Mekanisme penghambatan bakteri probiotik terhadap pertumbuhan Vibrio harveyi pada larva udang windu (Penaeus monodon)

(1)

MEKANISME PENGHAMBATAN BAKTERI PROBIOTIK TERHADAP PERTUMBUHAN Vibrio lrnrveyi PADA LARVA

UDANG WINDU (Penneus monodon)

EVA AYUZAR

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(2)

PE

ATAAN MENGENAI TESIS DAIO

SUNUBER INFO

SI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Mekanisme Penghambatan Bakteri Probiotik terhadap Pertumbuhan Vibrio harveyi pada larva udang windu (Penaeus monodon) adalah benar hasil karya saya sendiri dan merupakan bagian dari penelitian hibah bersaing dengan judul "Bakteri Probiotik dalam Budidaya Udang: Seleksi, Mekanisme Aksi, Karakterisasi dan Aplikasinya sebagai Agen Biokontrol". Sumber inforrnasi yang berasal atau d i t i p dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka dibagian akhir tesis ini.

Bogor, Januari 2008

(3)

ABSTRAK

EVA AWZAR. Mekanisme Penghambatan Bakteri Probiotik terhadap Pertumbuhan Vibrio harveyi pada Larva Udang Windu (Penaeus monodon). Dibimbmg oleh S W N D A dan W I D A N M I .

(4)

ABSTRACT

EVA AYUZAR. Inhibitory mechanism of probiotic bacteria on the growth of Vibrio harveyi in tiger shrimp (Penaeus monodon) larvae. Under the guidance of SUKENDA, and WIDANARNI.

(5)

ME

ISME PENGWAMBATAN BAKTERI

PROBIOTIK TERHADAP PERTUMB

N

Vibrio harveyi

PADA LARVA

UDANG

W I m U

(Penaeus monodon)

EVA AUUZAR

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains padr Program Studi Ilmu Perairan

SEKOLAH PASGASARJANA

HNSTkTUT PERTANHAN BOGOR

(6)

: Mekanisme Penghambatan Bakteri Probiotik terhadap Pertumbuhan Vibrio haweyi pada Larva Udang Windu (Penaeus monodon)

Nama : EVA AYUZAR

NRP : C151040171

Program Studi :

LLMU

PERAIRAN

Disetujui, Komisi Pembimbing

Dr. Widanarni Anggota

Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasariana IPB Ilmu peraGan

"

$

Prof. Dr.

Ir.

Enang Harris, M

I

airil Anwar Notodiputro, MS

(7)

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT, karena hanya atas

rahmat dan karunia serta ridho-Nyalah tesis yang berjudul "Mekanisme

Penghambatan Bakteri Probiotik terhadap Pertunbuhan Vibrio haweyi pada

Larva Udang Windu (Penaeus monodon)" dapat diselesaikan.

Pelaksanaan penelitian dan penulisan tesis ini tidak terlepas dari bantuan

dan bimbimgan berbagai pihak. Pada kesempatan ini, penulis menyampaikan

terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Bapak Dr. Sukenda dan Ibu Dr. Widanani selaku komisi pembimbing atas

pengarahan dan bimbingan yang telah diberikan selama penelitian d m

penulisan tesis ini sehingga dapat penulis selesaikan dengan baik.

2. Bapak Rektor Universitas Mallikusaleh, Bapak Dekan Fakultas Pertanian

beserta jajarannya, Bapak Ketua Jurusan Budidaya Perairan, yang telah

memberikan kesempatan dan mengijinkan penulis untuk mengikuti program

pascasarjana di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

3. Ketua Program Studi Ilmu Perairan, Ketua d m Staf Laboratorium Kesehatan

Ikan dan Laboratorium Lingkungan Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan

dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor yang telah membantu dalam

penyediakan fasilitas hingga terlaksananya penelitian ini.

4. Ayahanda Azarman Arief dan Ibunda Zuraida 2, Mertua Cut Nursinah serta

semua adik-adikku yang telah banyak memberikan bantuan baik materi

maupun moral serta suami Dedi Nurdiansyah dan anakku Salsa Zurdiva h a

tercinta yang selama ini telah banyak berkorban dan bersabar, hingga penulis

mampu menyelesaikan studi ini dengan baik.

5. Rekan-rekan angkatan 2004,2005 dan 2006 Program Studi Ilmu Perairan dan

Staf Perpustakaan Budidaya Perairan atas segala bantuan dan kerjasamanya.

Akhirnya semoga tesis ini dapat bermanfaat bagi semuanya. Amin

.

Bogor, Januari 2008

(8)

RIWAYAT NIDUP

Penulis dilahirkan di Kutacane, Aceh Tenggara pada tanggal 23 Juli 1980

dari ayah Azarman Arief dan ibu Zuraida Z. Penulis merupakan anak pertama dari

lima bersaudara. Sejak tahun 2006 penulis telah berkeluarga dengan suami

bemama Dedi Nurdiansyah dan dikaruniai seorang anak beinama Salsa Zurdiva

h a .

Penulis lulus SMA pada tahun 1998 dan melanjutkan program sarjana (Sl)

di Universitas Riau, selesai pada tahun 2003. Pada bulan Agustus 2004, penulis

melanjutkan kuliah ke sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor Program

Studi Ilmu Perairan.

Tahun 2006 penulis diangkat sebagai tenaga pengajar di Jurusan Budidaya

(9)

DAFTAR IS1

Walaman

...

DAFTBR IS1 i

DAFTAR G AR

...

11

. .

...

DAFTAR LAMPIRAN III PENDAWULUAN

...

1

Latar Belakang

...

1

...

Tujuan 2

...

TINJAUAN PUSTAKA 3

...

Bakteri Vibrio haweyi dan Penyakit Udang Berpendar 3 Bakteri Probiotik sebagai Biokontrol pada Larva Udang

...

4

Mekanisme Kerja dan Seleksi Bakteri Probiotik

. . .

...

6

Resistensi A n t ~ b ~ o t ~ k

...

7

...

lllETODE PENELITIAN Waktu dan Tempat

...

Metode dan Disain Penelitian Sumber Isolat Bakteri Probiotik

...

Uji In Vivo Bakteri Probiotik pada Larva Udang Pembuatan Mutan Bakteri Probiot

ik.

Resisten Rifampisin @@)

...

Pertumbuhan Bakteri Probiotik

RfR

...

Daya Hambat Bakteri Probiotik Rf?erhadap V: haweyi pada Larva Udang

...

Identifikasi Isolat Probiotik

...

Parameter yang Diamati a.Tingkat Kelangsungan Hidup Larva Udang

...

b.Pertumbuhan Larva Udang

...

c.Populasi Bakteri

. .

.

...

Anal~s~s Statlstlk

...

WASIL DAN PEMBAHASAN

...

13

Sumber Isolat Bakteri Probiotik

...

13

Uji In Vivo Bakteri Probiotik pada Larva Udang

...

15

penggunaan ~enanda

RfR

pads ~ a k t e r i Probiotik

...

18

Pertun~buhan Bakteri Probiotik

RfR

...

18

Daya Hambat Bakteri Probiotik

RfR

terhadap V

.

haweyi pada Larva Udang

...

20

Identifikasi Isolat Probiotik

...

26

(10)

DAFTAR G AR

Nalaman

1. Penampilan koloni isolat 1Ub pada media

SWC

...

2. Penampilan koloni isolat SKT-b pada media

TCBS (A)

dan

SWC

(B)

...

3. Penampitan kokcni isolat Ua pada me&a

TCBS

(A)

dm

SWC

(9)

4. Penampilan koloni isolat V. harveyi pada media

TCBS

diruang terang

(A)

d i g gelap

(B)

...

5. Kelangsungan hidup larva udang windu pada uji in vivo bakteri probiotik.. 6. Pertumbuhan panjang larva udang windu pada uji in vivo bakteri probiotik 7 Pertumbuhan bobot larva udang windu pada uji in vivo bakteri probiotik

...

....

8. Perbandingan pertumbuhan bakteri probiotik mutan dengan tipe liarnya 9. Kelangsungan hidup larva udang pada uji daya hambat bakteri

probiotik terhadap i? harveyi

...

10. Populasi bakteri probiotik, V. harveyi, dan total bakteri pada larva udang

...

mati pada uji daya hambat bakteri probiotik terhadap

V.

harveyi

1 1. Populasi bakteri probiotik, V. harveyi, dan total bakteri pada larva udang hidup pada uji daya hambat bakteri probiotik terhadap V. harveyi

...

