VALIDASI METODE WEI
HAAR YANG DIMODIFIKASI
UNTUK ANALISIS 3-CHLOROPROPANE-1,2-DIOL (3-MCPD)
DAN ESTERNYA PADA MINYAK GORENG SAWIT
TANTI LANOVIA
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Validasi Metode Weihaar yang Dimodifikasi untuk Analisis 3-Monochloropropane-1,2-Diol (3-MCPD) dan Esternya pada Minyak Goreng Sawit adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2013
RINGKASAN
TANTI LANOVIA. Validasi Metode Weihaar yang Dimodifikasi untuk Analisis 3-Monochloropropane-1,2-Diol (3-MCPD) dan Esternya pada Minyak Goreng
Sawit. Dibimbing oleh NURI ANDARWULAN dan PURWIYATNO HARIYADI.
Masalah keamanan pangan mencakup mata rantai pangan dari hulu ke hilir, dari ternak mulai dikembangbiakkan atau tanaman pangan mulai dibudidayakan hingga pangan dikonsumsi. Undang-undang Pangan No 18 tahun 2012 menyatakan bahwa keamanan pangan adalah kondisi dan upaya yang diperlukan untuk mencegah pangan dari kemungkinan cemaran biologis, kimia, dan benda lain yang dapat mengganggu, merugikan, dan membahayakan kesehatan manusia serta tidak bertentangan dengan agama, keyakinan, dan budaya masyarakat sehingga aman untuk dikonsumsi.
Senyawa 3-monochloropropane-1,2-diol atau 3-MCPD dan esternya merupakan salah satu kontaminan yang terbentuk pada saat proses pengolahan beberapa bahan pangan. Kedua senyawa tersebut ditemukan dalam minyak nabati dan beberapa pangan olahan, khususnya pada pangan yang menggunakan panas dalam proses produksi.
Mekanisme pembentukan 3-MCPD dan esternya dalam pangan belum sepenuhnya dapat dipahami, namun sintesisnya diduga terjadi akibat adanya reaksi antara klorin dan lipid selama proses pengolahan, pemasakan dan penyimpanan yang dipicu oleh pemanasan atau reaksi enzim-katalis.
Pengembangan metode analisis untuk identifikasi 3-MCPD ester telah dilakukan baik secara langsung maupun tidak langsung. Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi metode analisis Weihaar yang dimodifikasi untuk penetapan kadar 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit. Penelitian dilakukan dalam tiga tahap utama meliputi penentuan modifikasi metode analisis penetapan kadar 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit secara GC-MS; validasi metode Weihaar yang dimodifikasi untuk analisis 3-MCPD dan esternya; penetapan kadar 3-MCPD dalam beberapa minyak goreng sawit.
Hasil validasi metode analisis 3-MCPD dalam minyak goreng sawit sesuai dengan kriteria akurasi, presisi, linieritas, dan spesifisitas yang ditunjukkan oleh persamaan linear y = 0.076x + 0.005 dengan nilai koefesien korelasi (r) 0.994, rentang kerja 0.008 sampai 0.377 mg/L, batas deteksi 0.06 mg/kg, batas kuantitasi 0.20 mg/kg, presisi (koefisien variasi (KV)) 6.16%, dan akurasi (persen rekoveri) antara 95.83-113.27%. Metode analisis ini dapat diaplikasikan untuk menentukan 3-MCPD dan esternya pada minyak goreng sawit. Kadar 3-MCPD ester dihitung sebagai selisih 3-MCPD total dan 3-MCPD. Hasil analisis 3-MCPD total pada beberapa sampel minyak goreng sawit komersial didapatkan dengan kisaran konsentrasi 13.94-34.52 mg/kg. Sampel dengan kandungan diasilgliserida yang tinggi akan memberikan hasil pengujian yang tinggi pula pada kadar 3-MCPD dengan koefesien korelasi sebesar (r) 0.752.
SUMMARY
TANTI LANOVIA. Validation of The Modified Weihaar’s Method for the Determination of 3-Monochloropropane-1,2-Diol (3-MCPD) and Its Ester in Palm oil. Supervised by NURI ANDARWULAN and PURWIYATNO HARIYADI.
Food safety problems may occur throughout the food chain from farm to fork. Food Law (law No. 18, 2012) stated that food safety is condition and efforts needed to prevent food from contamination of biological, chemical and other agents, that may interfere, harm, and harmful to human health and do not contradict with religions, beliefs, and culture of the society so that it will be safe to be consumed.
The compound of 3-monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD) and its ester are contaminants formed during the food processing. Both of these compounds are found in vegetables oil and some processed food, especially food processed using heat in the production process.
The mechanism of 3-MCPD formation and its esters has not been fully established. It has been hypothesized that 3-MCPD was formed by reaction between chlorine and lipids during cooking and storage process of food, that may be trigered by heat or enzyme-catalyzed reaction. Consequently, validated analytical method for analysis of 3-MCPD and its ester is needed.
The research aims were to validate the modified Weihaar's method of analysis of 3-MCPD and 3-MCPD esters in refined palm oil. The research was conducted in three main stages including determining the analysis method to determine the levels of 3-MCPD and its esters in palm oil using GC-MS; validation of analysis methods; and determining the levels of 3-MCPD in several product of palm oil.
Validation result shows the following: A linear regression line has an equation of the form y = 0.076x + 0.005, where x is area ratio of standard external and standard internal and y is concentration ratio of external standard and internal standard. The linearity was showed by corelation coefficient (r) 0.994; linear response was obtained between 0.008 and 0.377 mg/L; limit of detection was 0.06 mg/kg, limit of quantification was 0.20 mg/kg, precision (relative standard deviation (RSD)) was 6.16%, and accuracy (as percentage of recovery) was in range 95.83-113.27%. This result indicated that the modified method was valuable and sensitive for detection of 3-MCPD and 3-MCPD esters. Using the validated method, the 3-MCPD esters in commercial palm oil sample determined and calculated as the difference between total 3-MCPD and free 3-MCPD, was 13.24 mg/kg. The total 3-MCPD in several palm oil give result on concentration range 13.94-34.52 mg/kg. These results also showed that there was a correlation between 3-MCPD with diacylglyceride (DAG). The sampel with high DAG contents give a high test results of 3-MCPD, this relationship was expressed by the coefficient of correlation (r) 0.752.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang menguntip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB.
VALIDASI METODE WEI
HAAR YANG DIMODIFIKASI
UNTUK ANALISIS 3-CHLOROPROPANE-1,2-DIOL (3-MCPD)
DAN ESTERNYA PADA MINYAK GORENG SAWIT
TANTI LANOVIA
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul : Validasi Metode Weihaar yang Dimodifikasi untuk Analisis 3-Monochloropropane-1,2-Diol (3-MCPD) dan Esternya pada Minyak Goreng Sawit
Nama : Tanti Lanovia NIM : F251090011
Disetujui oleh Komisi Pembimbing
Prof Dr Ir Nuri Andarwulan, MSi Ketua
Prof Dr Ir Purwiyatno Hariyadi, MSc Anggota
Diketahui oleh
A.n. Ketua Program Studi Ilmu Pangan
Dr Ir Feri Kusnandar, M.Sc
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT, karena atas berkat dan rahmat-Nya karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian yang berjudul Validasi Metode Weihaar yang Dimodifikasi untuk Analisis 3-Monochloropropane-1,2-Diol (3-MCPD) dan Esternya pada Minyak Goreng Sawit ini merupakan bagian dari dan tesis dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Magister Sains Mayor Ilmu Pangan pada Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor.
Saya menyadari bahwa, tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, sangatlah sulit bagi saya untuk menyelesaikan penelitian dan penyusunan tesis ini. Oleh karena itu, saya mengucapkan terima kasih kepada Prof Dr Ir Nuri Andarwulan, MSi dan Prof Dr Ir Purwiyatno Hariyadi, MSc. yang telah memberikan bimbingan. Ucapan terima kasih juga penulis haturkan bagi Pimpinan Pusat Pengujian Obat dan Makanan, khususnya Kepala Bagian Pangan dan Pimpinan Pusat Riset Obat dan Makanan yang telah memberikan kesempatan untuk melakukan penelitian. Selain itu, ucapan terima kasih juga dihaturkan kepada keluarga dan teman-teman atas dukungan moril dan materil dalam menyelesaikan penelitian ini.
Akhir kata, saya berharap Allah SWT berkenan membalas segala kebaikan semua pihak yang telah membantu.
