INHIBITOR α
-GLUKOSIDASE DARI GABUNGAN EKSTRAK
BUAH MAHKOTA DEWA (
Phaleria Macrocarpa
(Scheff.) Boerl)
DAN DAUN SIRSAK (
Annona Muricata
Linn)
ERA RAHMI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Inhibitor α-Glukosidase dari Gabungan Ekstrak Buah Mahkota Dewa (Phaleria Macrocarpa (Scheff.) (Boerl) dan Daun Sirsak (Annona Muricata Linn) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Maret 2016
Era Rahmi
RINGKASAN
ERA RAHMI. Inhibitor α-Glukosidase dari Gabungan Ekstrak Mahkota Dewa (Phaleria Macrocarpa (Scheff.) Boerl) dan Daun Sirsak (Annona Muricata Linn). Dibimbing oleh IRMA HERAWATI SUPARTO dan LATIFAH KOSIM DARUSMAN.
Pencarian tanaman obat yang dapat dimanfaatkan sebagai obat herbal antidiabetes terus dilakukan, baik dalam bentuk tunggal maupun gabungan dari dua atau lebih tanaman herbal yang berbeda. Mahkota dewa (Phaleria Macrocarpa (Scheff.) Boerl) dan daun sirsak (Annona muricata Linn) merupakan tanaman yang telah banyak dimanfaatkan sebagai obat tradisional, salah satunya sebagai antidiabetes. Beberapa peneliti sebelumnya telah melaporkan bahwa buah mahkota dewa dan daun sirsak memiliki aktivitas antidiabetes melalui inhibisi aktivitas enzim α-glukosidase, namun aktivitas inhibisi dari kedua ekstrak ini masih rendah. Usaha menggabungkan kedua ekstrak buah mahkota dewa dengan daun sirsak diharapkan dapat memberikan efek yang sinergis dalam meningkatkan
aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk menilai efektivitas gabungan ekstrak etanol buah mahkota dewa-daun sirsak
dengan kombinasi tertentu sebagai inhibitor enzim α-glukosidase, serta analisis profil metabolit dari ekstrak yang memiliki aktivitas terbaik menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dan Liquid Chromatography–Mass Spectroscopy
(LC-MS).
Sampel buah mahkota dewa dan daun sirsak dimaserasi menggunakan pelarut etanol 96%, kemudian ditentukan aktivitas inhibisi enzim -glukosidase dari masing-masing ekstrak menggunakan mikroplate 96-well. Ekstrak gabungan ditentukan berdasarkan perbandingan nilai IC50 dari masing-masing ekstrak (1:1,
1:1/3, 1:2/3, 1/3:1, 2/3:1), kemudian dianalisis aktivitas inhibisi enzim α -glukosidase dari masing-masing komposisi ekstrak gabungan. Profil metabolit dari masing-masing ekstrak yang memberikan aktivitas paling baik dianalisis menggunakan KLT dan LC-MS.
Hasil analisis menunjukkan bahwa ekstrak etanol buah mahkota dewa dan daun sirsak mengandung senyawa metabolit sekunder golongan flavonoid, fenolik, terpenoid, steroid, alkaloid, saponin, dan tanin. Aktivitas inhibisi enzim dari masing-masing ekstrak etanol buah mahkota dewa dan daun sirsak semakin meningkat dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak. Kedua ekstrak ini memiliki
potensi sebagai antidiabetes dalam menginhibisi aktivitas enzim α-glukosidase, dengan nilai IC50 dari masing-masing ekstrak berturut-turut adalah 261.343 dan
428.790 µg mL-1. Aktivitas dari kedua ekstrak ini masih rendah jika dibandingkan dengan akarbosa, yang memiliki nilai IC50 0.616 µg mL-1.
Hasil analisis profil metabolit menunjukkan bahwa ekstrak gabungan memiliki profil KLT yang mirip dengan masing-masing ekstrak buah mahkota dewa dan daun sirsak. Senyawa metabolit dugaan yang teridentifikasi dari hasil analisis LC-MS menunjukkan bahwa ekstrak etanol buah mahkota dewa dan daun sirsak adalah senyawa golongan fenolik, flavonoid, dan alkaloid. Ekstrak gabungan juga mengandung senyawa yang sama dengan masing-masing ekstrak buah mahkota dewa dan daun sirsak, dengan beberapa senyawa dugaan yang dominan adalah senyawa yang tergolong kedalam kelompok kuersetin.
SUMMARY
ERA RAHMI. α-Glucosidase inhibitory from crown of god Fruits (Phaleria Macrocarpa (Scheff.) Boerl) and soursop leaves (Annona Muricata Linn) Extract combination. Supervised by IRMA HERAWATI SUPARTO and LATIFAH KOSIM DARUSMAN.