12. Populasi bakteri probiotik, i? harveyi, dan total bakteri pada air

pemeliharam pada uji daya hambat bakteri probiotik terhadap V. harveyi

..

13. Perhmbuhan panjang larva udang pada uji daya hambat bakteri probiotik

terhadap K harveyi

...

14. Perhmbuhan bobot larva udang pada uji daya hambat bakteri probiotik

(11)

DAFTAR L M P I R A N

1. Komposisi media SWC-agar (Seawater Complete agar), SWC-cair dan TCBS-agar (Thiosulphate Cihate Bile-Salt sucrose agar)

...

2. Peclbuatu: larutu: Stck Sfampisin

3. Kelangs~mgan hidup larva udang windu pada uji in vivo bakteri Probiotik

...

4. Pertumbuhan panjang larva udang windu pada uji in vivo bakteri probiotik.

5.

Pertumbuhan bobot larva udang windu pada uji in vivo bakteri probiotik

....

6.

Kelangsungan hidup larva udang pada uji daya hambat bakteri probiotik

terhadap V. haweyi

...

7 .

Pertumbuhan panjang larva udang pada uji daya hambat bakteri probiotik

terhadap V. haweyi

...

8. Pertumbuhan bobot larva udang pada uji daya hambat bakteri probiotik

(12)

PEND UAN

Latar Belakang

Serangan penyakit dan penurunan kualitas lingkungan budidaya

merupakan masalah yang timbul dalam usaha pembenihan udang. Salah satu

penyakit udang yang membahayakan adalah penyakit udang berpendar atau

luminescent vibriosis yang disebabkan oleh Ebrio harveyi. V. harveyi dapat

menyerang udang pada berbagai stadia mulai dari nauplius, zoea, mysis dan post

larva di pembenihan hingga udang dewasa di tambak pembesaran (Saulnier et al.

2000).

Salah satu alternatif untuk menanggulangi permasalahan penyakit vibriosis

adalah dengan menggunakan bakteri probiotik sebagai biokontrol yang dapat

menghambat pertumbuhan V. harveyi. Bakteri probiotik yang digunakan sebagai

biokontrol dapat diisolasi dari tambak atau pembenihan udang (Tjahjadi et al.

1994; Hary'anti et al. 2000), air dan sediien laut (Muliani et al. 2003) atau

invertebrata laut seperti sponge (Suryati et al. 2004) serta terumbu karang

(Proksch, 2000).

Tiga isolat bakteri kandidat probiotik koleksi Laboratorium Kesel~atan

Ikan, Departemen Budidaya Perairan, IPB yakni 1Ub (Tepu, 2006), SKT-b

(Widanami et al. 2003) dan Ua (Rajab, 2006) telah diuji mampu menghambat pertumbuhan V. harveyi secara in vitro dan dapat meningkatkan kelangsungan hidup larva udang pada uji in vivo.

Untuk mempelajari mekanisme aksi bakteri probiotik tersebut dalam

menghambat pertumbuhan V. harveyi pada larva udang dilakukan dengan memberikan penanda molekuler pada bakteri probiotik dan patogen, sehingga

keberadaan bakteri tersebut pada larva udang dapat diamati. Penanda resistensi

terhadap antibiotik rifampisin

(RfR)

merupakan suatu pilihan karena bakteri asal

laut pada umumnya sensitif terhadap rifampisin (Tjahjadi et al. 1994). Selain itu

mutan spontan resisten rifampisin bersifat stabil pada media tanpa penambahan

antibiotik (Hala et al. 2002) sehingga dapat digunakan 14i tantang pada jangka

(13)

dari bakteri lain yang sebelumnya telah terdapat pada larva udang atau air media

pemeliharaannya.

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari mekanisme penghambatan

bakteri probiotik terhadap pertumbuhan V. hurveyi pada larva udang windu

(14)

TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri Vibrio Itarveyi dan penyakit udang berpendar

V. h a m y i pada umumya bersifat patogen oportunistik, yaitu organisme

yang dalam keadaan normal ada dalam lingkungan pemeliharaan dan berkembang

dari sifat saprofitik menjadi patogenik apabila kondisi lingkungan dan inang

memburuk. Pada saat terjadinya wabah, populasi bakteri ini dapat m e ~ n g k a t

menjadi ribuan kali dalam wadahhak pemeliharaan larva, dan ha1 ini terjadi

setelah usaha budidaya udang windu berkembang secara intensif (Lavilla-Pitogo

et al. 1990). Menurut Saulnier et al. (2000) beberapa galur V. harveyi merupakan

patogen dan penyebab utama penyakit vibriosis pada udang windu. Kesimpulan

tersebut diambil berdasarkan studi virulensi dari beberapa galur V. harveyi yang

diisolasi dari larva sekarat dan diinfeksi kembali pada udang sehat. Beberapa dari

galur tersebut dapat menyebabkan kematian total larva udang dengan dosis yang

sangat rendah (10 CFUIml).

Pada sistem budidaya udang, V. harveyi dapat ditemukan di hatchery,

dapat diisolasi dari air laut yang masuk, induk, larva dan air tanki pembesaran

larva (Otta et al. 2001; Prayitno et al. 1995). V. harveyi juga dapat diisolasi dari

tambak pembesaran udang (Karunasagar et al. 1994).

Ciri-ciri morfologi clan fisiologi

I.:

harveyi pada medium nutrien agar

dengan NaCl 1.5% dan seawater complete-agar (SWC-agar) adalah: bentuk

koloni bulat dengan elevasi cembung, berwarna krem, berdiameter 2-3 mm

setelah inbubasi 24 jam pada suhu 2 8 ' ~ . Pada medium selektif

untuk

genus

Vibrio, yaitu TCBS-agar (Tiosu&te Citrate Bile-Salt Sucrose), koloni V. harveyi

benvama hijau dan berpendar bila diamati di ruang gelap (Lavilla-Pitogo et al.

1990).

Kemampuan berpendar atau lztminescent merupakan hasil aktivitas enzim

luciferase yang dapat berfimgsi sebagai katalisator dalam proses oksidasi reduksi.

Proses oksidasi melibatkan flavin mononukleotida dan aldehid alifatik rantai

panjang sebagai substratnya. Senyawa-senyawa tersebut masing-masing diubah

menjadi flavin mononukleotida dan asam lemak disertai dengan pelepasan emisi

(15)

fungsi perpendaran ini disandikan dalam suatu operon yang disebut dengan

operon lux (Meighen, 1991; Ruby, 1996). V. harveyi juga diietahui memiliki

aktivitas enzim kitinase, protease, dan lipase (Baumann et al. 1994). Enzim

kitinase memungkinkan V. harveyi untuk menguraikan kitin dan berkolonisasi di

dalam tubuh larva udang windu.

Kematian yang disebabkan vibriosis terjadi apabila udang mengalami stres

akibat kualitas air buruk, kepadatan tinggi, temperatur tinggi dan pergantian air

yang rendah (Brock and Lightner 1990). Berdasarkan hasil penelitian Lavilla-

Pitago (1990), kematian larva terjadi setelah 48 jam pasca infeksi bakteri V.

haweyi dan V. splendidus.

Jenis Vibrio lain yang menyebabkan vibriosis adalah Vibrio vulnificus,

Vibrio parahaemalyticus ( Nash et al. 1992 dan Lavilla-Pitogo et al. 1990), V. anguillarum, V. campbelli, dan V. splendidus (Chen, 1992). Akibat meningkatnya

jurnlah kasus vibriosis yang terjadi, maka diperlukan serangkaian penelitian untuk

mengetahui sifat virulensi dari V. harveyi agar penyakit ini dapat diatasi (Austin et

al. 2003).

Bakteri Probiotik sebagai Biokontrol pada Larva Udang

Menurut Fuller (1992), probiotik adalah mikrob hidup yang ditambahkan

ke dalam pakan yang dapat memberi pengaruh mengmtungkan bagi hewan inang

dengan cara memperbaiki keseimbangan mikrob ususnya. Pada hewan akuatik,

selain saluran pencemaan, air di sekeliling organisme tersebut juga memegang

peranan penting. Sehingga probiotik untuk hewan akuatik adalah agen mikrob hidup yang memberikan pengaruh menguntungkan pada inang dengan

memodifikasi komonitas mikrob atau berasosiasi dengan inang, menjamin

perbaikan dalam penggunaan pakan atau memperbaiki nilai nutrisinya,

meinperbaiki respon inang terhadap penyakit, atau memperbaiki kualitas

lingkungan ambangnya (Verschuere et al. 2000).