Bogor, Juli 2013
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL x
DAFTAR GAMBAR x
DAFTAR LAMPIRAN xi
1 PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Perumusan Masalah 3
Tujuan Penelitian 4
Manfaat Penelitian 4
2 TINJAUAN PUSTAKA 5
Senyawa 3-MCPD dan Esternya 5
Validasi Metode Analisis 9
Minyak Sawit 12
3 METODE 15
Bahan dan Alat 15
Metode Penelitian 15
Penentuan Metode Analisis 15
Validasi Metode Analisis 17
Penyiapan Larutan Baku 17
Parameter Validasi 18
Analisis 3-MCPD dan Esternya dalam Minyak Goreng Sawit 21
4 HASIL DAN PEMBAHASAN 23
Penetapan Modifikasi Metode Analisis 23
Validasi Metode Analisis 28
Analisis 3-MCPD dan Esternya dalam Minyak Goreng Sawit 31
5 SIMPULAN DAN SARAN 34
Simpulan 34
Saran 34
6 DAFTAR PUSTAKA 35
7 LAMPIRAN 39
DAFTAR TABEL
2.1 Kadar 3-MCPD ester dalam minyak nabati 6
2.2 Kadar 3-MCPD dan esternya dalam makanan 6
2.3 Mekanisme pembentukan 3-MCPD dalam pangan 7
2.4 Batas cemaran kimia 3-MCPD dalam makanan di Indonesia 9 2.5
2.6
Batas cemaran kimia 3-MCPD dalam makanan di beberapa negara Pembentukkan 3-MCPD, 3-MCPD ester dan glisidil ester pada proses pengolahan minyak goreng sawit
9 13 3.1 Batas rekoveri rata-rata pada matrik sampel 18 3.2 Nilai koefesien variasi Horwitz pada beberapa konsentrasi analit 20
4.1 Tahapan pengujian dan hasilnya 23
4.2 Karakteristik isoheksan dan heksan 24
4.3 Karakteristik ion (m/z) pada spektrum massa 3-MCPD dan 3-MCPD-d5
terderivatisasi
28 4.4 Nilai LOD dan LOQ dari beberapa jenis bahan pangan 30 4.5 Hasil uji presisi, rekoveri, batas deteksi dan batas kuantitasi 30 4.6 Kadar 3-MCPD total dan 3-MCPD dalam minyak goreng sawit 31 4.7 Kadar 3-MCPD total, DAG, TAG dan ALB dalam minyak goreng
sawit komersial
32
DAFTAR GAMBAR
2.1 Struktur 3-MCPD dan esternya 5
2.2 Pembentukan 3-MCPD dan esternya dari asilgliserol 8 2.3 Tahapan proses refining minyak sawit komersial secara kimiawi dan
fisik
13
3.1 Kurva terompet Horwitz 20
4.1 Spektrum massa hasil derivatisasi PBA untuk 3-MCPD-d5 dan
3-MCPD
25 4.2 Kromatogram TIC derivatisasi 3-MCPD-d5 dan MCPD (A),
3-MCPD-d5 m/z 201 (B), 3-MCPD-d5 m/z 150 (C), 3-MCPD m/z 196 4.4 Kurva linearitas 3-MCPD dalam blanko sampel minyak goreng sawit 29
4.5 Kromatogram 3-MCPD pada ion m/z 147 29
4.6 Hubungan antara diasilgliserida dengan 3-MCPD yang terkandung dalam minyak goreng sawit
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil pengujian untuk linearitas dan rentang kerja baku pembanding 39 2 Hasil pengujian rekoveri untuk mendapatkan data akurasi 39
3 Hasil pengujian LOD dan LOQ 40
1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Masalah keamanan pangan mencakup mata rantai pangan dari hulu ke hilir, dari ternak mulai dikembangbiakkan atau tanaman pangan mulai dibudidayakan hingga pangan dikonsumsi. Undang-undang Pangan No 18 tahun 2012 menyatakan bahwa keamanan pangan adalah kondisi dan upaya yang diperlukan untuk mencegah pangan dari kemungkinan cemaran biologis, kimia, dan benda lain yang dapat mengganggu, merugikan, dan membahayakan kesehatan manusia serta tidak bertentangan dengan agama, keyakinan, dan budaya masyarakat sehingga aman untuk dikonsumsi.
Terbukanya wawasan dan meningkatnya kesadaran konsumen terhadap pentingnya jaminan keamanan dan mutu pangan yang didukung oleh perkembangan teknologi juga kemajuan teknik deteksi dan analisis di laboratorium, sehingga ditemukan kontaminan baru terkait dengan keamanan pangan. Kontaminan dalam bahan pangan, cemaran lingkungan dan proses pengolahan (processing contaminant). Processing contaminants yaitu kontaminan yang disintesis selama proses pengolahan pangan terutama selama proses pemanasan, dan fermentasi. Kontaminan ini tidak terdapat pada bahan baku sebelum diolah tetapi dibentuk oleh reaksi kimia tertentu selama proses pengolahan. Keberadaan kontaminan ini tidak bisa dihindari, namun pemilihan dan pengendalian teknologi pengolahan yang lebih baik perlu dilakukan untuk meminimalkan pembentukan kontaminan tersebut (Hariyadi 2008).
Kontaminan dalam pangan merupakan sesuatu yang tidak dapat diterima dari segi kesehatan dan hal ini diatur oleh The Council Regulation (EEC) 315/93 tahun 1993. Peraturan tersebut menyatakan: 1) pangan yang terkontaminasi dan telah terbukti mengakibatkan toksisitas dan mengganggu kesehatan tidak boleh dipasarkan; 2) tingkat kontaminasi ditekan serendah mungkin dengan menerapkan Cara Produksi Pangan yang Baik (CPPB) dan sistem distribusi dan 3) kesehatan masyarakat harus dilindungi dengan mengatur batas maksimum kontaminan dalam pangan, termasuk cara sampling dan metode analisis yang digunakan (Larsen 2009).
2
pangan yang menggunakan panas dalam proses produksi, antara lain kentang goreng, donat, kreker asin, remah roti, dark malt, dan pangan fermentasi seperti haring asin dan sosis ditemukan 3-MCPD dengan kadar bervariasi antara 0.14 dan 6.10 mg/kg, selain itu ditemukan juga 3-MCPD ester dalam pangan yang kadarnya mencapai 5 sampai 396 kali lebih tinggi dari 3-MCPD (Svejkovska et al. 2004).
Minyak goreng sawit saat ini merupakan minyak nabati dengan jumlah konsumsi terbanyak yang digunakan sebagian besar masyarakat Indonesia dalam pada proses pengolahan, demikian pula pada industri pengolahan pangan. Sehubungan dengan penggunaan minyak goreng sawit yang luas tersebut maka adanya 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit patut menjadi perhatian. Hal ini sangat sulit dihindari karena selain faktor pengolahan minyak juga dipengaruhi oleh kebiasaan konsumen yang lebih menyukai jenis pangan yang diolah dengan cara digoreng daripada menggunakan cara pengolahan lainnya seperti rebus dan panggang. Selain itu keberadaan senyawa 3-MCPD ester dalam minyak nabati perlu mendapat perhatian karena bahan ini juga digunakan sebagai ingredient pada makanan bayi (Franke et al. 2009).
Hasil penelitian yang dilakukan oleh The Ministry for Nutrition and
Rural Areas Baden-Wurttemberg di Jerman melaporkan pangan yang
mengandung 3-MCPD dengan kadar tinggi adalah margarin, minyak nabati, pangan mengandung lemak termasuk makanan pendamping ASI. Penelitian ini juga menyebutkan bahwa hanya minyak nabati yang diproses tanpa tahapan pemanasan (seperti minyak zaitun murni) yang tidak mengandung 3-MCPD ester. Dikatakan bahwa 3-MCPD ester terbentuk pada suhu tinggi dan diduga terbentuk selama proses deodorisasi minyak nabati yang merupakan tahap akhir proses pemurnian untuk menghilangkan bau dan memperbaiki rasa (Larsen 2009).
Laporan uji klinik menyatakan bahwa 3-MCPD mempengaruhi ginjal hewan uji dan menurunkan kesuburan hewan uji jantan, namun belum ada laporan tentang uji klinik dan epidemiologi terhadap manusia. Batasan 3-MCPD dalam pangan ditetapkan dengan tolerable daily intake (TDI) 2
3
hidrolisis ataupun biosintesisnya didalam tubuh, serta penyimpanan dan pengaruhnya terhadap jaringan tubuh (Karsulinova et al. 2007).
The European Commision’s Join Research Centre pada tahun 2009 menyelenggarakan uji profisiensi untuk menilai kemampuan laboratorium dalam melakukan pengujian 3-MCPD ester yang diikuti oleh 34 laboratorium pada 11 negara Uni Eropa, Swiss dan Makedonia. Kinerja laboratorium pada pengujian 3-MCPD ester dalam minyak zaitun menunjukkan 85% laboratorium memberikan hasil yang memuaskan sedangkan untuk minyak goreng sawit hanya 56% (Karasek et al. 2010). Dari hasil uji profisiensi tersebut mengindikasikan bahwa perlu dilakukan validasi metode analisis sebelum melakukan pengujian rutin dengan menggunakan metode tersebut.