The research of medicinal plants as a source of therapy for diabetic disease still needs to be explored. Currently, many researchers explored not limited to single plant, but also combined medicinal plants. This combined extract is expected to exert interaction specifically a synergistic effect. Crown of god fruits and soursop leaves have been used as a source of traditional medicine, such as antidiabetic activity. However, the antidiabetic activity through the inhibition of -glucosidase for both crown of god fruits and soursop leaves extract still showed weak activity. Combined extracts of both medicinal plants expect to provide
synergistic effect to increase inhibition of α-glucosidase activity. Therefore, the purpose of this research was to evaluate the effectiveness of combined ethanol extract of crown of god fruit-soursop leaves by inhibition assay to α-glucosidase enzyme and to identify the metabolite profiles using Thin Layer Chromatographic (TLC) and Liquid Chromatography–Mass Spectroscopy (LC-MS).
Samples of crown of god fruits and soursop leaves was macerated with ethanol 96%, then inhibition of -glucosidase activity were determined using microplate 96-well. The extracts combination was made based on the IC50 of
enzyme inhibition of each extract (1:1, 1:1/3, 1:2/3, 1/3:1, 2/3:1), then inhibition of -glucosidase activity of both extracts combination were analyzed. Metabolite profile of the most active of individual and combined extracts were analyzed using TLC and LC-MS.
The result showed that the ethanolic extract of crown of god fruits and soursop leaves contained flavonoids, phenolics, terpenoids, steroids, alkaloids,
saponins, and tannins. The α-glucosidase inhibitory activity of each extracts was concentration dependent. Both extracts were potent as antidiabetic activity through the inhibition of -glucosidase, with IC50 values of individual extracts of
crown of god fruits and soursop leaves were 261.343 and 428.790 µg mL-1, respectively. Meanwhile, both of extracts showed lower activities compared to acarbose, with the IC50 value 0.616 µg mL-1.
The inhibition activity of α-glucosidase of extracts combination was better than individual extracts. The highest inhibition activity was obtained at full concentration IC50 of crown of god fruits and two-third IC50 concentration of
soursop leaves (261.343:285.860 µg mL-1) was 84.508±0.71%. The lower activity was obtained at one-third concentration IC50 of crown of god and full
contrentation of soursop leaves (87.114:428.79 µg mL-1), it was 63.89±0.94%. The combined crown of god fruits-soursop leaves ethanolic extracts were more effective than the individual extract.
and alkaloids compounds. The combined extracts also contained a similar compound with each extracts of crown of god fruits and soursop leaves, with a dominant compound that was prediction as a group of quercetin compounds.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Kimia
INHIBITOR α
-GLUKOSIDASE DARI GABUNGAN EKSTRAK
BUAH MAHKOTA DEWA (
Phaleria Macrocarpa
(Scheff.) Boerl)
DAN DAUN SIRSAK (
Annona Muricata
Linn)
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2016
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2015 ini dengan judul Inhibitor α-Glukosidase dari Gabungan Ekstrak Buah Mahkota Dewa (Phaleria Macrocarpa (Scheff.) Boerl) dan Daun Sirsak (Annona Muricata Linn).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr dr Irma Herawati Suparto, MS dan Ibu Prof Dr Ir Latifah Kosim Darusman, MS selaku pembimbing, Ibu Dr Wulan Tri Wahyuni, MSi yang telah banyak memberi saran, serta ibu Prof Dr Ir Dyah Iswantini P, MScAgr selaku ketua program studi Departemen Kimia. Selain itu, penghargaan penulis sampaikan kepada staf Departemen Kimia, Pusat Studi Biofarmaka dan staf laboran Kimia Analitik Departemen Kimia, Institut Pertanian Bogor yang telah membantu selama proses penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, adik, kakak, serta seluruh keluarga, dan teman-teman atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Maret 2016
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vi
DAFTAR GAMBAR vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
1 PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Perumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 2
Manfaat Penelitian 2
Ruang Lingkup Penelitian 2
2 TINJAUAN PUSTAKA 3
Mahkota Dewa 3
Daun Sirsak 4
Diabetes Mellitus 5