Biokontrol menurut Gomez-Gil et al. (2000) adalah penggunaan musuh

alamiah untuk mengurangi kemsakan yang disebabkan oleh organisme berbahaya

sampai tingkat yang dapat ditolerir, atau lebih tepat lagi pengaturan populasi

(16)

mikrob di dalam saluran pencemaan hewan sampai batas tertentu memberi

ketahanan atau perlindungan terhadap penyakit. Demikian pula pada populasi

alamiah hewan akuatik, mikrobiota di dalam saluran pencernaan dapat

mencerminkan lingkungan akuatik tersebut. Namun demikian, pada pemeliharaan

larva dengan kepadatan tinggi di dalam wadah budidaya, keseimbangan dapat

berubah karena penggunaan air yang sudall didesinfeksi, mikroalga, nauplii,

artemia, rotifer dan berbagai antibiotik pembunuh bakteri. Akibatnya, komunitas

mikrob pelindung tidak dapat berkembang baik di lingkungannya maupun di

dalam sistem saluran pencemaan larva. Pascalarva yang dipelihara di dalam

lingkungan yang relatif steril di suatu pembenihan tidak dapat tumbuh dengau

baik dan memperlihatkan daya hidup yang rendah bila terpapar pada kompleks

populasi mikrob di petak pendederan atau pembesaran. Pascalarva tersebut &an

mudah terserang penyakit bila terkena stress lingkungan atau terinfeksi oleh

bakteri yang potensial bersifat patogen. Menumt Gomez-Gil et al. (2000), konsep

probiotik sebagai biokontrol, yaih pemanfaatan organisme yang antagonis dalam

membatasi atau menyerangi hana pada budidaya. Dalam hal ini mikroorganisme

probiotik tidak hanya sebagai nlusuh alami patogen, tetapi juga dengan

mengurangi kerusakan yang disebabkan oleh patogen, umumnya dengan

kompetisi, yang paling banyak dengan menghasilkan substansi yang menghambat

perttunbuhan mikroorganisme yang paling berbahaya.

Pemanfaatan beberapa bakteri yang berada dalam wadah budidaya dan

tubuh organisme seperti udang maupun ikan sebagai probiotik telah dilakukan dan

mampu menunjukkan pengaruh positif terhadap pertumbuhan dan kesehatan

melalui peningkatan keseimbangan mikrobial dalam tubuh (Gullian et al. 2004;

Villamil et al. 2003; Vine et al. 2004).

Pemberian probiotik pada usaha budidaya udang windu dapat

meningkatkan kelangsungan hidup dan dapat menekan pertumbuhan bakteri

patogen sehingga didapat kualitas dan produksi udang windu yang lebih baik

(Haryanti et al. 2000; Haryanti dan Sugama, 2002; Moriarty, 1999 dan Rengpipat

(17)

Mekanisme Kerja dan Seleksi Bakteri Probiotik

Menurut Verschuere et al. (2000), mekanisme kerja probiotik dapat dibagi

menjadi beberapa cara, yaitu: (1) memproduksi senyawa inhibitor seperti

antibiotik, bacteriocins, siderophores, lysozymes, proteases, hidrogen peroksida

ataupun asam organik yang dapat merubah pH, (2) kompetisi terhadap senyawa

kimia atau sumber energi (n~ttrisi), seperti besi ataupun nutrien yang diambil dari

inang; (3) kompetisi terhadap tempat pelekatan pada tubuh inang; (4)

meningkatkan respon imun (kekebalan) pada inang; (5) memperbaiki kualitas air;

(6) interaksi dengan fitoplankton.

Probiotik yang bekerja di dalam tubuh inang l-iarus mampu bertahan hidup

dalam mukosa usus inang dan berkembang biak dengan cepat agar tidak terbawa

keluar bersama sisa metabolisme inang (Vine et al. 2004). Meskipun secara in

vitro probiotik terbukti mampu menekan atau menghambat perttunbuhan bakteri

patogen, namm apabila probiotik tersebut tidak dapat bertahan hidup dalam

mukosa usus kemungkinan besar probiotik yang menghambat perttunbuhan

b'akteri patogen tidak ditemukan pada uji in vivo (Vine et al. 2004).

Menurut Gomnez-Gil et al. (2000), seleksi bakteri probiotik biasanya

merupakan proses empiris didasarkan pada sediiit bukti ilmiah. Banyak

kegagalan dalam penelitian bakteri probiotik yang terjadi karena salah memilih

mikroorganisme. Tahapan seleksi memang sudah ditentukan, akan tetapi tahapan

ini masih perlu disesuaikan berdasarkan spesies inang dan lingkungan, sehingga

perlu pemahaman mekanisme kerja probiotik dalam menentukan kriteria seleksi

bakteri probiotik potensial.

Menurut Gomez-Gil et al. (2000), metode seleksi bakteri probiotik untuk

kegiatan pemeliharaan larva hewan akuatik dapat mencakup beberapa tahap

berikut: (1) pengumpulan informasi dasar yang didapat dari studi pustaka maupun

di lapangan, meliputi infomasi tentang mikroba serta hubungan antara inang

dengan lingkungannya; (2) penapisan mikroba, yaitu proses pemisahan mikroba

dari campnrannya berdasarkan kriteria tertentu seperti bakteri probiotik hams

menguntungkan inangnya, mampu bertahan hidup dalam usus, dapat disiapkan

sebagai produk sel hidup pada skala industri, dan dapat terjaga stabilitas serta

(18)

pengujian isolat dalam menghambat mikroba patogen secara in vitro dan in vivo;

(4) pengujian patogenitas isolat terhadap inang; (5) pengujian skala laboratorium

termasuk melihat pengaruh kandidat probiotik secara in vivo terhadap variabel

imonologi, dan uji tantang dengan patogen; (6) analisa ekonomi biaya-laba.

Resistensi Antibiotik

Sifat resistansi terhadap antibiotik diperlukan oleh suatu mikroorganisme

untuk mempertahankan kelangsungan hidupnya di alam. Sifat resistensi terhadap

suatu jenis antibiotik dari suatu bakteri perlu diketahui sebelum ditetapkan jenis

antibiotik yang akan digunakan sebagai penanda terhadap bakteri tersebut. Hal ini

akan memudahkan untuk menyeleksi bakteri tersebut dari bakteri yang secara

alami sensitif terhadap antibiotik yang digunakan.

Menurut Chythanya et al. (1999) beberapa organisme secara alami resisten

terhadap beberapa antibiotik. Hal ini disebabkan oleh beberapa faktor antara lain:

(1) organisme tidak mempunyai dinding sel sehingga &an resisten terhadap jenis

antibiotik yang merusak pada dinding sel seperti kelompok penisilin; (2)

organisme mungkin tidak permeabel terhadap beberapa antibiotik; (3) rnikroorganisme mempunyai kemampuan untuk menginaktifkan beberapa

antibiotik; (4) mikroorganisme mempunyai sistem metabolisme yang dapat

memblokir antibiotik tertentu sehingga resisten terhadap antibiotik tersebut; (5)

mikroorganisme mempunyai kemampuan unhk memompa antibiotik tertentu

keluar dari dinding sel sehingga resisten terhadap antibiotik tersebut.

Rifampisin merupakan antibiotik bakterisidal yang dapat mematilcan

kebanyakan gram positif dan beberapa jenis bakteri

gram

negatif. Antibiotik ini

bekerja dengan menghambat sintesa RNA polimerase dari bakteri (Madigan et al. 1997).

V. harveyi dan bakteri-bakteri alami lainnya pada umurnnya telah resisten

terhadap amoksilin (200 pglml), tetrasiMin (5 pdml), ampisilin (50 pg/ml), dan

kanamisin (50 pdml). Meskipun demikian,

V:

harveyi dan bakteri laut umumnya

sensitif terhadap antibiotik rifampisin (Tjahyadi 1994). Oleh karena itu penanda

(19)

membedakan bakteri yang diinokulasi dengan bakteri yang sebelumnya telah ada

pada larva udang.

Untuk memperoleh V. harveyi yang resisten rifampisin dilakukan dengan

cara menyebarkan suspensi biakan V. harveyi pada media SWC yang diberi rifampisin (50 pglml). Koloni yang turnbull kemudian disubkulturkan untuk

(20)

RlETODE PENELITIAN

Waktu dan Tempat

Penelitian dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen

Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian

Bogor. Peneiitian beriangsung selama 6 buian muiai dari buian Januari sampai

Juli 2007.

Metode dan Disain Penelitian

Penelitian dilakukan menggunakan metode eksperimental laboratorium.