Mekanisme pembentukan 3-MCPD dan esternya dalam pangan belum sepenuhnya dapat dipahami. Sintesisnya diduga terjadi karena adanya reaksi antara klorin dan lipid selama proses pengolahan, pemasakan dan penyimpanan yang dipicu oleh pemanasan atau reaksi enzim-katalis (Watkins 2009). Faktor-faktor pembentukkan 3-MCPD adalah lesitin, asilgliserol, gliserol dan fosfolipid, sedangkan 3-MCPD ester dapat terbentuk dari fosfolipid dan gliserol (Velisek et al. 2003). Penelitian yang dilakukan Svejkovska et al. (2006) menemukan bahwa pembentukan 3-MCPD ester tergantung pada air, lemak dan kandungan garam dalam minyak serta dipengaruhi oleh suhu. Kadar 3-MCPD ester hasil pengujian berbanding lurus dengan konsentrasi minyak dan natrium klorida sehingga membuktikan bahwa 3-MCPD ester adalah komponen yang tidak stabil dan relatif mudah terurai selama pemanasan.
1.2 Perumusan Masalah
Kontaminan 3-MCPD dalam pangan merupakan hal yang perlu menjadi perhatian, membutuhkan tindak lanjut dan inisiatif pemerintah dan produsen pangan terhadap beberapa hal berikut ini: 1) ketersediaan metode analisis yang tervalidasi, termasuk preparasi sampel pada beberapa bahan pangan untuk mendapatkan hasil analisis yang akurat dan terpercaya; 2) riset mengenai pembentukan 3-MCPD dari esternya; 3) investigasi terhadap mekanisme pembentukan 3-MCPD ester selama proses pemurnian minyak nabati yang dilakukan untuk menurunkan jumlah 3-MCPD ester dan resiko minimal serta batasannya dalam minyak nabati; 4) penurunan batas resiko harus ditetapkan dan diaplikasikan pada proses produksi oleh produsen minyak nabati (Larsen 2009).
Pengembangan metode analisis 3-MCPD masih terbatas, terutama jenis matriksnya, serta belum adanya metode analisis terstandar, sehingga pihak berwenang lebih memilih metode analisis dengan parameter uji validasi yang lengkap sebagai pengganti metode standar. (Hrncirik et al. 2011).
4
salah satu negara penghasil minyak goreng sawit terbesar, sehingga perlu dilakukan penetapan metode analisis tervalidasi yang dapat digunakan untuk analisis 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit.
1.3 Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk memvalidasi metode analisis Weihaar yang dimodifikasi untuk analisis 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit dan menentukan kadar 3-MCPD ester dalam minyak goreng sawit komersial yang beredar dipasaran. Penelitian dilakukan dalam tiga tahap. Tahap pertama menentukan metode analisis 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit secara GC-MS yang bertujuan untuk mendapatkan metode yang dapat diterapkan sesuai dengan kondisi laboratorium. Tahap kedua yaitu validasi metode analisis. Tahap ketiga adalah menetapkan kadar 3-MCPD dalam beberapa minyak goreng sawit, untuk mendapatkan gambaran kadar 3-MCPD total dan 3-MCPD ester dalam minyak goreng sawit yang beredar di pasaran.
1.4 Manfaat Penelitian
2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Senyawa 3-MCPD dan esternya
Monokloropropandiol adalah nama umum dari 3-kloro-1,2-dihidroksipropan (3-chloro-1,2-dihydroxypropane) lebih populer dengan nama 3-MCPD yang merujuk pada 3-MCPD bebas, merupakan salah satu dari grup propanol yang dikategorikan sebagai kontaminan kimia. Senyawa 3-MCPD seringkali ditemukan dalam pangan dan bahan tambahan pangan sebagai hasil proses pengolahan pangan dan atau penyimpanan. Senyawa 3-MCPD ester merupakan 3-3-MCPD yang teresterifikasi dengan gliserida. Senyawa ini menjadi isu regulasi setelah dilaporkan oleh beberapa peneliti bahwa 3-MCPD ester terdapat dalam minyak dan lemak. (Svejkovská et al. 2004; Weißhaar 2008; Zelinkova et al. 2006). Struktur 3-MCPD dan esternya dapat dilihat pada Gambar 2.1.
Gambar 2.1 Struktur 3-MCPD dan esternya (Zelinková et al. 2006)
Senyawa 3-MCPD dikenal luas sebagai kontaminan pada acid-hydrolyzed protein vegetable (acid-HPV) yang biasanya digunakan sebagai penambah rasa pada makanan seperti sop, makanan siap saji, snack, kaldu dan kecap kedelai. Penelitian yang dilakukan oleh El Ramy (2006) menemukan adanya senyawa 3-MCPD pada produk serelia panggang dan sosis fermentasi. Kadar 3-MCPD dan esternya dalam pangan dapat dilihat pada Tabel 2.2. Pada minyak nabati kadar 3-MCPD terbagi atas 3 tingkatan yaitu tingkat rendah dengan kadar 0.5-1.5 mg/kg termasuk diantaranya minyak rapeseed, kedelai, kelapa dan bunga matahari, sedangkan tingkat sedang dengan kadar 1.5-4 mg/kg termasuk diantaranya minyak safflower, kacang tanah, zaitun, biji kapas dan dedak padi, sementara tingkat tinggi dengan kadar lebih dari 4 mg/kg termasuk diantaranya lemak terhidrogenasi, sawit dan fraksi minyak sawit (Tabel 2.1).
6
merupakan hasil hidrolisis 3-MCPD ester melalui reaksi yang dikatalisis oleh enzim lipase. Pada penelitian selanjutnya monoasilgliserol dan fosfolipid yang terdapat pada zat pengembang adonan roti juga merupakan prekursor yg penting pada pembentukan 3-MCPD dalam adonan roti (Zelinkova et al. 2006).
Tabel 2.1 Kadar 3-MCPD ester dalam minyak nabati
Minyak Jumlah Sampel Kadar rata-rata (mg/kg)
Tabel 2.2 Kadar 3-MCPD dan esternya dalam makanan
Bahan makanan
Sumber: Svejkovska et al. (2004) RSD=relative standard deviation (%); 3-MCPDn= 40% dihitung terhadap bobot kering; nd=dibawah batas deteksi (not detected); <3.30 mg/kg lemak= dibawah batas kuantitasi
7
Tabel 2.3 Mekanisme pembentukan 3-MCPD dalam pangan
Substrat Mekanisme Sumber yang direaksikan dengan gliserol dengan atau tanpa adanya asam asetat glasial membutuhkan pemanasan pada suhu 50-60 oC. Pembentukan 3-MCPD ini diduga terjadi pada produk olahan bawang putih.
Stadler et al. (2009). memanaskan campuran natrium klorida dan Tween 80 pada suhu 200 oC. Kadar 3-MCPD meningkat seiring dengan bertambahnya konsentrasi natrium klorida. Pada produk serelia yang dipanggang gliserol bebas merupakan prekursor utama untuk pembentukan 3-MCPD. Gliserol terbentuk akibat penambahan ragi untuk proses pengembangan yang pada proses pemanasan bereaksi dengan natrium klorida sehingga membentuk 3-MCPD.
Stadler et al. (2009).
3-MCPD ester
Pembentukan 3-MCPD secara enzimatis diteliti dengan menggunakan model sistem yang terdiri dari lipase, minyak nabati, natrium klorida dan air. Enzim lipase yang berasal dari Rhizopus oryzae memiliki aktivitas hidrolisis tertinggi terhadap gliserida dari minyak kelapa dan minyak kacang.
Senyawa MCPD dibebaskan dari 3-MCPD ester melalui reaksi hidrolisis yang dikatalisis oleh enzim lipase yang terjadi di dalam tubuh ataupun pangan
Robert et al. (2004) Zelinkova et al. (2006).
8
diasilgliserol dalam minyak nabati memberikan korelasi linier dengan pembentukan 3-MCPD ester (Larsen 2009).
Glisidol ester juga terbentuk selama proses pemurnian minyak nabati, zat ini dikenal sebagai senyawa yang bersifat genotoksik dan karsinogenik, namun belum ada data toksikologi yang mendukung pernyataan tersebut. Glisidol ester dianggap sebagai prekursor pada pembentukan 3-MCPD ester, dengan hadirnya ion klorida (Larsen 2009).
Mekanisme pembentukan 3-MCPD dan esternya yang berasal dari asilgliserol disajikan pada Gambar 2.2. Menaikkan pH pangan dengan kadar air tinggi, menurunkan suhu pengolahan pangan, mengurangi penggunaan garam dan menurunkan kadar gliserol selama pengolahan dan penyimpanan merupakan cara untuk mengurangi kontaminasi 3-MCPD (Zelinkova et al. 2006).
Senyawa 3-MCPD memberikan efek mutagenik secara in vitro namun tidak secara in vivo. Tikus yang diberi asupan 3-MCPD mengalami toksisitas akut yang memberi efek pada ginjal dan organ reproduksi dengan nilai LD50 sebesar 150 mg/kg berat badan. Pemberian 3-MCPD dengan
dosis > 25 mg/kg berat badan perhari dapat menimbulkan luka pada sistem syaraf pusat tikus dan mencit (WHO 2013). Minimnya data penilaian resiko 3-MCPD ester secara in vivo saat ini maka diasumsi 3-MPCD terbentuk secara sempurna dari pembebasan 3-MCPD ester (Hrncirik 2011).