Enzim α-Glukosidase 5
Ekstraksi 6
Analisi Sidik Jari dan Kontrol Kualitas 7
3 METODE 9
Bahan dan Alat 10
Prosedur Analisis Data 10
4 HASIL DAN PEMBAHASAN 13
Analisis Kadar Air dan Rendemen 13
Analisis Fitokimia 14
Aktivitas Inhibisi Enzim α-Glukosidase 14 Aktivitas Inhibisi Enzim α-Glukosidase Ekstrak Gabungan 16 Analisis Profil Kromatografi Lapis Tipis (KLT) 17
Analisis Profil Metabolit Menggunakan LC-MS 19
5 SIMPULAN DAN SARAN 20
Simpulan 20
Saran 21
DAFTAR PUSTAKA 21
DAFTAR TABEL
1 Sistem reaksi pengujian aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase 12 2 Komposisi gabungan ekstrak etanol buah mahkota-daun sirsak 12
3 Kadar air dan persentase rendemen 14
4 Aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase dari gabungan ekstrak 16 5 Nilai Rf dan warna pita profil KLT ektrak etanol buah mahkota dewa,
daun sirsak dan ekstrak gabungan. 18
DAFTAR GAMBAR
1 Pohon mahkota dewa 3
2 Pohon sirsak 4
3 Proses kerja kromatografi lapis tipis (KLT) 8
4 Aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase ekstrak etanol buah mahkota dewa
dan daun sirsak 15
5 Profil KLT dari kuersetin (Q), kumarin (K), buah mahkota dewa (MD), daun sirsak (DS) dan gabungan ekstrak buah mahkota dewa-daun sirsak
(MD-DS); UV 254 nm (kiri); UV 366 nm (kanan). 18
6 Kromatogram LC-MS ekstrak etanol buah mahkota dewa, daun sirsak
dan ekstrak gabungan. 19
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian 26
2 Hasil penentuan kadar air serbuk kering buah mahkota dewa dan daun
sirsak 27
3 Hasil penentuan persentase rendemen ekstrak daun sirsak dan buah
mahkota dewa 28
4 Hasil analisis fitokimia ekstrak etanol daun buah mahkota dewa dan daun
sirsak 28
5 Aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase dari masing-masing ekstrak etanol
buah mahkota dewa dan daun sirsak 29
6 Aktivitas inhibisi gabungan ekstrak etanol buah mahkota dewa-daun
sirsak 30
7 Aktivitas Inhibisi α-glukosidase dari akarbosa 31 8 Profil KLT dan nilai Rf pada penggunaan 6 fase gerak berdasarkan
kepolarannya 32
9 Profil KLT menggunakan fase gerak n-butanol dan etil asetat. 33 10 Profil metabolit dan nilai Rf menggunakan pelarut n-butanol:kloroform 34 11 Senyawa-senyawa metabolit teridentifikasi dari ekstrak etanol daun
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tanaman obat dapat ditemukan di berbagai tempat di seluruh dunia, terutama di daerah beriklim tropis. Indonesia merupakan salah satu negara beriklim tropis yang memiliki lebih dari seribu tanaman obat. Penggunaan tanaman obat sebagai obat tradisional untuk menyembuhkan berbagai penyakit telah dilakukan sejak ribuan tahun yang lalu. Saat ini, penggunaan tanaman obat (obat herbal) baik di Indonesia maupun di negara maju seperti Amerika dan Eropa semakin meningkat. Beberapa obat herbal diyakini efektif dapat menyembuhkan berbagai penyakit serta dapat dijadikan sebagai obat alternatif (Kumar et al. 2011). Penelitian-penelitian tentang pencarian tanaman yang dapat dimanfaatkan sebagai herbal antidiabetes terus dilakukan, baik dalam bentuk tunggal maupun kombinasi dari dua atau lebih tanaman yang berbeda. Kombinasi herbal tidak hanya berbeda pada jumlah tanaman maupun senyawa, tetapi juga interaksi senyawa-senyawa dari campuran. Interaksi yang sinergis dari kombinasi akan memberikan aktivitas yang jauh lebih baik daripada komponen tunggalnya (Qi et al. 2010).
Mahkota dewa (Phaleria Macrocarpa (Scheff.) Boerl) merupakan salah satu tanaman yang telah banyak dimanfaatkan untuk pengobatan berbagai penyakit, seperti diabetes. Beberapa penelitian telah membuktikan bahwa buah mahkota dewa memiliki aktivitas sebagai antidiabetes dalam menginhibisi aktivitas enzim
α-glukosidase. Hasil Penelitian Sugiwati et al. (2006) menunjukkan bahwa ekstrak metanol dan air dari buah mahkota dewa mampu menginhibisi aktivitas
enzim α-glukosidase sebesar 40.44 dan 26.53%. Suparto et al. (2008) melaporkan
bahwa ekstrak etanol 30% memiliki aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase dengan aktivitas tertinggi pada konsentrasi 1.5% (29.22%). Selain itu, ekstrak flavonoid dari buah mahkota juga telah diteliti memiliki inhibisi enzim α-glukosidase sebesar 40.26% dengan konsentrasi 1% (Suparto et al. 2009). Ali et al. (2012) juga melaporkan bahwa ekstrak metanol buah mahkota dewa mampu menurunkan kadar glukosa darah dari tikus diabetes diinduksi streptozotosin sebesar 56.25% setelah pengobatan selama 12 hari.
