjadinya mastitis subklinis dari segi ternak. Disamping itu terdapat pula faktor penyebab mastitis subklinis dari segi mikroorganisme penyebab, diantaranya adalah
jenis dan jumlah mikroorganisme patogen. Faktor-faktor penyebab tersebut dapat berpengaruh terhadap kerusakan struktur dan gangguan fungsi kelenjar mamae pada ruminansia yang terserang mastitis, sehingga berujung pada penurunan produksi susu pada induk pasca melahirkan (Akers and Nickerson, 2011).
Kondisi lingkungan (kandang) tempat sampel susu diperoleh maupun sanitasi saat pemerahan dapat diukur dengan menggunakan beberapa parameter diantaranya adalah jumlah mikroba. Rata-rata jumlah mikroba dalam sampel susu yang diperoleh dari daerah Cisurupan, Bayongbong dan Kunak disajikan dalam Tabel 2.
Tabel 2 Jumlah mikroba dalam sampel susu dari uji Total Plate Count (TPC) Asal sampel Rata-rata jumlah mikroba (cfu/ml)
Cisurupan 1.302.893
Bayongbong 1.300.987
Kunak 1.764.613
mastitis subklinis pada peternakan sapi perah di ketiga wilayah sangat tinggi, yang dibuktikan dengan tingginya rata-rata jumlah mikroba pada sampel susu yang dikumpulkan secara aseptis langsung ditampung dalam tabung steril. Menurut Lukman dkk (2009) pencemaran dapat berasal dari mamae atau masuk melalui puting susu. Jumlah mikroba bertambah dengan adanya cemaran dari tangan dan baju pemerah, alat perah dan lingkungan kandang. Jumlah mikroba dalam susu akibat kontaminasi melalui udara sekitar 100-1.500 koloni/ml susu, melalui kontaminasi mamae dan sekitarnya ditemukan 300-4.000 koloni/ml. melalui sanitasi yang buruk pertambahan mikroba mencapai 500-15.000 koloni/ml. kontaminasi dari mamae yang sakit mencapai 25.000 koloni/ml. jumlah mikroba dalam susu akan meningkat
melalui kontaminasi dari peralatan susu sampai dengan lebih dari 1.000.000 koloni/ml (Lukman dkk. 2009).
2. Isolat S. agactiae Group B Terpilih sebagai Bahan Vaksin Iradiasi Mastitis Subklinis
Isolasi dan identifikasi bakteri Streptococcus sp pada sampel susu yang dinyatakan positif mastitis subklinis berdasarkan hasil CMT, dilakukan dengan mengkultur pada media Blood Agar Plate (BAP). Media BAP ini merupakan media diferensial yang dapat membedakan bakteri normal dan bakteri pathogen berdasarkan kemampuannya melisiskan sel darah merah. Selain itu pada media ini dapat pula diamati bentuk koloni dari bakteri yang tumbuh. Koloni Streptococcus sp pada permukaan BAP akan tampak sebagai koloni yang halus, kecil, cembung, transparan sampai putih (Gambar 3). Koloni ini akan membentuk pola hemolisis α, hemolisis ,