9
Beberapa negara termasuk Indonesia telah pengeluarkan peraturan tentang batasan 3-MCPD dalam pangan, khususnya pada kecap dan acid-HPV, seperti tercantum pada Tabel 2.4 dan Tabel 2.5.
Tabel 2.4 Batas cemaran kimia 3-MCPD dalam makanan di Indonesia
Jenis Makanan Batas Maksimum (ppb atau g/kg) Semua makanan yang mengandung protein nabati
terhidrolisis secara asam (makanan cair)
20
Semua makanan yang mengandung protein nabati terhidrolisis secara asam (makanan padat)
50
Protein nabati terhidrolisis asam (acid-HPV) 1000
Sumber: BPOM (2009)
Tabel 2.5 Batas cemaran kimia 3-MCPD dalam makanan di beberapa negara
Sumber: Stadler et al. (2009)
2.2 Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis adalah suatu proses ilmiah yang dilakukan untuk membuktikan bahwa karakteristik kinerja metode analisis telah sesuai dengan tujuan pengunaannya atau konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus telah dipenuhi (Eurachem 1998). Validasi metode analisis perlu dilakukan karena tidak semua metode yang telah dikembangkan dapat diaplikasikan dan memenuhi kebutuhan laboratorium pengujian.
Negara Kadar
Cina 1 Acid-hydrolized vegetable protein Uni Eropa 0.02 Hydrolized vegetable protein dan
kecap (kepadatan 40%)
Korea 0.3 Kecap mengandung Acid-hydrolized vegetable protein
1 Hydrolized vegetable protein
Malaysia 0.02 Pangan cair dengan hydrolized vegetable protein
1 Acid-hydrolized vegetable protein
produk industry Swiss 0.2 Saus gurih
10
Pengujian yang benar dan tepat dilakukan untuk dapat menunjukkan dan menjamin keamanan produk pangan sehingga menjadi sangat penting untuk memilih metode tervalidasi, sesuai dengan regulasi dan memiliki parameter yang jelas. Validasi metode diharapkan untuk dapat memenuhi regulasi yang diterapkan pada produk, negara, dokumentasi serta proses dan persyaratan validasi itu sendiri (AOAC Official Method Apendix E 2005).
Tujuan validasi metode analisis adalah untuk menjamin mutu dan atau untuk mencapai tingkat mutu yang ditetapkan pada suatu produk, menjamin mutu produk agar dapat diterima oleh suatu badan internasional, mengkonfirmasi bahwa metode tersebut sesuai untuk penggunaan yang dimaksud, memenuhi persyaratan akreditasi, memenuhi persyaratan pendaftaran suatu produk dan untuk memenuhi persyaratan metode yang digunakan pada uji profisiensi (SNI 2008).
Parameter yang umum digunakan pada validasi metode analisis adalah; spesifisitas atau kekhasan, akurasi atau kecermatan, linieritas dan rentang kerja, presisi atau keseksamaan, batas deteksi, batas kuantitasi, (Codex Stan 193-1995 2010; AOAC Official Method Apendix E 2005; AOAC 2002; Eurachem 1998; ICH 2005).
Spesifisitas
Spesifisitas suatu metode analisis adalah kemampuan mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Spesifisitas dapat pula ditentukan dengan menggunakan sampel spike kemudian dianalisis dan dibandingkan dengan hasil analisis sampel tanpa bahan tambahan.
Linieritas
Linieritas merupakan hasil penjabaran visual suatu sinyal sebagai fungsi dari konsentrasi analit. Linieritas pada suatu prosedur analisis dapat menunjukkan hasil uji yang berbanding lurus dengan konsentrasi atau jumlah analit dalam sampel. Jika terdapat hubungan antara sinyal dan konsentrasi maka hasil analisis dapat dievaluasi secara statistik, seperti koefisien korelasi yang didapatkan dari persamaan y = bx + a. Penetapan Linieritas secara umum membutuhkan minimal 5 konsentrasi analit.
Rentang kerja
11
Akurasi
Akurasi merupakan suatu kecermatan atau ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi dapat ditentukan dengan beberapa cara, yaitu: 1) Metode simulasi (spiked-placebo recovery) yaitu suatu analisis kadar analit dengan cara menambahkan analit tersebut dalam matriks sampel yang dianalisis; 2) Metode penambahan baku (standard addition method). Cara ini dilakukan jika matriks dan eksipien tidak tersedia, maka akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali kadar analit yang ditambahkan pada sampel yang sudah atau belum mengandung analit; 3) Analisis kadar analit dengan metode yang divalidasi terhadap sampel yang telah diketahui kadarnya yang dikenal sebagai Standard Reference Materials (SRM). SRM adalah sampel acuan baku yang dikeluarkan oleh badan resmi seperti National Institute of Standards and Technology (NIST); 4) Membandingkan hasil analisis analit dengan metode yang divalidasi terhadap hasil dengan metode standar.
Presisi
Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil analisis individual jika prosedur dilakukan berulang kali terhadap sampel yang homogen. Presisi metode analisis dinyatakan sebagai simpangan baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (KV). Presisi dibagi atas 3 macam, yaitu repeatability atau keterulangan, presisi antara dan reprodusibilitas atau ketertiruan.
Keterulangan adalah kemampuan metode untuk memberikan hasil analisis yang sama untuk sampel yang kadarnya sama yang dilakukan oleh satu orang analis pada waktu tertentu terhadap beberapa sampel yang sama. Presisi antara adalah pengukuran kinerja metode di mana sampel-sampel diuji dan dibandingkan, dilakukan oleh analis yang berbeda, menggunakan peralatan berbeda dan pada hari yang berbeda. Presisi antara tidak perlu diuji jika uji reprodusibilitas telah dilakukan. Presisi ketiga yaitu reprodusibilitas merupakan cara yang paling lengkap atau tuntas, karena parameter validasi ini dilakukan oleh beberapa laboratorium. Hasil
reprodusibilitas ini akan memperlihatkan adanya galat acak yang
disebabkan oleh sampel dan laboratorium.
Batas deteksi dan batas kuantitasi
12
akurat dan presisi (LoQ); 2) Berdasarkan signal to noise. Cara ini hanya bisa dilakukan pada prosedur analisis yang dapat memperlihatkan baseline noise. Analisis dilakukan dengan membandingkan sinyal dari sampel rendah analit dengan sampel blanko; 3) Berdasarkan deviasi standar dari respon dan slope; 4) Berdasarkan deviasi standar dari blanko; 5) Berdasarkan kurva kalibrasi.
Metode analisis untuk identifikasi 3-MCPD ester dapat secara langsung ataupun tidak langsung dengan kelebihan dan kekurangannya masing-masing. Pada metode tidak langsung, 3-MCPD ditentukan sebagai MCPD bebas, ester dibebaskan menjadi komponen tunggal, kemudian 3-MCPD diderivatisasi dan ditetapkan secara GC-MS (Divinova et al. 2004; Weihaar 2008). Pada metode langsung, ester utama ditentukan langsung secara LC-TOFMS atau LC-MSMS (Haines et al. 2011).
Kelebihan metode analisis tidak langsung diantaranya adalah pengujian menggunakan GC-MS; lebih praktis karena hanya menentukan satu analit; metode yang tersedia lebih beragam; batas deteksi dan batas kuantitasi lebih rendah; hanya menggunakan dua baku pembanding (baku eksternal dan internal) yang dapat mendeteksi semua 3-MCPD ester. Kelemahan metode ini adalah hasil pengukurannya lebih besar dibandingkan menggunakan metode langsung, hal ini disebabkan adanya ion klorida pada saat proses hidrolisis, dan glisidol ester yang diubah menjadi 3-MCPD pada proses preparasi; tidak efektif karena membutuhkan waktu preparasi yang lebih lama. Metode ini hanya dapat digunakan jika 3-MCPD telah dibebaskan dari esternya. Terdapat tiga cara pemisahan, yaitu: 1) hidrolisis basa, dengan menggunakan metoksida, cara ini cepat dan mudah, namun cemaran klorida dan glisidil ester dapat meningkatkan level 3-MCPD ester, 3-MCPD tidak stabil pada saat hidrolisis yang dapat menurunkan sensitifitas metode; 2) hidrolisis enzimatik namun metode ini jarang digunakan; 3) hidrolisis asam, metode ini membutuhkan waktu hidrolisis yang panjang, cemaran klorida dapat meningkatkan level 3-MCPD namun efeknya dapat dikurangi dengan melakukan ekstraksi menggunakan H2O; 3-MCPD saat hidrolisis asam kondisinya lebih stabil
(Pinkston et al. 2012).