Ada lima tahapan yang dilakukan, yaitu tahap pertarna: Uji in vivo bakteri

probiotik pada larva udang. Tahap kedua: Pembuatan mutan bakteri probiotik

resisten rifampisin @). Tahap ketiga: Pertumbuhan bakteri probiotik

@.

Tahap

Keempat: Uji daya hambat bakteri probiotik

RfR

terhadap V. harveyi pada larva

udang. Tahap kelima: Identifikasi bakteri probiotik. Penelitian dirancang

menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan 3 ulangan dan dianalisis keragamannya menggunakan ANOVA.

Sumber Isolat Bakteri Probiotik

Isolat yang digunakan dalam penelitian ini adalah IUb (Tepu, 2006), Ua

(Rajab, 2006) dan SKT-b (Widanarni et al. 2003). Ketiga isolat tersebut telah diuji

mampu menghambat pertumbuhan V. harveyi patogen pada uji in vitro serta dapat meningkatkan kelangsungan hidup larva udang windu.

Uji In Vivo Bakteri Probiotik pada Larva Udang

Tiga isolat bakteri probiotik dengan konsentrasi akhir lo6 CFUIml

dimasukkan dalam wadah pemeliharaan udang sehari setelall larva ~tdang

dimasukkan. Larva udang dipelihara dalam toples yang diisi air laut steril 2 liter

dengan kepadatan 10 ekorll. Setelah kokuitivasi dengan larva udang selama 6

jam, V. hnrveyi MR5339

@

biroasukken dengan konsentxasi lo6 CFUIml.

Percobaan dilakukan dengan tiga ulangan termasuk kontrol positif (V. harveyi

(21)

MR5339

RfR

maupun isolat probiotik). Pergantian air dan penyiponan dilakukan

setiap hari sebanyak 10% dari volume total wadah pemeliiaraan. Pengamatan

dilakukan selama 10 hari, dan larva yang mati d i t u n g setiap hari. Pada akhir

percobaan dihitung tingkat kelangsungan hidup dan pertumbuhan larva.

Pernbuatan Mutan Bakteri Probiotik Resisten Efampisin (@)

Isolat bakteri probiotik diuji sensitivitasnya terhadap antibiotik rifampisin

dengan cara menumbuhkan isolat tersebut pada media agar seawater complete (SWC) (Lampiran 1) dengan suplementasi rifampisin 50 pg/ml (SWC

+

RQ

(Lampiran 2). Setelah diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam, respon

resistensi dietahui dengan mengamati tumbuhnya koloni pada media tersebut.

Pembuatan bakteri probiotik

RfR

dilakukan melalui mutasi spontan dengan

menyebar 1 ml suspensi bakteri probiotik sensitif rifampisin pada media SWC

yang mengandung rifampisin 50 pg/ml. Koloni yang tumbuh pada media tersebut

merupakan mutan bakteri probiotik

RfR.

P e h m b u h a n Bakieri Probiotik

RfR

BaMeli probiotik tipe liar dan mutannya masing-masing d i t u m b ~ ~ a n

pada media SWC-cair dalam shaker bergoyang pada suhu ruang. Konsentrasi

setiap biakan diperoleh dengan mengukur kekeruhan suspensi biakan dengan

metode turbidimetrik. Pengamatan dilakukan setiap jam selama 24 jam dan

dibandingkan antara tipe liar dengan mutannya.

Daya Narnbat Bakteri Probiotik

@

terhadap V. harveyi pada Larva Udang Tiga isolat mutan bakteri probiotik

RfR

diuji kembali efektivitasnya daliun

menghambat pertumbuhan I/: hatveyi patogen pada larva udang. Pengujian dilakukan sama seperti tipe liarnya, namun selain terhadap kelangsungan hidup

dan pertumbuhan, pengamatan juga dilakukan terhadap populasi baMeri probiotik

dan I/: harveyi serta total bakteri baik pada air pemeliharaan maupun larva udang. Pengamatan dilakukan menggunakan media TCBS

+

Rf untuk isolat Vibrio dan SWC

+

Rf untuk isolat non Vibrio. Pengujian dilakukan selama 12 liari, dengan

(22)

Artemia dengan frekuensi pemberian pakan 5 kali sehari, yaitu setiap puku106.00, 10.00, 14.00, 18.00, dan 21.00.

Identifikasi Isolat Probiotik

Untuk menentukan identitas isolat probiotik, dilakukan analisis sekuens

gen 16s-rlWA yang meliputi beherapa tahapan sesuai dengan metoda yang

diiemukakan oleh Marchesi et al. (1998) dan telalx dimodifikasi oleh Suwanto et al. (2002) yaitu meliputi ekstraksi DNA, arnplikasi gen 16s-rRNA dengan PCR,

dan sekuensing dengan mesin sequenser.

Parameter yang Diamati

a. Tingkat Kelangsungan Hidup Lawa Udang

Tingkat kelangsungan hidup larva ~ ~ d a n g , dihitung dengan menggunakan

Keterangan :

SR = Tigkat kelangsungan hidup (%)

Nt = Jumlah udang yang hidup pada akhir pengarnatan (ekor) No = Jumlah udang pada awal percobaan (ekor)

b. Perturnbuhan Larva Udang

Pertumbuhan bobot d a i panjang total diarnati pada awal dan akhir

percobaan. Pertumbuhan larva udang windu dihitung berdasarkan pertambahan

bobot dan panjang, dengan nunus berikut:

a =

{I!

- l)i4 OO%} dan a =

{I!

- lIXl OO%}

Keterangan:

a : Laju pelhunbuhan udang (%)

t : Lama waktu pemeliharaan udang (hari)

(23)

c. Populasi Bakteri

Populasi bakteri yang d i t u n g meliputi jumlah bakteri V. harveyi, bakteri

probiotik dan total baktei-i baik pada air pemeliharaan, udang hidup maupun

udang mati. Pengamatan populasi bakteri baik pada

air

pemeliiaan maupun

pada larva udang hidup dilakukan setiap 2 hari sekali selama pengarnatan,

sedangkan untuk pengamatan udang mati diiakukan setiap 6 jam sekaii. Jumiah

bakteri dihitung berdasarkan rata-rata jumlah koloni yang tumbuh dikalikan

dengan faktor pengenceran.

Analisis Statistik

Desain dari percobaan ini m e ~ p a h n model eksperimen laboratorium

dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) yang terdiri dari 5

perlakuan dan 3 ulangan baik pada percobaan menggunakan bakteri liar, maupun

bakteri mutan.

Bakteri tipe liar :

Perlakuan A : V. haweyi MR 5339

RfR

+

Ua

Perlakuan B : V. hmveyi MR 5339

fl

i- 1Ub

Perlakuan C : V. harveyi M R 5339

RfR+

SKT-b Perlakuan D : V. haweyi M R 5339

RfR

Perlakuan E : Kontrol

Balkteri mutan :

Perlakuan A : V. harveyi MR 5339

RfR

+

U,

RfR

Perlakuan B : V. haweyi MR 5339

fl

+

1Ub

RfR

Perlakuan C : V. harveyi M R 5339

fl

+

SKT-b

R ~ R

Perlakuan D : V. harveyi MR 5339

RfR

(24)

HASIL DAN PEMBAHASAN

Sumber Isolat Bakteri Probiotik

Isolat probiotik yang digunakan dalam penelitian ini adalah lUb, SKT-b,

dan Ua. Isolat 1Ub diisolasi dari nauplius udang vaname di hatchery PT Biru Laut

Khatulistiwa (BLK), Kalianda, Lampung Selatan, Lampung. Isolat tersebut

merupakan isolat terbaik yang dapat menekan pertumbuhan V. harveyi pada uji in

viho dengan metode kultur bersama (Tepu, 2006)

.

Penampilan koloni isolat 1Ub

pada media SWC benvarna orange cerah (Gambar I), sedangkan pada media

TCBS (media selektif untuk Vibrio) tidak tumbuh sehingga termasuk kelompok

[image:24.595.163.450.303.508.2]

bakteri non-Vibrio.

