Validasi Metode Analisis - 2 TINJAUAN PUSTAKA

2 TINJAUAN PUSTAKA

3.2.2 Validasi Metode Analisis

Parameter validasi yang diuji meliputi linieritas dan rentang kerjanya, spesifisitas, presisi, akurasi, batas deteksi dan kuantifikasi. Identifikasi puncak ditentukan dengan melihat waktu retensi, spektrum dan kromatogram sampel spike dengan baku pembanding (Codex Stan 193-1995 2012; AOAC Official Method Apendix E 2005; AOAC 2002; Eurachem 1998). Kuantifikasi dilakukan menggunakan kurva baku eksternal dengan delapan konsentrasi dan baku internal dengan konsentrasi tetap yang ditambahkan kedalam sampel (sampel spike).

Penyiapan larutan baku

Larutan baku eksternal disiapkan dengan menimbang secara seksama sejumlah kurang lebih 50 mg 3-MCPD, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 mL dan dilarutkan dengan etil asetat sehingga diperoleh konsentrasi 0.5 mg/mL atau 500 ppm. Sebanyak 0.5 mL larutan baku induk tersebut dilarutkan dengan etil asetat dalam labu tentukur 20 mL sehingga didapatkan konsentrasi 12.5 mg/L. Larutan baku internal disiapkan dengan melarutkan 25 mg 3-MCPD-d5,

dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 mL dan dilarutkan dengan etil asetat sehingga diperoleh konsentrasi 0.5 mg/mL atau 500 ppm. Sebanyak 0.5 mL larutan stok tersebut dilarutkan dengan etil asetat dalam labu tentukur 20 mL sehingga didapatkan konsentrasi 12.5 mg/L, selanjutnya larutan baku antara digunakan untuk pembuatan larutan baku kerja. Larutan baku kerja dibuat dalam satu seri dengan konsentrasi tertentu, dengan cara menambahkan larutan baku antara pada volume yang telah ditetapkan ditambahkan kedalam 100 mg sampel minyak goreng sawit. Sampel didiamkan sekurangnya selama dua jam sebelum dilakukan preparasi dan pengujian seperti prosedur pada (3.3.1).

Parameter validasi

Parameter validasi tergantung pada aplikasi, uji sampel, tujuan dari metode, dan pedoman dalam negeri, internasional atau peraturan yang berlaku. Untuk metode analisis ini parameter validasi yang ditetapkan adalah linieritas, presisi, akurasi, spesifisitas, batas deteksi, dan batas kuantitasi (Codex Stan 193-1995 2012; AOAC Official Method Apendix E 2005; AOAC 2002; Eurachem 1998).

 Spesifisitas

Spesifisitasadalah kemampuan metode untuk merespon secara khusus analit yang ditentukan tetapi tidak untuk komponen lain dari matriks, namun hanya sedikit metode yang benar-benar spesifik. Istilah ini lebih sering digunakan untuk menyatakan bahwa parameter spesifisitas menunjukan bahwa metode dapat digunakan untuk menentukan analit secara kuantitatif tanpa adanya gangguan, hal ini dapat dilihat pada kromatogram puncak analit yang terpisah.

 Linieritas

Pada penentuan linieritas digunakan 8 baku eksternal dengan konsentrasi 0.01-0.34g/mL dan baku internal dengan konsentrasi 0.13 mg/L. Linieritas dievaluasi dengan memetakan area daerah puncak yang merupakan rasio dari area baku eksternal dan baku internal terhadap rasio konsentrasi baku eksternal dan baku internal dimana umumnya antara keduanya membentuk hubungan linier yang dinyatakan dengan persamaan regresi dan koefisien korelasi (r).