2.3 Minyak Sawit
Minyak sawit mentah atau crude palm oil (CPO) dikenal sebagai sumber yang kaya akan antioksidan (tokoferol, tokotrienol, karotenoid, fitosterol, senyawa fenolik) dan fitonutrien yang berguna untuk kesehatan. Namun, CPO terlebih dahulu harus melewati proses pemurnian sebelum digunakan sebagai bahan pangan (Szydlowska-Czerniak et al. 2011)
13
dan deasidifikasi pada pemurnian fisik dilakukan pada suhu 250-270 ºC dengan tekanan 3-5 torr, tahapan ini terlihat pada Gambar 2.3. Penggunaan suhu tinggi ini akan memicu perubahan 3-MCPD ester menjadi 3-MCPD (Greyt 2010). Proses pengolahan minyak sawit yang berpengaruh terhadap pembentukkan 3-MCPD, 3-MCPD ester dan glisidil ester dijabarkan pada Tabel 2.6.
Gambar 2.3 Tahapan proses refining minyak sawit komersial secara kimiawi dan fisik (Greyt 2010)
Tabel 2.6 Pembentukkan 3-MCPD, 3-MCPD ester dan glisidil ester pada proses pengolahan minyak goreng sawit
Proses pengolahan minyak goreng sawit
Pembentukan 3-MCPD, 3-MCPD ester dan glisidil ester
Crude oil 3-MCPD terbentuk pada proses refining
(deodorisasi) pada suhu 240-270 °C
Degumming
3-MCPD diester sebagian besar terbentuk dari triasilgliserol, sebagian diasilgliserol. Proses pembentukan ini membutuhkan sumber klorida
Bleaching
Sumber utama glisidil ester adalah diasilgliserol, proses ini tidak membutuhkan klorida. Triasilgliserol tidak membentuk glisidil ester.
Deodorizing 3-MCPD ester dan glisidil ester terbentuk
hingga 20 mg/kg
14
3
METODE
3.1 Bahan dan Alat
Baku eksternal 3-MCPD dan baku internal 3-MCPD-d5 (Fluka,
Sigma-Aldrich), Phenylboronic acid (PBA) untuk derivatisasi (Sigma-Aldrich), natrium metoksida untuk transesterifikasi (Merck), heksan (Merck), etil asetat (Merck), asam asetat glasial (Merck), natrium klorida (Merck), aseton (Merck), methyl tert-butyl ether (MTBE) (Sigma-Aldrich), dan sampel minyak goreng sawit yang diperoleh dari supermarket dan pasar tradisional. Instrumen utama yang digunakan untuk analisis adalah GC-MS yang dilengkapi autosampler, instrumen penunjang yang digunakan antara lain penangas air dan vorteks.
3.2 Metode Penelitian
Penelitian ini dibagi dalam 3 tahap kegiatan, yaitu: penentuan modifikasi metode analisis, validasi metode analisis 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit secara GC-MS dan analisis 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit.
3.2.1 Penentuan Metode Analisis
Metode analisis yang digunakan adalah metode Weihaar yang dimodifikasi, terdiri dari tiga tahapan yaitu ekstraksi, derivatisasi dan analisis dengan menggunakan kromatografi gas-spektrometri massa (GC-MS). 3-MCPD dibebaskan dari 3-MCPD ester secara transesterifikasi dengan natrium metoksida dalam metanol, kemudian diderivatisasi dengan PBA, selanjutnya 3-MCPD ditentukan dengan GC-MS. 3-MCPD-d5 digunakan sebagai baku internal.
Modifikasi dilakukan pada penggunaan larutan heksan sebagai pengekstraksi menggantikan isoheksan dan kondisi penggunaan GC-MS Varian 320-MS (lihat parameter penggunaan GC dan MS).
Penyiapan larutan baku
16
tertentu. Sampel didiamkan pada suhu ruang minimal dua jam kemudian dilakukan preparasi seperti prosedur penyiapan larutan sampel.
Penyiapan larutan sampel
Preparasi sampel untuk penetapan 3-MCPD ester dilakukan dengan menggunakan 100 mg sampel minyak goreng sawit yang dimasukkan ke dalam tabung kaca 10 mL bertutup ulir, ditambahkan 0.5 mL campuran MTBE dan etil asetat (8:2), baku internal dengan kadar 0.13 mg/L, dicampur dan dibiarkan pada suhu ruang sekurangnya 2 jam, kemudian ditambahkan 1 mL natrium metoksida (0.5 mol/L dalam metanol HPLC grade), divorteks selama 30 detik, kemudian didiamkan pada suhu ruang selama 10 menit, selanjutnya ditambahkan 3 mL heksan, 0.1 mL asam asetat glasial dan 3 mL natrium klorida (200 g/L), divorteks selama 30 detik. Setelah fase organik campuran tersebut dibuang, pada fase air ditambahkan 3 mL heksan dan kembali fase organik dibuang. Pada fase air ditambahkan 250L reagen penderivat (5 g PBA yang dilarutkan dalam 19 mL aseton dan 1 mL air), tabung ditutup dan panaskan pada suhu 80 oC dalam penangas air selama 20 menit. Setelah didinginkan pada suhu ruang, derivat siklik fenilboronat dari 3-MCPD diekstrak dengan 3 mL heksan (Weihaar et al. 2007). Fase organik dipisahkan dan dianalisis dengan GC-MS sesuai parameter penggunaan. Perlakuan yang sama juga dilakukan untuk penetapan 3-MCPD bebas, namun tanpa penambahan natrium metoksida saat preparasi.
Parameter penggunaan GC
Kondisi
penggunaan Metode Weihaar Metode Modifikasi
GC/MS GC-MS (Thermo Scientific) GC-MS 320-MS (Varians) yang dilengkapi autosampler
Gas pembawa Helium Helium
Aliran kolom 0.8 mL/menit 1.2 mL/menit Penyuntikan Splitless Rasio split 10 Volume
17
Parameter penggunaan MS
Kondisi penggunaan Metode Weihaar Metode Modifikasi
Mode aquisition Selected Ion Monitoring (SIM) Selected Ion Monitoring (SIM) Mode ionisasi Electron impact (EI) Electron impact (EI)
Suhu interface - 280 oC
Parameter validasi yang diuji meliputi linieritas dan rentang kerjanya, spesifisitas, presisi, akurasi, batas deteksi dan kuantifikasi. Identifikasi puncak ditentukan dengan melihat waktu retensi, spektrum dan kromatogram sampel spike dengan baku pembanding (Codex Stan 193-1995 2012; AOAC Official Method Apendix E 2005; AOAC 2002; Eurachem 1998). Kuantifikasi dilakukan menggunakan kurva baku eksternal dengan delapan konsentrasi dan baku internal dengan konsentrasi tetap yang ditambahkan kedalam sampel (sampel spike).
Penyiapan larutan baku
Larutan baku eksternal disiapkan dengan menimbang secara seksama sejumlah kurang lebih 50 mg 3-MCPD, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 mL dan dilarutkan dengan etil asetat sehingga diperoleh konsentrasi 0.5 mg/mL atau 500 ppm. Sebanyak 0.5 mL larutan baku induk tersebut dilarutkan dengan etil asetat dalam labu tentukur 20 mL sehingga didapatkan konsentrasi 12.5 mg/L. Larutan baku internal disiapkan dengan melarutkan 25 mg 3-MCPD-d5,
dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 mL dan dilarutkan dengan etil asetat sehingga diperoleh konsentrasi 0.5 mg/mL atau 500 ppm. Sebanyak 0.5 mL larutan stok tersebut dilarutkan dengan etil asetat dalam labu tentukur 20 mL sehingga didapatkan konsentrasi 12.5 mg/L, selanjutnya larutan baku antara digunakan untuk pembuatan larutan baku kerja. Larutan baku kerja dibuat dalam satu seri dengan konsentrasi tertentu, dengan cara menambahkan larutan baku antara pada volume yang telah ditetapkan ditambahkan kedalam 100 mg sampel minyak goreng sawit. Sampel didiamkan sekurangnya selama dua jam sebelum dilakukan preparasi dan pengujian seperti prosedur pada (3.3.1).
Parameter validasi
18
Spesifisitas
Spesifisitasadalah kemampuan metode untuk merespon secara khusus analit yang ditentukan tetapi tidak untuk komponen lain dari matriks, namun hanya sedikit metode yang benar-benar spesifik. Istilah ini lebih sering digunakan untuk menyatakan bahwa parameter spesifisitas menunjukan bahwa metode dapat digunakan untuk menentukan analit secara kuantitatif tanpa adanya gangguan, hal ini dapat dilihat pada kromatogram puncak analit yang terpisah.
Linieritas
Pada penentuan linieritas digunakan 8 baku eksternal dengan konsentrasi 0.01-0.34g/mL dan baku internal dengan konsentrasi 0.13 mg/L. Linieritas dievaluasi dengan memetakan area daerah puncak yang merupakan rasio dari area baku eksternal dan baku internal terhadap rasio konsentrasi baku eksternal dan baku internal dimana umumnya antara keduanya membentuk hubungan linier yang dinyatakan dengan persamaan regresi dan koefisien korelasi (r).