Gambar 1. Penampilan koloni isolat 1Ub pada media SWC

Isolat SKT-b diisolasi dari fitoplankton Skeletonema @akan alami udang

windu) di hatchery Proyek Udang Nasional (PUN), Labuan, Banten. Isolat

tersebut merupakan isolat terbaik yang dapat menekan pertumbuhan V. harveyi

pada uji in vitro dengan metode kultur bersama (Widanarni et al. 2003). Penampilan koloni isolat SKT-b benvarna putih kektmingan dan bersifat

menyebar pada media SWC serta benvarna kuning pada media TCBS (Gambar 2),

(25)

[image:25.595.97.506.75.274.2]

A B

Gambar 2. Penampilan koloni isolat SKT-b pada media TCBS (A) dan SWC (B)

Isolat Ua diisolasi dari saluran pencemaan udang vaname di tambak

intensif Pinang Gading, Bakauheni, Lampung Selatan, Lampung. Isolat tersebut

merupakan isolat terbaik yang dapat menghambat pertumbuhan V. harveyi pada

uji in vitro dengan metode Kirby Baeuer, yakni dengan mengukur zona hambat

yang dihasilkannya (Rajab, 2006). Penampilan koloni isolat Ua berwarna putih

kekuningan pada media SWC dan benvama kuning pada media TCBS (Gambar

3), sehingga termasuk kelompok bakteri Vibrio.

A B

[image:25.595.86.503.483.704.2]

(26)

V. harveyi yang digunakan dalam penelitian ini adalah V. harveyi MR5339

yang berasal dari Balai Penelitian Perikanan Pantai, Maros, Sulawesi Selatan dan

telah diuji bersifat patogen pada larva udang windu. Penampilan koloni V. harveyi

MR5339 pada media TCBS b e m a hijau (Gambar 4A), serta berpendar jika

[image:26.595.108.498.88.353.2]

diamati di ruang gelap (Gambar 4B).

Gambar 4. Penampilan koloni isolat V. harveyi pada media TCBS di ruang terang (A) di mang gelap (B)

Uji In Vivo Bakteri Probiotik pada Larva Udang

Ketiga isolat bakteri probiotik telah diuji efektivitasnya dalam

meningkatkan kelangsungan hidup dan pertumbuhan larva udang windu. Hasil uji

tersebut menunjukkan bahwa kelangsungan hidup larva yang diberi bakteri

probiotik lUb, SKT-b dan Ua secara berturut-turut adalah 88,33%, 83,33%, dan

81,67% pasca uji tantang dengan V. harveyi. Sedangkan perlakuan kontrol positif

dengan inokulasi V: harveyi saja sebesar 41,67% dan kontrol negatif tanpa bakteri

sebesar 68,33% (Gambar 5) dan Lampiran 3. Peningkatan nilai kelangsungan

hidup larva udang diduga karena adanya penghanlbatan pertumbuhan V. harveyi

pada larva udang oleh bakteri probiotik. Isolat-isolat tersebut diduga juga dapat

meningkatkan kebugaran larva udang. Hal ini terlihat dari nilai kelangsungan

(27)

A B C D E

Perlakuan

Keterangan :

A = 1 ~ b

+

MR 5339

RfR

B=SKT-b+MR5339RP C=Ua+MR5339RP

D = Kontrol positif (MR 5339 RP) E = Kontrol negatif (tanpa penambahan bakteri)

Gambar 5. Kelangsungan hidup larva udang windu pada uji in vivo bakteri probiotik

Haryanti et al. (2000) melaporkan bahwa penambahan bakteri strain BY-9

dengan kosentrasi lo6 CFUIm! pada air pemeliharaan ! m a udang windu

menghasilkan tingkat kelangsungan hidup 59,3%, sedangkan pada kontrol 14,7%.

Rengpipat et al. (1998b) menggunakan probiotik Bacillus S11 ~nenunjukkan bal~wa setelah diberi perlakuan probiotik selama 100 hari dan kemudian diuji

tantang dengan

K

harveyi selama 10 hari, nilai kelangsungan hidup udang windu mencapai 100% sedangkan pada kontrol26%.

Untuk mengetahui pertumbuhan larva udang windu selama penelitian,

maka dilakukan pengukuran panjang dan bobot larva pada awal dan akhir

penelitian (Lampiran 4 dan 5). Berdasarkan analisis ragarn, tidak terdapat

perbedaan yang nyata antar perlakuan, tetapi secara signifikan semua perlakuan

berbeda nyata dengan kontrol (p<0,05) baik pertumbuhan bobot maupun

pertumbul~an panjang.

Pada Gambar 6 terlihat larva udang yang diberi probiotik memiliki nilai

prtumbuhan panjang lebih besar (3.21 - 3.56%) dibanding perlakuan tanpa

probiotik (2.77 - 2.99%). Demikian pula untuk pertumbuhan bobot (Gambar 7)

[image:27.599.170.458.84.266.2]

(28)

bobot lebih besar (13.03 - 14.03%) dibanding perlakuan tanpa pemberian

probiotik (10.51 - 12.80%). Hal ini menunjukkan bahwa penambahan balcteri

probiotik dapat meningkatkan pertumbuhan panja~g dan bobot pada larva udang

windu.

Perlakuan

I

Keterangan :

[image:28.602.217.451.167.317.2] [image:28.602.220.448.446.601.2]

~ = l ~ b + ~ ~ 5 3 3 9 f l ~ = s ~ ~ - b + M R 5 3 3 9 @ C = ~ a + M R 5 3 3 9 R f R D = Kontrol positif (MR 5339 RP) E = Kontrol negatif (tanpa penambahan bakteri)

Gambar 6. Pe~tumbuhan panjang larva udang wiiidu pada uji in vivo bakteri probiotik

A B C D E

Perlakuan

Keterangan :

~ = l U b + M R 5 3 3 9 ~ P 8 = ~ ~ ~ - b + M R 5 3 3 9 R f R ~ = U a + ~ ~ 5 3 3 9 R f R

D = Kontrol positif (MR 5339

RP)

E = Kontrol negatif ( tanpa penarnbal~an bakeri)

(29)

Penggunaan Penanda pada Bakteri Probiotik

Dengan menumbuhkan kurang lebih lo8 CFUIml bakteri probiotik tipe liar

sensitif rifampisin pada media SWC-agar yang mengandung rifampisin 50 pglml,

diperoleh mutan resisten rifampisin sebanyak 48 - 110 koloni. Morfologi koloni

maupun pertumbuhan mutan sama seperti tipe liarnya. Sebelum digunakan pada

uji mekanisme penghambatan probiotik pada larva udang, maka mutan

e m g

telah diperoleh ini diuji pertumbuhannya dan dibandingkan dengan tipe liarnya.

Menurut Herrera et al. (2003), resistensi terhadap antibiotik rifampisin terjadi karena adanya perubahan sub unit 0-RNA polimerase yang dikode oleh

gen rpo B. Penelitian Herrera et al. (2003) menggunakan 169 isolat Mycobacterium tuberculosis resisten rifampisin menunjukkan bahwa 95,3% galur resisten rifampisin karena adanya mutasi pada daerah 81-bp dari gen rpo B, sedangkan 4,7% tidak terdeteksi adanya mutasi pada daerah tersebut, diduga

strain tersebut menggunakan mekanisme resistensi yang belum diketahui. Lebih

jauh lagi dijelaskan bahwa mutasi pada daerah 81-bp dapat te rjadi karena adanya

perubahan satu, dua, atau tiga nukleotida, atau karena terjadi delesi dan insersi.

Madigan et al. (1997) juga menjelaskan bahwa secara alami bakteri dapat bersifat

resisten terhadap suatu antibiotik. Sifat resisten tersebut diperlukan oleh suatu

mikroorganisme untuk mempertahankan kehidupannya di dam. Menurut

Clzythanya et al. (1999), secara aiami beberapa jenis mikroorganisme memiliki gen penyandi antibiotik yang dapat melindungi dirinya dari serangan antibiotik

dari luar.

Pertumbuhan Bakteri Probiotik

l@

Hasil uji pertumbuhan bakteri probiotik baik tipe liar maupun yang diberi

penanda resisten rifampisin (Rf-R) dapat diliiat pada Gambar 8. Berdasarkan

basil tersebut dapat dilihat bahwa pertumbuhan 3 strain bakteri probiotik (IUb,

SKT-b, dan Ua) baik tipe liar maupun mutannya memiliki laju pertumbuhan yang

relatif sama. Pertumbuhan tertinggi ketiga strain bakteri probiotik tersebut dicapai

pada jam ke 10 - 14, dan akan menurun setelabnya. Hal ini berarti terjadinya

(30)

penanda untuk memonitor keberadaan bakteri tersebut pada larva udang dan

media pemeliharaan.

Menurut Hala (1999); Widanarni et al. (2004), 1.: hanteyi mutan Rf-R juga memiliki kemarnpuan bertahan hidup yang sauna dengan tipe liarnya.

?

I

harveyi mutan

fl

tersebut telah digumkan pada uji patogenitas.

1 ---club

i

0 2 4 6 8 10 12 14 16 16 20 Z2 24

I

Inkubasi (jam ke-)

I A I

I

!