Sirsak (Annona muricata Linn) juga merupakan salah satu tanaman yang telah diteliti memiliki aktivitas antidiabetes. Aktivitas antidiabetes dari daun sirsak melalui inhibisi enzim α-glukosidase telah dilaporkan oleh Kumar et al. (2011) yang menunjukkan bahwa ekstrak metanol dan etil asetat memiliki aktivitas inhibisi dengan nilai IC50 dari masing-masing ekstrak berturut-turut
adalah 37.22 dan 231.54 µg mL-1. Hasil penelitian Adewole dan Martins, (2009) menunjukkan bahwa ekstrak air daun sirsak mampu menurunkan kadar glukosa darah dan meningkatkan konsentrasi insulin dari tikus yang diinduksi streptozotosin. Adeyemi et al. (2009) juga melaporkan ekstrak metanol daun sirsak memiliki aktivitas anti-hiperglikemia dari glukosa darah pada tikus yang diinduksi streptozotosin. Akan tetapi, aktivitas penurunan glukosa darah melalui
2
Usaha menggabungkan kedua ekstrak buah mahkota dewa dengan daun sirsak diharapkan dapat memberikan efek yang sinergis dalam meningkatkan
aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase. Kombinasi ekstrak dibuat berdasarkan nilai IC50, yaitu konsentrasi ekstrak yang mampu menghambat 50% aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase. Gabungan ekstrak dinilai bekerja sinergis apabila memberikan aktivitas inhibisi terhadap enzim α-glukosidase lebih dari 50%. Efek sinergis didefinisikan sebagai efek kombinasi komponen senyawa bioaktif dengan aktivitas paling baik yang tidak dapat dihasilkan komponen tunggal (Rasoanaivo
et al. 2011).
Profil komponen yang terkandung didalam masing-masing ekstrak etanol buah mahkota dewa, daun sirsak, dan ekstrak kombinasi yang memberikan efek terapi dapat diperoleh melalui analisis sidik jari kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan dengan analisis Liquid Chromatography–Mass Spectroscopy (LC-MS). Kedua metode tersebut merupakan metode analisis kualitatif yang telah umum digunakan untuk menganalisis karakteristik dari senyawa-senyawa metabolit sekunder dalam suatu ekstrak herbal. Analisis ini dapat memberikan karakteristik dari senyawa-senyawa metabolit sekunder seperti senyawa golongan fenolik, terpenoid, dan senyawa lainnya sesuai dengan senyawa-senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam suatu ekstrak herbal (Liang et al. 2009).
Perumusan Masalah
Ekstrak buah mahkota dewa dan daun sirsak masih memiliki daya inhibisi yang rendah terhadap enzim α-glukosidase. Gabungan ekstrak buah mahkota dewa dan daun sirsak dengan komposisi tertentu dapat memberikan aktivitas
inhibisi enzim α-glukosidase yang lebih baik.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk menilai efektivitas dari gabungan ekstrak buah mahkota dewa-daun sirsak dalam kombinasi tertentu untuk menginhibisi aktivitas enzim α-glukosidase. Serta analisis profil metabolit dari ekstrak buah mahkota dewa, daun sirsak dan ekstrak gabungan menggunakan KLT dan LC-MS.
Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah gabungan ekstrak buah mahkota dewa-daun sirsak dapat dijadikan sebagai bahan obat alternatif untuk antidiabetes.
Ruang Lingkup Penelitian
3 variasi konsentrasi. Nilai IC50 dari masing-masing ekstrak kemudian ditentukan
dan dijadikan sebagai acuan dalam pembuatan gabungan ekstrak buah mahkota dewa-daun sirsak.
Tahapan selanjutnya dilakukan uji inhibisi ekstrak gabungan terhadap
aktivitas enzim α-glukosidase dan dikaji efek sinergitas dari aktivitas ekstrak gabungan tersebut dengan melihat nilai inhibisi dari gabungan ekstrak. Tahapan akhir adalah analisis profil metabolit senyawa yang terkandung dalam masing-masing ekstrak buah mahkota dewa, daun sirsak dan gabungan keduanya yang memiliki aktivitas terbaik dengan menggunakan KLT dan LC-MS.