Persamaan regresi : y = bx + a
y = rasio luas area puncak = luas area puncak baku eksternal (3- MCPD)/luas area puncak baku internal (3-MCPD-d5)
x = rasio konsentrasi = konsentrasi baku eksternal (3-MCPD) /konsentrasi baku internal (3-MCPD-d5)
Akurasi
Akurasi merupakan kedekatan antara nilai terukur dan nilai diterima, nilai benar atau nilai referensi, ditentukan secara rekoveri dengan penambahan baku eksternal pada atau disekitar konsentrasi target, uji dilakukan pada satu konsentrasi dengan tujuh ulangan. Nilai rekoveri ditentukan dengan menggunakan persamaan berikut:
Tabel 3.1 Batas rekoveri rata-rata pada matrik sampel
19
Akurasi dapat diterima jika nilai rekoveri memenuhi batasan yang tercantum seperti pada Tabel 3.1.
Presisi
Presisi merupakan fungsi dari konsentrasi yang menyatakan kedekatan diantara serangkaian pengukuran beberapa sampel homogen. Presisi dilakukan oleh satu orang analis pada waktu tertentu terhadap beberapa sampel yang sama. Presisi diukur terhadap 7 sampel homogen dengan konsentrasi sama atau 7 kali ulangan yang masing-masing diukur 2 kali. Presisi metode analisis dinyatakan sebagai simpangan baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (KV).
Standar deviasi (SD) ke 7 sampel tersebut dihitung untuk mendapatkan nila RSD dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
x = kadar tiap ulangan x = rata-rata kadar sampel n = jumlah ulangan
Nilai simpangan baku relatif atau koefisien variasi akan meningkat dengan menurunnya konsentrasi analit. Horwitz telah melakukan kajian terhadap 3000 hasil analisis yang diambil dari studi kolaboratif AOAC dan memberikan hasil sebagai berikut :
KV = ±2 (1-0,5 log C)
C = konsentrasi yang dinyatakan sebagai fraksi desimal
(misalnya untuk kadar C = 100%, maka fraksi desimalnya = 100/100 = 1)
Hubungan koefisien variasi dan konsentrasi digambarkan sebagai kurva berupa terompet yang dinamakan kurva terompet Horwitz (Gambar 3.1 dan Tabel 3.2).
Nilai koefesian variasi dari percobaan dibandingkan terhadap koefesian variasi yang dihitung dari persamaan terompet Horwitz. Nilai perbandingan tersebut merupakan rasio Horwitz yang disebut HorRat, dengan persamaan sebagai berikut :
HorRat = KVpercobaan/KVperkiraan
20
Sumber : Rivera et al. (2012)
Gambar 3.1 Kurva terompet Horwitz
Tabel 3.2 Nilai koefesien variasi Horwitz pada beberapa konsentrasi analit
Konsentrasi analit Koefesian variasi
10% 2.8%
1% 4.0%
0.1% 5.7%
0.01% 8.0%
1 ppm 16%
1 ppb 45%
0.1 ppb 64%
Sumber: Rivera et al. (2012)
Presisi dapat dinyatakan memenuhi persyaratan jika memenuhi nilai koefesien variasi lebih kecil dari nilai 2/3 koefisien Horwizt atau jika nilai HorRat 0.5-2.
Batas deteksi
Batas deteksi (limit of detection, LoD) adalah kuantitas terkecil dari analit yang memberikan tinggi puncak (sinyal) 3 kali noise. Pengujian dilakukan pada sampel spike dengan konsentrasi minimum yang masih dapat dideteksi dengan 10 ulangan. Nilai LoD ditentukan dengan persamaan sebagai berikut:
21
Batas kuantitasi
Batas kuantitasi (limit of quantitation, LoQ) adalah kuantitas terkecil dari analit yang dapat ditentukan secara kuantitatif dengan presisi dan akurasi yang memenuhi syarat, umumnya memberikan tinggi puncak (sinyal) 10 kali noise. Pengujian dilakukan pada sampel spike dengan konsentrasi minimum yang masih dapat diukur dengan 10 ulangan. Nilai LoQ ditentukan dengan persamaan sebagai berikut:
LoQ = (10 x konsentrasi analit) / (sinyal/noise)
3.2.3 Analisis 3-MCPD dalam Minyak Goreng Sawit Komersial
Analisis 3-MCPD total, 3-MCPD dan 3-MCPD ester atau kadar setelah dilakukan hidrolisis dilakukan dengan menggunakan metode analisis yang telah divalidasi. Pada tahap ini preparasi sampel minyak goreng sawit yang akan dianalisis mengikuti tahapan preparasi seperti pada validasi metode analisis (3.2.1). 3-MCPD ester dihitung sebagai selisih antara kadar 3-MCPD total dengan 3-MCPD. Analisis dilakukan sebanyak 6 ulangan.
Sampel minyak goreng sawit komersial yang didapatkan dari pasar tradisional di daerah Jakarta Pusat dan Depok dianalisis sesuai dengan prosedur metode analisis tervalidasi. Jumlah sampel yang digunakan untuk analisis ini adalah sebanyak 11 sampel yang dilakukan sebanyak 2 ulangan.
Analisis asam lemak bebas
Sebanyak 10 g sampel minyak goreng sawit ditambahkan 50 ml alkohol 95% ke dalam erlenmeyer 150 ml. Erlenmeyer ditempatkan pada penangas air pada suhu 60-65 C selama 10 menit. Setelah itu erlenmeyer yang berisi contoh ditambahkan 3 tetes indikator fenolftalein 1 % lalu dititrasi dengan NaOH 0.1N sampai terlihat warna merah muda permanen (tidak hilang dalam 15 detik). Kemudian dihitung kadar asam lemak bebas dengan mengalikan volume NaOH yang terpakai dengan 0.05, hasilnya dilaporkan sebagai persen asam lemak bebas dari asam oleat (AOAC official method 940.28 2005).
Profil digliserida dan trigliserida
22
N2/menit, kecepatan aliran udara 450 ml/menit dan volume injeksi 1 l.
Perhitungan kadar dilakukan dengan terlebih dahulu menentukan faktor respon, kromatogram larutan baku eksternal dibandingkan dengan kromatogram baku internal. Kadar ditentukan dengan menggunakan rumus dibawah (AOCS Official Method Cd 11b-91 2003).
Rx = (mbi/mx) x (Ax/Abi)
Rx = faktor respon dari baku x
mbi = mg baku internal
mx = mg baku
Ax = area puncak baku
Abi = area puncak baku internal.
m’x = (1/Rx) x (m’bi/m’s) x (A’x/A’bi)
m’x = mg % komponen x dalam sampel
Rx = faktor respon dari komponen x dalam sampel
m’bi = mg baku internal dalam sampel
m’s = mg sampel
A’x = area puncak dari komponen dalam sampel
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Penetapan Modifikasi Metode Analisis
Prinsip dasar dari penetapan 3-MCPD ester adalah mengubah 3-MCPD ester menjadi 3-MCPD dengan tahapan sebagai berikut: baku internal ditambahkan kedalam sampel, kemudian dilakukan transesterifikasi dengan natrium metoksida dalam metanol (metanolisis), diikuti dengan netralisasi dan salting out, derivatisasi dengan PBA (Tabel 4.1) yang selanjutnya dianalisis dengan GC-MS.
Isoheksan digunakan sebagai lautan pengekstrasi dan heksan digunakan sebagai pelarut analit yang akan diuji (larutan uji) pada metode Weihaar. Metode modifikasi menggunakan heksan sebagai larutan pengekstraksi dan larutan uji dengan pertimbangan; 1) Secara umum tidak terdapat perbedaan yang mencolok antara isoheksan dan heksan (Tabel 4.2); 2) Heksan lebih umum digunakan sebagai larutan pengekstraksi pada industri minyak nabati; 3) Lebih ekonomis. Selain itu hal yang lebih utama adalah metode analisis ini dipilih berdasarkan kemudahan penerapannya di laboratorium.
Tabel 4.1 Tahapan pengujian dan hasilnya
Tahapan analisis Hasil
Sampel minyak goreng sawit ditambah baku internal (3-MCPD-d5)
Baku internal bebas menjadi terikat dengan ester asam lemak, seperti dipalmitoil-3-MCPD-d5.
Transesterifikasi atau metanolisis
Perubahan bentuk baku internal dan analit
Dipalmitoil-3-MCPD-d5 dibebaskan menjadi 3-MCPD-d5 dan dipalmitoil-3-MCPD menjadi 3-dipalmitoil-3-MCPD.
Triasilgliserol dan asilgliserol lainnta diubah menjadi FAME dan gliserol, selanjutnya 3-MCPD ester diubah menjadi 3-MCPD.