0 2 4 a a 1012il , 8 4 8 2 7 2 2 2 4

I n k h s i (jam Ke-)

Inkubasi (jam ke-) I

(31)

Daya Harnbat Bakteri Probiotik terhadap V. hnrveyi pada Lama Udang Tiga isolat mutan balcteri probiotik diuji efektivitasnya dalam menghambat

serangan V. haweyi MR5339

Ri?

pada larva udang windu. Pengamatan dilakukan

terhadap kelangsungan hidup larva, pertumbuhan panjang dan bobot larva serta

populasi balcteri probiotik, V. harveyi MR.5339

Ri?

dan total bakteri baik pada air

pemeliharaan, udang hidup maupun udang mati.

Hasil pengujian menunjukkan bahwa ketiga isolat mutan probiotik tersebut

secara signifikan (p<0,05) dapat meningkatkan kelangsungan hidup larva udang (Gambar 9) seperti tipe liarnya (Gambar 5). Kelangsungan hidup larva pada

perlakuan dengan penambahan lUb, SKT-b, dan Ua berturut-turut adalah

86,67%, 88,33%, 83,33%, sedangkan perlakuan yang hanya diinokulasi dengan V.

harveyi MR5339

Ri?

tanpa probiotik, nilai kelangsungan hidupnya hanya

mencapai 5 1,67%.

A B C D E

Perlakuan

Keterangan :

A = 1Ub

@+MR

5339& B = SKT-b @+MR 5339~fR C = Ua &+MR 5339~fR

D = Kontrol positif (MR 5 3 3 9 p ) E = Kontrol negatif ( tanpa penambahan bakteri)

Ganibar 9. Kelangsuigan hidup larva udang pada uji daya hambat bakteri probiotik terhadap V. harveyi

Peningkatan nilai kelangsungan hidup larva udang terjadi karena adanya

penghambatan pertumbuhan V. hmveyi pada larva udaig oleh bakteri probiotik,

Hal

u~

ditunjukkan oleh lebih tingginya jumlah sel V. haweyi MR5339

Ri?

pada

(32)

penambahan probiotik, baik pada larva mati (Gambar lo), larva hidup (Gambar

1 I), maupun air pemeliharaan (Gambar 12).

Jumlah sel V. harveyi MR5339

RfR

pada larva mati (Gambar 10) berkisar

antara lo2 - lo4 CFUAarva, diduga kisaran angka tersebut menunjukkan jumlah

sel V. harveyi yang dapat menyebabkan kematian pada larva udang. Banyaknya

julnlah larva yang mati setiap hari pada perlakuan tanpa penambahan probiotik

juga menunjukkan tidak adanya aktivitas penghambatan V. harveyi oleh bakteri

probiotik. Pada penelitian Widanami (2004), Muliani et al. (2003) dan Hala et al.

(2002), jumlah K harveyi yang ditemukan pada larva yang mati berkisar antara

10' - 1

o4

CFUIlarva.

Pada Gambar 11 terlihat bahwa jumlah sel V. harveyi MR5339

RfR

pada

larva hidup untuk perlakuan dengan penambahan probiotik berkisar 10' - lo2

CFUllarva, dan sudah tidak terdeteksi iagi pada hari ke-4, sedangkan pada

perlakuan tanpa probiotik jurnlah sel V. harveyi berkisar antara lo2 - lo3 CFUIlarva atau mendekati jumlah sel V. harveyi pada larva mati. Hal ini

meiiunjukkan bahwa peningkatan nilai kelangsungan hidup pada perlakuan

dengan penambahan bakteri probiotik karena adanya kompetisi dari bakteri

probiotik yang mencegah tercapainya jumlah (quorum) V. harveyi yang dibutuhkan untuk mengekspresikan faktor-faktor virulensinya yang kemudian

dapat membunuh larva udang. Penghambatan perhimbuhan K harveyi oleh

bakteri probiotik dapat berupa kompetisi pelekatan atau sumber nutrien atau

produksi senyawa antimikrob (Verschuere et al. 2000).

Pada Gambar 12 terlihat p e n m a n jumlah sel V. harveyi MR5339

I@

pada air pemeliharaan hingga lo2

-

lo4 CFUIml pada hari kedua, dan sudah tidak

terdeteksi lagi pada hari ke-6. Adanya penghambatan bakteri probiotik

menyebabkan jumlah sel V. harveyi MR5339

RfR

pada perlakuan dengan

(33)

1

1 2 3 4 Waktu( hari )

i

,

-I

Zr

:T22m

1

m

j

2

..I 0

1 2 3 4

WaMu (hari)

Gmbar 10. Populasi bakteri probiotik, I! hapveyi, dan totai bakteri pada larva udang mati pada uji daya hambat bakteri probiotik terhadap I!

(34)

Waktu (hnri)

2

fll SKT-b Rf-R

Ei3 K harveyi

&3 Total Bnkteri

1

--

I

K harvq~i

Total BRkteri

1

I

Q Total Bakteri

0 2 4 6 8 1 0 1 2

i

waku (hari)

/

0 2 4 6 8 1 0 1 2

!

Wnktu (hari) [image:34.599.214.418.77.630.2]

(35)

I

0 2 4 6 8 1 0 1 2

Waktu (hari)

---

-UaRf-R I-'

-

8

6

8

- 4

S 2

0

0 2 4 6 8 1 0 1 2

1

Waktu (hari)

1

0 2 4 6 8 1 0 1 2 I

- P C - -

-! ₀ ₂ ₄ ₆ _{8 1 0 1 2}

[image:35.595.201.419.75.649.2]

Waktu (hari)

(36)

Populasi total bakteri dari seluruh perlakuan memiliki pola yang sama,

baik pada larva udang hidup, larva udang mati maupun

air

pemeliharaan (Gambar

10, 11, dan 12), yang mana jumlah populasinya mengalami penurunan hingga

akhir penelitian, dan populasinya mendekati total bakteri pada udang kontrol.

Adanya penurunan ini diduga bersamaan dengan berkurangnya populasi bakteri

probiotik maupun V. harveyi ~ ~ 5 3 3 9 e yang diinokulasikan sehingga populasi

bakteri kembali mendekati populasi bakteri alaminya.

Pemberian bakteri probiotik selain dapat menekan pestumbuhan bakteri

patogen juga dapat meningkatkan laju pertumbuhan hewan akuatik. Peranan

bakteri probiotik dalam meningkatkan laju pertumbuhan hewan akuatik

dilaporkan oleh Rengpipat et al. 1998 dan Douillet and Langdon 1994. Pada Gambar 13 dan Lampiran 7 terlihat larva udang yang diberi probiotik memiliki

nilai pertumbuhan panjang lebih besar (5.16 - 5.32%) dibanding perlakuan tanpa

probiotik (4.90 - 5.02%). Demikian pula untuk pestumbuhan bobot (Gambar 14)

menunjukkan bahwa larva yang diberi probiotik menghasilkan pertumbuhan

bobot lebih besar (1 1.27 - 11.99 YO) dibanding perlakuan tanpa pemberian

probiotik (9.35 - 10.63%) (Lampiran 8). Hal ini menunjukkan bahwa penambahan

bakteri probiotik dapat meningkatkan pertumbuhan panjang dan bobot pada larva

udang windu. Diduga pada perlakuan tanpa penambahan probiotik, larva udang

menggunakan sebagian energi pertumbuhannya untuk mengatasi serangan V. harveyi, sehingga pertumbuhan panjang dan bobotnya lebih rendah dibanding

perlakuan dengan penambahan bakteri probiotik sedangkan pada perlakuan

dengan penambahan probiotik, bakteri probiotik bekerja mengeliminir populasi !?

harveyi, sehingga larva udang dapat memanfaatkan energi yang tersedia lebih banyak untuk pertumbuhmnya. Selain itu juga kemungkinan bakteri probiotik

yang diberikan mengandung makro dan mikro nutrien yang dibutuhkan larva

udang dan dapat memberi kontribusi enzim untuk pencemaan yang menyebabkan

udang dapat mencema pakan lebih baik, sehingga nutrisi yang diserap oleh t~tbuh

udang juga lebih banyak, yang akbimya akan mernberikan pertumbuhan yang

(37)

i

a

A B C D E

1

Perlakuan

I

Keterangan:

A = IU~&+MR 5339RfR B = SKT-~R~R+MR 5 3 3 9 e C = Ua @+MR 5339RfR D = Kontrol positif (MR 5 3 3 9 ~ p ) E = Kontrol negatif (tanpa penambahan bakteri)

Gambar 13. Pertumbuhan panjang larva udang pada uji daya hambat bakteri probiotik terhadap V. harveyi

A B C D

Perlakuan

Keterangan:

A = l ~ b R f R + MR 5339@ B = S K T - ~ R ~ + M R 5339RfR C = u~R~R+MR 5 3 3 9 p

[image:37.595.214.440.78.240.2]

D = Kontrol positif (MR 5339Rp) E = Kontrol negatif ( tanpa penambahan bakteri)

Gambar 14. Pertumbuhan bobot larva udang pada uji daya hambat bakteri probiotik terhadap V. harveyi

Identifikasi Bakteri Probiotik

Hasil analisis sekuen sebagian gen 16-rRNA menunjukkan bahwa isolat

SKT-b termasuk spesies Vibrio alginolyticus dengan indeks kemiripan 88%, 1Ub

(38)

sedangkan Ua tennasuk spesies Vibrio alginolyticzis dengan indeks kerniripan 98%.