2
TINJAUAN PUSTAKA
Mahkota Dewa
Mahkota dewa (Phaleria Macrocarpa) merupakan tumbuhan asli Indonesia yang berasal dari Papua. Tumbuhan ini umumnya hidup liar di daerah hutan dari ketinggian 10–1200 meter di atas permukaan laut dengan curah hujan rata-rata 1000–2500 mm/tahun. Tumbuhan ini diklasifikasikan ke dalam kingdom plantae,
divisi Spermatophyta, subdivisi Angiospermae, kelas Dicotyledonae, bangsa
Thymelacales, suku Thymelacaceae, marga Phaleria, dan spesies Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl (Winarto 2003). Pohon mahkota dewa seperti pada Gambar 1.
Mahkota dewa telah digunakan secara empiris untuk mengatasi berbagai jenis penyakit seperti kanker, diabetes, hiperlipidemik, anti-inflamasi, anti-bakteri, anti-fungal, dan anti-oksidan. Komponen senyawa yang telah berhasil diisolasi dari mahkota dewa adalah falerin, asam galat, mangiferin, mahkosida A, asam dodekanoat, asam palmitat, asam stearat lignan, alkaloid, saponin dan lainnya (Altaf et al. 2013). Bagian dari tumbuhan mahkota dewa yang digunakan sebagai obat tradisional adalah tandan, daun dan buah. Bagian dari tumbuhan mahkota dewa tersebut telah diuji memiliki aktivitas anti-mikroba karena mengandung senyawa flavonoid (Hendra et al. 2011). Buah mahkota dewa mengandung senyawa aktif berupa alkaloid, flavonoid, terpenoid, steroid, saponin, tanin dan senyawa lainnya. Ekstrak metanol buah mahkota dewa memiliki aktivitas yang baik sebagai antioksidan (Altaf et al. 2013).
4
Sugiwati et al. (2006) telah meneliti ekstrak metanol buah mahkota untuk fraksi etilasetat, n-butanol, dan air memiliki aktivitas dalam menghambat kerja
enzim α-glukosidase, serta memiliki aktivitas hipoglikemia yang diujikan pada tikus. Senyawa-senyawa yang telah berhasil diisolasi dari buah mahkota dewa diantaranya adalah senyawa falerin dengan struktur 2,4’,6 -trihydroxy-4-methoxybenzophenone-2-o-β-D-glucosidase, mangiferin, dan icarisida C3 (Oshimi
et al. 2008). Senyawa mangiferin yang terkandung dalam buah mahkota dewa juga bertanggung jawab dalam aktivitas antidiabetes dari buah mahkota dewa (Ali
et al. 2012).
Daun Sirsak
Sirsak (Annona muricata L.) merupakan yang tumbuh di daerah tropis dan subtropis. Tanaman ini berasal dari negara Amerika Selatan, yaitu Meksiko (Malviya et al. 2010). Tanaman sirsak diklasifikasikan berasal dari kingdom
Plantae, dari superdivisi Spermatophyta, divisi Magnoliophyta, Kelas
Magnoliopsida, subkelas Magnoliida, ordo Magnoliales, famili Annonaceae, Genus Annona dan spesiesnya Annona muricata. Pohon sirsak seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2.
Tanaman sirsak telah lama dimanfaatkan untuk berbagai macam penyakit. Beberapa penelitian telah melaporkan bahwa kulit batang, akar dan daun dari tumbuhan sirsak telah digunakan sebagai antidiabetes. Selain berpotensi sebagai antidiabetes, tanaman ini juga memiliki aktivitas anti-hipertensi, antikanker, antibakteri, antifungi, dan antirematik (Adeyemi et al. 2009). Ekstrak air daun sirsak mengandung senyawa saponin, glikosida dan flavonoid (Arthur et al. 2011). Ekstrak air dari daun sirsak menunjukkan adanya aktivitas antidiabetes dan aktivitas antioksidan (Florence et al. 2014).
Senyawa golongan alkaloid yang telah berhasil diisolasi dari daun sirsak antara lain anonaina, alkaloid noraporpine, isolaurelina dan xylopina (Fofana et al. 2011). Matsushige et al. (2012), telah berhasil mengisolasi tiga senyawa baru dari daun sirsak yaitu annoionals A, annoionals B dan annoionosida. Selain senyawa tersebut diatas, senyawa kaempferol dan kuersetin telah berhasil diisolasi dari tumbuhan yang tergolong kedalam family annonaceae dan mememiliki aktivitas biologis (santos dan salatino 2000).