Netralisasi dan salting out Menghentikan reaksi pembentukan 3-MCPD
Derivatisasi 3-MCPD menggunakan PBA
24
Tabel 4.2 Karakteristik isoheksan dan heksan
Karakteristik Isoheksan Heksan
Struktur
Rumus molekul C6H14 C6H14
Berat massa 86.1754 86.1754
Nama sistematik 2-methylpentane Hexane
Titik didih 60.3 °C 68.7°C
Titik leleh -153.7 °C -95.3 °C
Kelarutan 0.02 g/l (20 °C) 0.0095 g/l (20 °C)
Data toksikologi LD50 rat > 2000 mg/kg (oral) LD50 rat 25000 mg/kg (oral) LD50 rabbit > 2000 mg/kg
Tahapan validasi metode diawali dengan uji pendahuluan. Tahapan uji pendahuluan meliputi penetapan larutan pengekstrasi, kondisi GC-MS, waktu retensi 3-MCPD dan 3-MCPD-d5 dan ion m/z yang digunakan untuk analisis
kuantitatif serta dilakukan uji kesesuaian sistem, sedangkan validasi metode parameternya adalah uji spesifisitas, linieritas, akurasi, presisi, batas deteksi (LoD) dan batas kuantitasi (LoQ).
Baku internal adalah baku yang ditambahkan ke dalam matrik sampel dengan jumlah tertentu yang biasanya tetap. Baku internal yang digunakan adalah senyawa yang mudah dibedakan dari analit namun memiliki sifat kimia sama. Metode analisis ini menggunakan isotop MCPD sebagai baku internal yaitu 3-MCPD-d5. Penggunaan isotop diharapkan tidak mempengaruhi matrik sampel dan
proses preparasi sehingga analit yang akan diuji memiliki sifat dan karakter yang sama dengan dengan analit pada sampel.
Penentuan nilai m/z ditentukan dengan detektor spektrum massa menggunakan ion m/z 91,147, 196 untuk 3-MCPD dan ion m/z 93, 150, 201 untuk 3-MCPD-d5 (Svejkovska et al. 2006; Zelinkova et al. 2006; Wehaar
2008). Kromatogram yang dihasilkan diidentifikasi dengan memperhatikan respon spektrum, luas area dan gangguan pada puncak kromatogram. Intensitas spektrum terbesar adalah ion m/z 147 3-MCPD dan ion m/z 150 untuk 3-MCPD-d5, hal ini
25
Gambar 4.1 Spektrum massa hasil derivatisasi PBA untuk 3-MCPD-d5 dan
26
Gambar 4.2 Kromatogram TIC derivatisasi 3-MCPD-d5 dan 3-MCPD (A),
3-MCPD-d5 m/z 201 (B), 3-MCPD-d5 m/z 150 (C), 3-MCPD m/z
196 (D), 3-MCPD m/z 147 (E)
Kromatogram TIC (total ion chromatograms) dengan menggunakan mode deteksi scan menghasilkan luas puncak gabungan seluruh spektrum massa yang sebanding dengan konsentrasi analit terukur, namun kromatogram baku internal dan eksternal tidak terpisah sempurna, untuk mengatasinya maka digunakan mode ion selektif (SIM) yang dapat memisahkan puncak kromatogram analit (Gambar 4.2). Selain itu SIM waktu siklusnya lebih pendek dari pada mode deteksi scan, maka analisis kuantitatif lebih optimal dan lebih baik akurasi dan presisinya (HP 1998).
27
pada ion m/z 91 puncak matriks lebih dominan, pada m/z 196 walaupun puncak matrik tidak tampak namun pada puncak analit terlihat ada gangguan pada kedua sisinya sehingga bagian bawah puncak terlihat lebih lebar dan luas area puncaknya lebih kecil dibandingkan kedua ion yang lain. Berdasarkan spektrum dan kromatogram yang dihasilkan maka ion kuantitaf untuk 3-MCPD yang dipilih adalah ion m/z 147 karena memiliki interferensi paling kecil dan luas area puncaknya besar, sementara pemilihan ion kuantitatif 3-MCPD-d5 ditentukan
hanya berdasarkan besaran luas area puncak, sedangkan gangguan terhadap puncak diabaikan karena pada ketiga kromatogram tidak terlihat adanya gangguan. Ion hasil derivatisasi yang terbentuk untuk masing-masing nilai m/z seperti terlihat pada Tabel 4.3.
28
Tabel 4.3 Karakteristik ion (m/z) pada spektrum massa MCPD dan 3-MCPD-d5 terderivatisasi
Uji spesifisitas dilakukan untuk mengetahui bahwa metode analisis dapat menentukan dan mengukur konsentrasi analit dengan adanya komponen-komponen lain dalam sampel. Tahapan preparasi sangat mempengaruhi hasil pengujian, isolasi yang efektif akan menghasilkan analit yang terpisah dari matriksnya. Kromatogram memperlihatkan puncak analit yang terpisah dari puncak-puncak lain sehingga memudahkan identifikasi dan pengukuran, bahkan pada sampel yang mengandung analit dengan kadar rendah (Gambar 4.5).
Linieritas dan rentang kerja pengujian
Linieritas suatu metode analisis dapat menunjukkan hubungan yang proporsional antara respon dan konsentrasi analit pada rentang kerja yang ditunjukkan dengan nilai koefesien korelasi (r) lebih besar dari 0.99 (AOAC 2002). Linieritas dievaluasi dengan memetakan area daerah puncak yang merupakan rasio dari area baku eksternal dan baku internal terhadap rasio konsentrasi baku eksternal dan baku internal dimana umumnya antara keduanya membentuk hubungan linier. Penetapan rentang kerja perlu dilakukan untuk setiap metode kuantitatif, sehingga metode terpilih dapat diterapkan. Hal ini merujuk pada konsentrasi sebenarnya yang diukur dalam larutan uji dan bukan dalam sampel sebenarnya. Dalam rentang kerja yaang telah ditentukan, kemungkinan menghasilkan respon yang memiliki hubungan linear dengan kadar analit (Eurachem 1998).
Delapan konsentrasi baku eksternal yang digunakan 0.008-0.377mg/L dan konsentrasi tetap baku internal sebesar 0.13 mg/Lmembentuk persamaan regresi y = 0.076x + 0.005 dengan koefisien korelasi (r) 0.994 (Gambar 4.4).
Presisi dan akurasi hasil uji
29
Uji presisi dan akurasi dilakukan pada sampel blanko yang ditambahkan baku eksternal dan internal dengan konsentrasi yang sama yaitu 0.13 mg/L dalam 100 mg sampel dengan tujuh ulangan, seperti pada Tabel 4.4.
Gambar 4.4. Kurva linieritas 3-MCPD dalam blanko sampel minyak goreng sawit
Gambar 4.5 Kromatogram 3-MCPD pada ion m/z 147
Batas deteksi dan batas kuantitasi analit dalam sampel
30
Tabel 4.4 Nilai LoD dan LoQ dari beberapa jenis bahan pangan
Batas deteksi (LoD) dan kuantitasi (LoQ) pada penelitian ini adalah 0.06 mg/kg dan 0.20 mg/kg sampel minyak goreng sawit, jika dibandingkan dengan beberapa penelitian sebelumnya seperti pada tabel (Tabel 4.4) validasi metode ini menunjukkan hasil yang lebih sensitif.
Hasil validasi yang dipaparkan telah melalui tahapan identifikasi data yaitu kompenen yang digunakan pada analisis memiliki kejelasan sumber, identitas, dan kemurniaan baku. Kinerja validasi ditunjukkan pada pengulangan, rekoveri dan batas pengukuran. Data tersebut memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan untuk masing-masing parameter validasi.
Tabel 4.5 Hasil uji presisi, rekoveri, batas deteksi dan batas kuantitasi
Rerata SD KV (%)
0.06 mg/kg 0.20 mg/kg Hasil validasi penelitian Minyak goreng sawit
(3-MCPD)
0.25 mg/kg 0.5 mg/kg Razak et al. 2012
Safflower (3-MCPD) 50-150 µg/kg Weiβhaar 2008
31
4.3 Analisis 3-MCPD dan Esternya dalam Minyak Goreng Sawit
Metode analisis tervalidasi digunakan untuk menetapkan kadar 3-MCPD total dan 3-MCPD dalam minyak goreng sawit komersial yang diperoleh dari pasar tradisional, hasilnya tercantum pada Tabel 4.6.
Tabel 4.6 Kadar 3-MCPD total dan 3-MCPD dalam minyak goreng sawit
Kode sampel 3-MCPD total (mg/kg) 3-MCPD (mg/kg)
S1 15.77 3.54
Kadar MCPD ester ditentukan berdasarkan selisih MCPD total dan 3-MCPD bebas, yaitu sebesar 13.24 mg/kg pada minyak goreng sawit. Hasil yang berada pada rentang kadar 3-MCPD ester sampel minyak goreng sawit pada uji profisensi EU-JRC dengan kisaran hasil 0.6-18.8 mg/kg dan laboratorium yang memenuhi nilai z score sebanyak 56% (Karasek et al. 2010). Larsen (2009) melaporkan bahwa minyak goreng sawit mengandung 3-MCPD ester dengan kadar 4.5-13 mg/kg.