Persamaan regresi : y = bx + a

y = rasio luas area puncak = luas area puncak baku eksternal (3- MCPD)/luas area puncak baku internal (3-MCPD-d5)

x = rasio konsentrasi = konsentrasi baku eksternal (3-MCPD) /konsentrasi baku internal (3-MCPD-d5)

 Akurasi

Akurasi merupakan kedekatan antara nilai terukur dan nilai diterima, nilai benar atau nilai referensi, ditentukan secara rekoveri dengan penambahan baku eksternal pada atau disekitar konsentrasi target, uji dilakukan pada satu konsentrasi dengan tujuh ulangan. Nilai rekoveri ditentukan dengan menggunakan persamaan berikut:

Tabel 3.1 Batas rekoveri rata-rata pada matrik sampel Konsentrasi Batas Rekoveri

100% 98-101% 10% 95-102% 1% 92-105% 0.1% 90-108% 0.01% 85-110% 10 g/g (ppm) 80-115% 0.1 g/g (ppm) 75-120% 10 g/kg (ppb) 70-125% Sumber: AOAC (2002)

Akurasi dapat diterima jika nilai rekoveri memenuhi batasan yang tercantum seperti pada Tabel 3.1.

 Presisi

Presisi merupakan fungsi dari konsentrasi yang menyatakan kedekatan diantara serangkaian pengukuran beberapa sampel homogen. Presisi dilakukan oleh satu orang analis pada waktu tertentu terhadap beberapa sampel yang sama. Presisi diukur terhadap 7 sampel homogen dengan konsentrasi sama atau 7 kali ulangan yang masing-masing diukur 2 kali. Presisi metode analisis dinyatakan sebagai simpangan baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (KV).

Standar deviasi (SD) ke 7 sampel tersebut dihitung untuk mendapatkan nila RSD dengan menggunakan rumus sebagai berikut:

x = kadar tiap ulangan x = rata-rata kadar sampel n = jumlah ulangan

Nilai simpangan baku relatif atau koefisien variasi akan meningkat dengan menurunnya konsentrasi analit. Horwitz telah melakukan kajian terhadap 3000 hasil analisis yang diambil dari studi kolaboratif AOAC dan memberikan hasil sebagai berikut :

KV = ±2 (1-0,5 log C)

C = konsentrasi yang dinyatakan sebagai fraksi desimal

(misalnya untuk kadar C = 100%, maka fraksi desimalnya = 100/100 = 1) Hubungan koefisien variasi dan konsentrasi digambarkan sebagai kurva berupa terompet yang dinamakan kurva terompet Horwitz (Gambar 3.1 dan Tabel 3.2).

Nilai koefesian variasi dari percobaan dibandingkan terhadap koefesian variasi yang dihitung dari persamaan terompet Horwitz. Nilai perbandingan tersebut merupakan rasio Horwitz yang disebut HorRat, dengan persamaan sebagai berikut :

HorRat = KVpercobaan/KVperkiraan

Sumber : Rivera et al. (2012)

Gambar 3.1 Kurva terompet Horwitz

Tabel 3.2 Nilai koefesien variasi Horwitz pada beberapa konsentrasi analit Konsentrasi analit Koefesian variasi

10% 2.8% 1% 4.0% 0.1% 5.7% 0.01% 8.0% 1 ppm 16% 1 ppb 45% 0.1 ppb 64% Sumber: Rivera et al. (2012)

Presisi dapat dinyatakan memenuhi persyaratan jika memenuhi nilai koefesien variasi lebih kecil dari nilai 2/3 koefisien Horwizt atau jika nilai HorRat 0.5-2.

 Batas deteksi

Batas deteksi (limit of detection, LoD) adalah kuantitas terkecil dari analit yang memberikan tinggi puncak (sinyal) 3 kali noise. Pengujian dilakukan pada sampel spike dengan konsentrasi minimum yang masih dapat dideteksi dengan 10 ulangan. Nilai LoD ditentukan dengan persamaan sebagai berikut:

21  Batas kuantitasi

Batas kuantitasi (limit of quantitation, LoQ) adalah kuantitas terkecil dari analit yang dapat ditentukan secara kuantitatif dengan presisi dan akurasi yang memenuhi syarat, umumnya memberikan tinggi puncak (sinyal) 10 kali noise. Pengujian dilakukan pada sampel spike dengan konsentrasi minimum yang masih dapat diukur dengan 10 ulangan. Nilai LoQ ditentukan dengan persamaan sebagai berikut:

LoQ = (10 x konsentrasi analit) / (sinyal/noise)