5
Diabetes Mellitus
Diabetes mellitus (DM) merupakan suatu penyakit metabolomik yang ditandai dengan terjadinya peningkatan konsentrasi glukosa dalam darah (hiperglikemia) yang disebabkan karena kekurangan insulin atau fungsi insulin tidak efektif (Association diabetes, 2011). Menurut World Health Organization
(WHO) melalui riset yang dilakukan Wild et al. (2004), diperkirakan penderita diabetes akan meningkat dari 2.8% pada tahun 2000 menjadi 4.4% pada tahun 2030. Jumlah penderita DM diperkirakan 171 juta jiwa pada tahun 2000 akan meningkat menjadi 366 juta jiwa pada 2030. Penderita DM di Indonesia mencapai 8.4 juta jiwa pada 2000 dan diperkirakan akan naik menjadi 21.3 juta jiwa pada 2030. Menurut penelitian yang dilakukan federasi diabetes internasional, pada 2010 penderita DM dalam rentang usia 20-79 tahun diperkirakan telah mencapai 284 juta jiwa, dan pada 2030 akan mencapai 438 juta jiwa.
Diabetes mellitus dibagi menjadi dua tipe, yaitu diabetes tipe I dan diabetes tipe II. Diabetes tipe I merupakan tipe diabetes yang sangat bergantung pada suntikan insulin atau Insulin Dependent Diabetes Mellitus (IDDM), kebanyakan penderitanya masih muda dan tidak gemuk. DM tipe 1 disebabkan oleh rusaknya sel pankreas yang memproduksi insulin, sehingga mengakibatkan kadar insulin menjadi berkurang atau bahkan tidak ada. Pengobatan DM tipe I dilakukan dengan pemberian atau suntik insulin kepada penderita. Diabetes tipe II merupakan tipe diabetes yang tidak bergantung pada insulin atau Non Insulin Dependent Diabetes Mellitus (NIDDM). Penderita DM tipe II umumnya disebabkan oleh obesitas atau kelebihan berat badan. Pengobatan DM tipe II dilakukan dengan pengaturan pola makan dan olah raga, namun dapat pula diobati dengan obat-obat antidiabetes (Matsumono et al. 2002).
Pengobatan penyakit DM dapat dilakukan dengan beberapa cara sesuai dengan tipe diabetes yang diderita. Secara umum pecegahan awal diabetes dapat dilakukan dengan cara pengendalian berat badan, diet, olah raga dan pemberian obat antidiabetik. Pengobatan DM tipe 1 dapat dilakukan dengan cara terapi insulin. Insulin menjadi mutlak diperlukan oleh penderita diabetes tipe I. Pengobatan diabetes tipe II umumnya dilakukan dengan cara pemberian obat antidiabetes secara oral (Association Diabetes, 2011). Pengobatan awal untuk penyakit diabetes tipe II adalah dengan cara mencegah terjadinya kenaikan gula darah setelah makan. Pencegahan ini dapat dilakukan dengan memperlambat kerja
enzim α-glukosidase sehingga dapat menekan laju dari hidrolisis karbohidrat. Hanya monosakarida yang dapat terserap langsung kedalam aliran darah, sedangkan karbohidrat kompleks harus dipecah terlebih dahulu (Sunil et al. 2009).
Enzim α-Glukosidase
α-Glukosidase merupakan enzim golongan hidrolase yang berfungsi memecah karbohidrat pada usus halus manusia. Enzim ini mengkatalisis hidrolisis
-6
glukosidase akan menghambat absorbsi glukosa. Inhibitor enzim α-glukosidase merupakan suatu senyawa yang dapat menghambat kerja dari enzim tersebut.
Senyawa inhibitor enzim α-glukosidase banyak digunakan untuk pengobatan pada pasien diabetes tipe II. Inhibitor α-glukosidase menunda pemecahan oligosakari menjadi monosakarida dengan menginhibisi α-glukosidase pada small intestinal brush border (Ye et al. 2002).
Saat ini, telah dikenal obat yang berfungsi menghambat pembentukan glukosa dari karbohidrat kompleks, yaitu akarbosa yang dijual bebas dan diproduksi Bayer Jerman AG dengan nama dagang Glucobay®. Prinsip kerja
akarbosa adalah dengan menghambat aktivitas dari enzim α-glukosidase secara kompetitif dalam usus halus. Pemberian akarbosa pada penderita diabetes telah
berhasil menghambat aktivitas dari enzim α-glukosidase, sehingga sebagian besar karbohidrat masih dalam bentuk yang belum terurai. Karbohidrat yang tersisa akan tetap berada di usus dan masuk ke usus besar. Dalam usus besar, bakteri mencerna karbohidrat kompleks. Hal ini menyebabkan timbulnya efek samping seperti perut kembung pada sebagian besar pasien dan juga diare pada sebagian kecil pasien.
Ekstraksi
Ekstraksi adalah suatu proses transfer solut dari suatu fase ke fase yang baru. Ekstraksi dilakukan untuk mengambil zat-zat yang terkandung dalam suatu campuran. Proses ekstraksi terjadi akibat nilai konstanta distribusi yang berbeda di kedua fase. Proses transfer solut ini menggunakan prinsip like dissolve like.