Keberadaan senyawa 3-MCPD dan esternya dalam pangan dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya suhu, pH, kadar air, gula dan lemak, cara pengolahan dan kondisi penyimpanan (Baer et al. 2010). Pada minyak goreng sawit 3-MCPD dan esternya dapat terbentuk pada saat pengolahan saat degumming dan bleaching, adapun penggunaan klorida selalu dimonitoring selama proses pengolahan.
32
Tabel 4.7 Kadar 3-MCPD total, DAG, TAG dan ALB dalam minyak goreng sawit komersial
No Sampel 3-MCPD
total (mg/kg) DAG (%) TAG (%) ALB (%)
1 23.60 5.21 94.80 0.19 2 14.79 5.17 94.83 0.17 3 25.50 5.59 94.34 0.15 4 34.52 7.87 92.13 0.11 5 26.79 5.90 94.10 0.13 6 33.36 5.56 94.44 0.13 7 27.10 6.31 93.69 0.13 8 31.62 6.27 93.72 0.23 9 16.66 5.63 94.37 0.18 10 33.92 6.26 93.74 0.11 11 13.94 3.62 96.38 0.11 Rerata 25.62 5.76 94.23 0.15 SD 7.65 1.03 1.029 0.04
Minyak goreng sawit merupakan salah satu komponen penting dalam proses pengolahan pangan, terutama penggorengan, yang berfungsi sebagai penghantar panas. Selama penggorengan, minyak dipanaskan pada waktu yang lama dengan suhu tinggi dan berada pada kondisi terdapat udara dan air. Situasi dan kondisi ini bisa menjadi pencetus terjadinya reaksi kimia dalam minyak goreng sawit.
Sebelas sampel minyak goreng sawit yang telah diketahui 3-MCPD total juga ditentukan kadar diasilgliserida (DAG), triasilgliserida (TAG) dan kandungan asam lemak bebasnya (ALB). Penentuan ini dilakukan untuk melihat korelasinya dengan kandungan 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit seperti terlihat pada Gambar 4.6.
33
5 SIMPULAN DAN SARAN
5.1 Simpulan
Modifikasi metode Weihaar yang dilakukan pada penelitian ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi kadar 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit.
Hasil validasi metode analisis 3-MCPD dalam minyak goreng sawit telah memenuhi kriteria akurasi, presisi, linieritas, dan spesifisitas yang ditunjukkan oleh persamaan linear (r) 0.994, rentang kerja 0.008 sampai 0.377 mg/L, batas deteksi 0.06 mg/kg, batas kuantitasi 0.20 mg/kg, presisi (koevesien variasi (KV)) 6.16%, dan akurasi (persen rekoveri) 95.83-113.27%, dalam 100 mg sampel minyak goreng sawit.
Metode analisis tervalidasi dapat diaplikasikan untuk menentukan kadar 3-MCPD dan esternya pada minyak goreng sawit komersial. Sampel minyak goreng sawit yang dianalisis pada penelitian ini diperoleh kadar 3-MCPD total sebesar 16.96 mg/kg, 3-MCPD sebesar 3.72 mg/kg, sedangkan 3-MCPD ester bisa dihitung berdasarkan selisih antara kadar 3-MCPD total dan 3-MCPD sebesar 13.24 mg/kg. Sebelas sampel yang diuji berdasarkan metode analisis tervalidasi didapatkan jumlah 3-MCPD total yang diperoleh berkisar antara 13.94-34.52 mg/kg.
Hasil analisis memperlihatkan adanya korelasi antara konsentrasi 3-MCPD dalam sampel dengan kandungan diasilgliserida. Sampel dengan kandungan diasilgliserida tinggi akan memberikan hasil pengujian yang tinggi pula terhadap 3-MCPD, hubungan ini dinyatakan dengan koefesien korelasi sebesar (r) 0.752.
5.2 Saran
DAFTAR PUSTAKA
[AOAC] Assosiation of Official Agricultural Chemists, Official Method. 2005a. AOAC official method 940.28: Fatty acid (free) in crude and refined oils. Official methods of analysis of AOAC International. 18th edition. Chapter 41, p. 12-13.
[AOAC] Assosiation of Official Agricultural Chemists, Official Method. 2005c. Laboratory Quality Assurance. Official methods of analysis of AOAC International. 18th edition. Appendix E: 1-6. Gaithersburg, Maryland 20877-2417, USA.
[AOAC] Assosiation of Official Agricultural Chemists. 2002. Guidelines for single laboratory validation of chemical method for dietary supplements and botanical [internet]. [diunduh 2013 Mar 09]. Tersedia pada: http://www.aoac.org/Official_Methods/slv_guidelines.pdf.
[AOCS] American Oil Chemist’s Society, Official Method. 2003. AOCS official method Cd 11b-91: Determination of mono-and diglycerides by capillary gas chromatofraphy. Sampling and Analysis of Commercial Fats and Oils, p. 1-5.
BPOM] Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2009. Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia Nomor HK.00.06.1.52.4011 tentang Penetapan Batas Maksimum Cemaran Mikroba dan Kimia dalam Makanan. Jakarta (ID): BPOM.
[Depdiknas] Departemen Pendidikan Nasional. 2005. Kamus Besar Bahasa Indonesia. Edisi ketiga. Balai Pustaka. Jakarta (ID): Depdiknas.
[WHO] World Health Organization. 2013. WHO Food additives series; 48. Safety evaluation of certain food additives and contaminants, 3-chloro-1,2-propanediol [internet]. [diunduh 2013 Juni]. Tersedia pada: http://www.inchem.org/documents/jecfa/jecmono/ v48je18.htm.
[ICH] International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. 2005. Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(1) [internet]. [diunduh Maret 23 2011]. Tersedia pada: http://www.ich.org/fileadmin/ Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1_ _Guideline.pdf.
Abu-El-Haj S, Bogusz MJ, Ibrahim Z, Hassan H, Al Tufail M. 2007. Rapid and simple determination of chloropropanols (3-MCPD and 1,3-DCP) in food products using isotope dilution GC–MS. Food Control. 18: 81–90.
Cameochemicals. Isohexane [internet]. [diunduh 2012 Des 02]. Tersedia dari: http://cameochemicals.noaa.gov/chris/IHA.pdf.
36
Codex Stan 193-1995. 2010. Codex general standard for contaminants and toxins in food and feed. Codex standard 193-1995 [internet]. [diunduh 2013 Mar 09]. Tersedia pada: http://www.codexalimentarius.net/input/download/ standards/17/CXS_193e.pdf.
Crews C. 2012. Fatty acid esters of chloropropanols and glycidol in food-analysis and exposure [internet]. [diunduh 2012 Des 02]. Tersedia pada: http://www.foodprotection.org/downloads/meetings/program-activities/ programs/colin-crews-fatty-acid-esters-of-chloropopanols-and-glycidol-in-foods-analysis-and-exposure.pdf.
Divinova V, Svejkovska B, Dolezal M, Velisek J. 2004. Determination of free and bound 3-chloropropane-1,2-diol by gas chromatofraphy with mass spectrometric detection using deuterated 3-chloropropane-1,2-diol as internal standard. Czech J. Food Sci. 22: 182-189.
El Ramy, Ould Elhkim RM, Lezmi S, Poul JM. 2007. Evaluation of the genotoxic potential of 3-monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD) and its metabolites, glycidol and b-chlorolactic acid, using the single cell gel/comet assay. Food Chem. Toxicology. 45: 41–48.
Eurachem. 1998. The fitness for purpose of analytical methods. A laboratory quide to method validation and related topics. Eurachem Guide. Middlesex, UK.
Farombi EO, Britton G. 1999. Antioxidant activity of palm oil carotenes in organic solution: effects of structure and chemical reactivity. Food Chem. 64: 315-321.
Floros JD, Gnanasekharan V. 1993. Shelf life prediction of packaged foods: chemichal, biological, physical, and nutritional aspects. G. Chlaralambous (Ed.). Elsevier Publ., London.
Franke K, Strijowski U, Fleck G, Pudel F. 2009. Influence of chemical refining process and oil type on bound 3-chloro-1,2-propanediol contents in palm oil and rapeseed oil. Food Sci. Technol. 42:1751–1754.
Greyt. 2010. Development in edible oil refining for the production of high quality food oils [internet]. [diunduh 2012 Des 02]. Tersedia pada: http://www.aocs.org/files/ResourcesPDF/refining_desmet_ballestra.pdf.
Greyt. 2012. Review on 3-MCPD and glycidyl esters in vegetable oils and fats [internet]. [diacu 2012 Des 02]. Tersedia dari: http://aocs.files.cms-plus.com/ResourcesPDF/MCPD-GE-mitigation-AOCS-2012(DGW)-final. pdf.
Haines TD, Adlaf KD, Pierceall RM, Lee I, Venkitasubramanian P, Collison MW. 2011. Direct determination of MCPD fatty acid esters and glycidyl fatty acid esters in vegetable oils by LC-TOFMS. J Am Oil Chem Soc. 88(1): 1-14.