Gomez-Gil et al. (2002) menyatakan V. alginolyiicus C7b yang d i i l t u r

bersama microalga Chaetoceros muellasi dapat meningkatkan pertumbuhan

udang. Gullian et al. (2004) menggunakan

V.

alginolpicus sebagai probiotik pada

udang vaname dapat meningkatkan irnunitas udang uji, sedangkan isolat Vib~io

lainya (Vibrio P62) yang diisolasi dari hepatopankreas udang sehat potensial

sebagai probiotik. Selanjutnya Austin et al. (1995) melaporkan bahwa V.

alginolyiicus efektif sebagai probiotik udang karena dapat mengurangi serangan

penyakit yang disebabkan oleh V. anguillarum dan V. ordaIii. Muliani et al.

(2003) melaporkan ballwa isolat BL542 yang kemudian diidentifikasi sebagai

Pseudoalteromonas sp. efektif menghambat pertumbuhan V. harveyi MR5339

secara in vivo pada larva udang windu karena senyawa antimikrob yang

dihasilkannya. Hala et 01. (2002) juga melaporkan bahwa V: metschnikovii yang

diisolasi dari larva udang windu potensial digunakan sebagai probiotik karena

(39)

KESIMPULAN

Kesimputan

1. Isolat probiotik lUb, SKT-b dan Ua efektif menghambat pertumbuhan V.

harveyi dan dapat meningkatkan kelangsungan hidup larva udang windu.

2. Peningkatan kelangsungan larva udang tersebut terjadi karena adanya

penghambatan pertumbuhan

I.:

harveyi oleh bakteri probiotik yang

kemungkimn karena adanya kompetisi nutrisi atau kompetisi tempat

pelekatan.

3. Penanda molekuler resisten rifampisin efektif digunakan untuk memonitor keberadaan bakteri probiotik pada larva udang dan media

(40)

DAFTAR PUSTAKA

Austin BLF, Stucken PA, Robertson W, Griffith DRW. 1995. A probiotic strain of Vibrio alginolyticus effective in reducing diseases caused by Aeromonas salmonicida, Vibrio anguillarum and Vibrio ordalii. J. Fish Diseases, 18:93-96.

Austin B, Pride AC, Rhodie GA. 2003. Association of a bacteriophage with virulence in Vibrio harveyi. Fish Disease 26: 55-58.

Baumann P, Ftuniss AL, Lee

JV.

1994. Facultative anaerobic g a m negative rods. Di dalam: Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Wilkins ST, editor. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Ed ke-9. Baltimore: The Williams and Wilkins. hlrn 175-289.

Brock JA, Lightner DV. 1990. Chapter 3: Disease of Crustacea. In: 0. Kinne(ed). Disease of marine animals vol. 3, Biologische Anstalt Helgoland, Hamburg. pp. 245-424.

Chen D. 1992. An overview of the disease situation, diagnostic techniques, treatments and preventatives used on shrimp f m s in China. The Oceanic Institute, Hawaii. pp. 47-55.

Chytanya R, Nayak D.K, Venugopal M.N. 1999. Antibiotic resistence in aquaculture. News from around the world. Infofish International, 6:30-32.

Douillet PA, Langdon CJ. 1994. Use of a probiotic for the culture of larvae of the Pacific Oyster ( Crassoshea gigas). Aquaculture, 119:25-40.

Fuller R. 1992. History and Development of Probiotics. Di dalam: Fuller R, editor. Probiotics the Scientific Basis. London: Chapman and Hall. hlm 1-8.

Gomez-Gil B, Roque A, Tumbull JF. 2000. The use and selection of probiotic bacteria for use in the culture of larval aquatic organisms. Aquaculture,

191 :259-270.

Gullian M, Thompson F, Rodriguez J. 2004. Selection of probiotic bacterial and study of their immunostimulatory effect in Penaeus vanamei. Aquaculture, 233:l-14.

Hala Y. 1999. Penggunaan gen penanda molekuler untuk deteksi pelekatan clan kolonisasi K harveyi pada larva udang windu (Penaeus monodon). [Disertasi]. Bogor. lnstitut Pertmian Bogor.

(41)

Haryanti, Sugama k, Tsumura S, Nishijirna T. 2000. Potentiality of bacteria isolated fiom seawater as biological control agent for vibriosis in black tiger shrimp Penaeus monodon larvae. International Symposium on Marine Biotechnology (ISMB 2000). Center for Coastal an Marine Resources Studies, IPB, Bogor, Indonesia, 29-31 May 2000,182-189.

Haryanti, Sugama K. 2002. Prospek pemanfaatan bakteri probiotik Alteromonas BY-9 dibanding Oxytetracycline dalam pemeliharaan larva udang windu (Penaeus monodon). Di dalam: Jumal Ilmu-Ilmu Perairm dan Perikanan Indonesia,M(l): 19-27.

Herrera L, Jimenez S, Valverde A, Garcia-Aranda MA, Saez-Nieto A. 2003. Moleculer analysis of rifampisin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolated in Spain (1996-2001). Description of new mutations in the rpo B gene and review of the literature. Int J Antimicrob Agents 21:403-408.

Karunasagar I, Pai R, Malathi GR, Karunasagar I. 1994. Mass Mortality of Penaeus monodon larvae due to antibiotic-resistant Vibrio harveyi infection. Aquaculture, 128:203-209.

Otta SK, Kanmasagar I. 1996. Biofilm formation by Vibrio harveyi on surfaces. Aquaculture, 140 : 241 -245.

Lavilla-Pitogo CR, Baticados MCL, Cruz-Lacierda ER, DE la Pena LD. 1990. Occurence of luminous bacterial diseases of Penaeus monodon larvae in the Philiphines. Aquaculture, 91 : 1-13.

Madigan MT, Martinto JM, Parker J. 1997. Brock Biology of Microorganisms. Ed ke-8. New Jersey : Prentice- Hall.

Marchesi JR et al. 1998. Design and evaluation of useful bacteiium-spesific PCR primers

that

amplify genes coding for bacterial 16 rRNA. J. Appl. Environ. Microbial 62: 2501-2507.

Meighen EA. 1991. Moleculer biology of bacterial bioluminescence. Microbial Rev 55; 123-142.

Moiiarty DJW. 1999. Diseases Control in Shrimp Aquaculture with Probiotic Bacterial. Di dalam: Bell Cr, Brylinsky M, Jolmson-Green P (editor). 1999. Microbial Biosystem: New Frontiers. Proceedings of the 8" International Symposium on Microbial Ecology. Atlantic Canada Society for Microbial Ecology, Halifax, Canada.

Muliani, A. Suwanto, dan Y. Hala. 2003. Isolasi dan karakterisasi bakteri asal laut Sulawesi untuk biokontrol penyakit Vibriosis pada larva udang windu (

Penaeus monodon). Hayati, 105-11.

(42)

Arthur

(eds). Diseases in Aquaculture 1. Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila, Philiphines.

Prayitno, S.B. J.W. Latchford. 1995. Experimental infections of crustaceans with luminous bacterial related to Photobacterium and Vibrio. Effect of saliity and pI.1 on infectiosity. Aquaculture, 132: 105-1 12.

Proksch P. 2000. Bioactive natural products from marine invertebrates and associated microorganisms. Proc. Int. Symposium on Marine Biotechnology. Jakarta.

Rajab F. 2006. Isolasi dan seleksi bakteri probiotik dari lingkungan tambak dan hatchery untuk pengendalian penyakit Vibriosis pada Larva Udang W i d u (

Penaeus monodon).