Pelarut polar akan melarutkan komponen polar, sedangkan pelarut non-polar akan melarutkan komponen non-polar (Skoog et al. 2004).
Ekstraksi merupakan tahapan awal dari proses penemuan komponen dalam tanaman obat. Ekstraksi dalam konteks analisis tanaman obat merupakan pemisahan komponen aktif dari suatu tanaman dengan menggunakan pelarut yang selektif serta prosedur ekstraksi yang sesuai. Produk yang dihasilkan dapat berupa cairan, semi padat maupun serbuk. Pemilihan metode ekstraksi sangat bergantung pada sifat dari senyawa yang terkandung dalam tanaman obat. Beberapa faktor yang harus diperhatikan dalam proses ekstraksi adalah jenis dan volume pelarut, suhu, lamanya ekstraksi dan jumlah sampel. Beberapa metode yang dapat digunakan untuk mengekstrak suatu komponen dari suatu tanaman obat diantaranya adalah perkolasi, sokletasi, counter-current, sonikasi, dan maserasi. Metode ekstraksi yang umum digunakan untuk memperoleh komponen fitokimia dari tanaman obat adalah maserasi (Singh et al. 2008).
7 Pelarut akan menembus dinding sel tanaman dan masuk kerongga sel yang mengandung zat aktif dan melarutkannya. Ekstraksi menggunakan metode maserasi ini sangat menguntungkan untuk mengekstraksi senyawa yang tidak tahan terhadap panas. Maserasi merupakan salah satu metode ekstraksi yang disarankan dalam pembuatan ekstrak herbal. Jenis pelarut yang digunakan harus dapat mengekstrak seluruh senyawa metabolit sekunder yang terkadung dalam serbuk sampel. Pelarut yang disarankan untuk keperluan farmakologi adalah etanol dan air suling. Metode ekstraksi maserasi sangat mudah untuk dilakukan, cukup dengan merendam serbuk kering menggunakan pelarut, dipisahkan maseratnya dan dipekatkan dengan penguap putar (FHI 2009).
Analisi Sidik Jari dan Kontrol Kualitas
Tanaman herbal mengandung bermacam-macam komponen dengan berbagai variasi konsentrasi. Meskipun sebagian besar dari komponen dalam suatu herbal terdapat dalam konsentrasi yang kecil, namun kualitas dan kemanjuran dari obat herbal tersebut sangat bergantung pada efek yang sinergis dari komponen-komponen tersebut. Profil dan komponen individu dari suatu herbal dapat diperoleh melalui sidik jari (fingerprint) (Bansal et al. 2013). Analisis sidik jari merupakan teknik analisis yang dikembangkan dengan tujuan kontrol kualitas (autentitas, identitas, mutu, dan reliabilitas) suatu obat herbal yang berasal dari tumbuhan (Rajkumar & Sinha 2010). Kontrol kualitas ini bertujuan untuk mengetahui kualitas, keamanan dan mutu dari suatu obat herbal. Analisis sidik jari atau senyawa penciri yang bertanggung jawab dalam suatu obat herbal sangat penting untuk kontrol kualitas dari obat herbal tersebut (Li et al. 2008).
Kromatografi merupakan salah satu metode yang sangat dianjurkan untuk analisis sidik jari dan kontrol kualitas suatu ekstrak herbal. Kromatografi memisahkan komponen berdasarkan pada perbedaan daya adsorpsi suatu komponen diantara dua fase (fase gerak dan fase diam). Teknik pemisahan ini dilakukan dengan melewatkan fase gerak yang mengandung sampel melalui fase diam didalam suatu sistem tertentu sehingga terjadi suatu partisi komponen dalam sampel diantara fase gerak dan fase diam. Komponen yang memiliki rasio distribusi yang lebih besar terhadap fase diam akan membutuhkan waktu paling lama untuk melewati sistem tersebut, begitu juga sebaliknya. Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pemisahan dengan kromatografi yaitu metode ekstraksi, instrumen kromatografi dan kondisi pemisahan. Pemisahan yang baik dari suatu analisis kromatografi memiliki puncak kromatogram dengan nilai resolusi lebih besar atau sama dengan 1.5 dan memiliki nilai rasio sinyal terhadap derau lebih besar atau sama dengan 3 (Harvey 2000).
8
high-performance liquid chromatography- mass spectrometry (HPLC-MS) dan
capillary electrophoretic-mass spectrometry (CE-MS) (Liang et al, 2004).