3.2.3 Analisis 3-MCPD dalam Minyak Goreng Sawit Komersial

Analisis 3-MCPD total, 3-MCPD dan 3-MCPD ester atau kadar setelah dilakukan hidrolisis dilakukan dengan menggunakan metode analisis yang telah divalidasi. Pada tahap ini preparasi sampel minyak goreng sawit yang akan dianalisis mengikuti tahapan preparasi seperti pada validasi metode analisis (3.2.1). 3-MCPD ester dihitung sebagai selisih antara kadar 3-MCPD total dengan 3-MCPD. Analisis dilakukan sebanyak 6 ulangan.

Sampel minyak goreng sawit komersial yang didapatkan dari pasar tradisional di daerah Jakarta Pusat dan Depok dianalisis sesuai dengan prosedur metode analisis tervalidasi. Jumlah sampel yang digunakan untuk analisis ini adalah sebanyak 11 sampel yang dilakukan sebanyak 2 ulangan.

Analisis asam lemak bebas

Sebanyak 10 g sampel minyak goreng sawit ditambahkan 50 ml alkohol 95% ke dalam erlenmeyer 150 ml. Erlenmeyer ditempatkan pada penangas air pada suhu 60-65 C selama 10 menit. Setelah itu erlenmeyer yang berisi contoh ditambahkan 3 tetes indikator fenolftalein 1 % lalu dititrasi dengan NaOH 0.1N sampai terlihat warna merah muda permanen (tidak hilang dalam 15 detik). Kemudian dihitung kadar asam lemak bebas dengan mengalikan volume NaOH yang terpakai dengan 0.05, hasilnya dilaporkan sebagai persen asam lemak bebas dari asam oleat (AOAC official method 940.28 2005).

Profil digliserida dan trigliserida

Sampel minyak goreng sawit ditimbang teliti kurang lebih sebanyak 50 mg dan dimasukkan dalam vial kemudian ditambahkan 0.2 ml BSTFA (bis (trimethylsilil) trifluoro acetamide) dan 0.1 ml TMCS (Trimethylchlorosilane) dan 0.1 ml larutan baku internal n-tetradecana kemudian dikocok secara hati-hati dan dipanaskan pada suhu 70 oC selama 20 menit, setelah itu segera diinjeksikan ke GC-MS sebanyak 1 l. Dilakukan juga seperti diatas untuk larutan baku eksternalnya, puncak yang muncul diidentifikasi dengan membandingkan waktu retensi dari baku eksternal. Kromatografi gas yang digunakan dilengkapi dengan split injeksi dan FID dengan kondisi sebagai berikut; suhu kolom awal 50 oC dinaikkan menjadi 180 oC dengan kenaikan 15 oC/menit, kemudian dinaikkan lagi menjadi 230 oC dengan kenaikan 7 oC/menit dan dinaikkan lagi menjadi 380 oC, suhu detektor 390 oC, suhu injektor 390 oC, kecepatan gas pembawa 0.7 ml

N2/menit, kecepatan aliran udara 450 ml/menit dan volume injeksi 1 l.

Perhitungan kadar dilakukan dengan terlebih dahulu menentukan faktor respon, kromatogram larutan baku eksternal dibandingkan dengan kromatogram baku internal. Kadar ditentukan dengan menggunakan rumus dibawah (AOCS Official Method Cd 11b-91 2003).

Rx = (mbi/mx) x (Ax/Abi)

Rx = faktor respon dari baku x

mbi = mg baku internal

mx = mg baku

Ax = area puncak baku

Abi = area puncak baku internal.

m’x = (1/Rx) x (m’bi/m’s) x (A’x/A’bi)

m’x = mg % komponen x dalam sampel

Rx = faktor respon dari komponen x dalam sampel

m’bi = mg baku internal dalam sampel

m’s = mg sampel

A’x = area puncak dari komponen dalam sampel

Dalam dokumen Validation of The Modified Weihaar’s Method for the Determination of 3 Monochloropropane 1,2 Diol (3 MCPD) and Its Ester in Palm oil (Halaman 35-41)