Rengpipat SS, Rukpratanporn S, Piyatiratitivorakul S, Menasveta P. 1998a. Probiotic in aquaculture: a case study of probiotic for larvae of black tiger shrimp (Penaeus monodon). Di dalam: Flagel TW, editor. Advances in Shrimp Biotechnology. Proceedings to the special session n shrimp biotechnology, 5'' Asian Fisheries Forum; Chiengmai, Thailand. Bangkok: National Center for Genetic Engineering and Biotechnology. hlm 176-1 8 1. Rengpipat SS, Piyatiratitivorakul S, Menasveta P. 1998b. Effects of a probiotic

bacterium on black tiger shrimp Penaeus monodon survival and growth. Aquaculture, 167:301-313.

Ruby EG. 1996. Lesson from a cooperative bacterial-animal association: the Vibrio fisheri- Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu Rev Microbiol50:591-624.

Saulnier D. H&er P, Goarant C, Levy P, Ansquer D. 2000. Experimental infection models for shrimp vibriosis studies : a review. Aquaculture,

191:133-144.

Suwanto A, Yogiara, Suyanto D, Tan I, Puspitasari E. 2002. Compilation of Praticial Manual. Biotrop Trainiig Course in Microbial Biodiversity.

Suryati E, Parenrengi A, Muliani. 2004. Analisis toksisitas dan penanggulangan penyakit udang windu Penaeus nzonodon Fabricus menggunakan bioaktif sponge. Prosiding Pengendalian Penyakit pada ikan dan udang berbasis imunisasi dan biosecurity, Punvokerto, 18-19 Mei 2004.

Tjahjadi MR, Angka SL, Suwanto A. 1994. Isolation and evaluation of marine bacteria for biocontrol of luminous bacterial diseases in tiger shrimp larvae (Penaeus monodon Fab.). Aspac J Mol Biol Biotechnol2:234-352.

(43)

Verschuera L, Rombaut G, Sorgeloos P, Verstraete W. 2000. Probiotic bacterial as biological control agents in aquaculture. Microbiol Mol Biol Rev 64: 655- 671.

Vi1a.mil L, Figueras A, Planas M, Novoa B. 2003. Control of Vibrio alginolyticz~s in Artemia culture by treatment with bacterial probiotics. Aquacultme, 219:43-56.

Vine NG, Leukes WD, Kalser H, Daya S, Baxter J, Hecht T. 2004. Competitions for attachment of aquaculture candidate probiotic and pathogenic bacteria on fish intestinal mucus. Journal of Fish Disease 27: 3 19-326.

Widanarni, Suwanto A, Sukenda, Lay BW. 2003a. Potency of Vibrio isolates for biocontrol of vibriosis in tiger shrimp (Penaeus monodon) larvae. Biotropia 20~11-23.

Widanami. 2004. Penapisan bakteri probiotik untuk biokontrol vibriosis pada larva udang windu: kontruksi penanda molekuler dan esai pelekatan. [Disertasi]. Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Widanami, D. Meha, S. Nuryati, Sukenda dan A.Suwanto. 2004. Uji patogenisitas

(44)

(45)

Lampiran 1. Komposisi media SWC-agar (Seawater Complete agar), SWC- cair dan TCBS-agar (Tlriosulphate Citrate Bile-Salt sucrose agar)

1. SWC-agar (Seawater Complete agar)

*% Bacto Peptone 5 g

d:a

Yeast Extract 1 g

*:

* Bacto Agar 20 g

Q Glycerol 3 ml

+3 Air Laut 750 ml

*:

* Aquades 250 ml

2. SWC-cair (Seawater Complete-broth)

*:

* Bacto Peptone 5 g

+:

* Yeast Extract 1 i%

Q Glycerol 3 ml

43 Air Laut 750 ml +:

* Aquades 250 rnl

3. TCBS-agar (Thiosulphate Citrate Bile-Salt sucrose agar)

*:

* TCBS agar 89 g

(46)

Larnpiran 2. Pembuatan larutan stok rifampisin

1. 10 mg rifampisin Oif) diiasukkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml.

2. 50 p1 ddHzO ditambahkan ke dalam tabung untuk mempermudah pelarutan Rf.

3. 950 p! alkohol sbsolut ditaiibahkan kexudias di~oitex kngpa iercainp-a sehingga diperoleh konsentrasi larutan stok rifampisin 10 mg/ml.

4. Dosis Rf yang digunakan adalah 50 pg/ml media.

5. Lamtan stok Rf disimpan pada suhu mang dengan kondisi gelap atau

(47)

Larnpiran 3. Kelangsungan hidup larva udang windu pada uji in vivo bakteri probiotik

(48)

Lampiran 5. Perhimbuhan bobot larva udang windu pada uji in vivo bakteri probiotik

(49)

(50)

(51)

MEKANISME PENGHAMBATAN BAKTERI PROBIOTIK TERHADAP PERTUMBUHAN Vibrio lrnrveyi PADA LARVA

UDANG WINDU (Penneus monodon)

EVA AYUZAR

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(52)

PE

ATAAN MENGENAI TESIS DAIO

SUNUBER INFO

SI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Mekanisme Penghambatan Bakteri Probiotik terhadap Pertumbuhan Vibrio harveyi pada larva udang windu (Penaeus monodon) adalah benar hasil karya saya sendiri dan merupakan bagian dari penelitian hibah bersaing dengan judul "Bakteri Probiotik dalam Budidaya Udang: Seleksi, Mekanisme Aksi, Karakterisasi dan Aplikasinya sebagai Agen Biokontrol". Sumber inforrnasi yang berasal atau d i t i p dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka dibagian akhir tesis ini.

Bogor, Januari 2008

(53)

ABSTRAK

EVA AWZAR. Mekanisme Penghambatan Bakteri Probiotik terhadap Pertumbuhan Vibrio harveyi pada Larva Udang Windu (Penaeus monodon). Dibimbmg oleh S W N D A dan W I D A N M I .

(54)

ABSTRACT

EVA AYUZAR. Inhibitory mechanism of probiotic bacteria on the growth of Vibrio harveyi in tiger shrimp (Penaeus monodon) larvae. Under the guidance of SUKENDA, and WIDANARNI.

(55)

PEND UAN

Latar Belakang

Serangan penyakit dan penurunan kualitas lingkungan budidaya

merupakan masalah yang timbul dalam usaha pembenihan udang. Salah satu

penyakit udang yang membahayakan adalah penyakit udang berpendar atau

luminescent vibriosis yang disebabkan oleh Ebrio harveyi. V. harveyi dapat

menyerang udang pada berbagai stadia mulai dari nauplius, zoea, mysis dan post

larva di pembenihan hingga udang dewasa di tambak pembesaran (Saulnier et al.

2000).

Salah satu alternatif untuk menanggulangi permasalahan penyakit vibriosis

adalah dengan menggunakan bakteri probiotik sebagai biokontrol yang dapat

menghambat pertumbuhan V. harveyi. Bakteri probiotik yang digunakan sebagai

biokontrol dapat diisolasi dari tambak atau pembenihan udang (Tjahjadi et al.

1994; Hary'anti et al. 2000), air dan sediien laut (Muliani et al. 2003) atau

invertebrata laut seperti sponge (Suryati et al. 2004) serta terumbu karang

(Proksch, 2000).

Tiga isolat bakteri kandidat probiotik koleksi Laboratorium Kesel~atan

Ikan, Departemen Budidaya Perairan, IPB yakni 1Ub (Tepu, 2006), SKT-b

(Widanami et al. 2003) dan Ua (Rajab, 2006) telah diuji mampu menghambat pertumbuhan V. harveyi secara in vitro dan dapat meningkatkan kelangsungan hidup larva udang pada uji in vivo.

Untuk mempelajari mekanisme aksi bakteri probiotik tersebut dalam

menghambat pertumbuhan V. harveyi pada larva udang dilakukan dengan memberikan penanda molekuler pada bakteri probiotik dan patogen, sehingga

keberadaan bakteri tersebut pada larva udang dapat diamati. Penanda resistensi

terhadap antibiotik rifampisin

(RfR)

merupakan suatu pilihan karena bakteri asal

laut pada umumnya sensitif terhadap rifampisin (Tjahjadi et al. 1994). Selain itu

mutan spontan resisten rifampisin bersifat stabil pada media tanpa penambahan

antibiotik (Hala et al. 2002) sehingga dapat digunakan 14i tantang pada jangka

(56)

dari bakteri lain yang sebelumnya telah terdapat pada larva udang atau air media

pemeliharaannya.

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari mekanisme penghambatan

bakteri probiotik terhadap pertumbuhan V. hurveyi pada larva udang windu

(57)