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
KLT merupakan salah satu metode analisis untuk menentukan kontrol kualitas atau analisis sidik jari suatu obat herbal yang masih umum digunakan sampai saat ini. Analisis menggunakan KLT sangat mudah untuk diaplikasikan dan dapat menganalisis beberapa sampel sekaligus dalam sekali analisis, yang dapat menghasilkan 30 spot atau noda dari sampel dalam satu waktu. KLT merupakan metode analisis yang sangat sederhana, fleksibel, sensitivitas khusus dan juga preparasi sampel yang sangat mudah. TLC juga dapat diaplikasikan untuk menentukan kualitas dan kemungkinan pemalsuan produk herbal (Liang et al. 2004).
KLT memisahkan campuran komponen berdasarkan distribusi antara fase diam dan fase gerak. Pemisahan dilakukan pada lapisan tipis fase stasioner, umumnya pada silika gel yang ditempatkan pada pelat kaca, plastik atau aluminium. Proses kerja KLT dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3 Proses kerja kromatografi lapis tipis (KLT) (Rousessac and Rauessac 2007).
Pergerakan zat relatif terhadap garis depan pelarut dalam sistem KLT didefinisikan sebagai nilai Retention factor (Rf). Rf merupakan nisbah jarak tempuh zat dengan jarak tempuh garis pada pelarut (Rousessac and Rauessac 2007).
Liquid Chromatography-Mass Spectroscopy (LC-MS).
LC-MS merupakan salah satu teknik analitik yang mampu memberikan informasi penting berupa profil, nama serta dapat digunakan untuk menentukan suatu senyawa penciri. Penggabungan Liquid Chromatography dan Mass Spectroscopy memberikan suatu metode baru dalam menganalisis suatu obat herbal (Daszykowski et al. 2007; Liang et al. 2004). Analisis kualitatif suatu obat herbal menggunakan LC-MS dapat menghasilkan karakteristik dari senyawa-senyawa metabolit sekunder seperti alkaloid, flavonoid, saponin, antrakuinon, fenolik, isoflavonoid, lignan dan lainnya sesuai dengan senyawa-senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam suatu obat herbal (Liang et al. 2009).
9 gerak yang digunakan harus berupa kombinasi air dan metanol atau asetonitril. Fase gerak yang digunakan harus bersifat volatil (Korfmacher 2005).
Analisis menggunakan LC-MS menghasilkan data yang sangat besar dan kompleks. Penanganan kompleksitas data ini dapat dilakukan dengan beberapa metode perangkat lunak yang mendukung untuk menyederhanakan dimensi data. Sejumlah perangkat lunak telah dikembangkan untuk penyederhanaan data-data yang kompleks. Salah satu perangkat lunak yang telah dikembangkan adalah
MzMine. Perangkat lunak ini dapat mengubah format data kromatogram menjadi data yang lebih mudah diolah, seperti dalam bentuk netCDF. Perangkat lunak pengolah data spekra massa memiliki kemampuan algoritma yang mampu menyaring dan menyingkirkan data yang dianggap sebagai derau (noise), sehingga mampu mendeteksi ion analat yang ditandai sebagai hubungan rasio m/z
terhadap waktu retensi. Selanjutnya perangkat lunak akan menyusun (alignment) dan melakukan normalisasi terhadap kumpulan data sehingga menghasilkan mass aray berupa tabel puncak yang merupakan matriks berukuran besar. Identifikasi metabolit dugaan dari kromatogram LC-MS dilakukan dengan mencocokkan nilai
m/z pada tabel mass array dengan massa akurat senyawa metabolit pada literatur (Castillo et al. 2011).
Tahapan penting pada proses pengolahan data menggunakan perangkat lunak mzMine adalah pemisahan puncak kromatogram yang berupa sinyal dan pengganggu dengan melakukan koreksi baseline. Tahap berikutnya, deteksi puncak untuk mengidentifikasi dan kuantifikasi sinyal yang terkait dengan molekul dalam sampel, serta mereduksi kompleksisitas data, sehingga analisis data menjadi lebih mudah. Tahap deisotop bertujuan untuk menyederhanakan matriks data untuk tahap analisis berikutnya. Tahap aligment merupakan tahap yang penting untuk membandingkan sifat metabolit antar sampel yang dianalisis dengan cara mencocokkan dan mengelompokkan puncak yang dihasilkan sampel sebelum memasuki tahap analisis secara statistika. Tahap gap filling diperlukan untuk mendeteksi puncak dengan intensitas yang sangat rendah, kualitas bentuk yang kurang baik, atau adanya kesalahan dalam mendeteksi puncak sehingga dapat mencegah terjadinya penarikan kesimpulan yang kurang tepat. Data yang telah diidentifikasi mengalami normalisasi untuk mengoreksi dan menyempurnakan data. Normalisai dapat dilakukan dengan menghilangkan bias sistematik yang tidak diinginkan dalam pengukuran (Castillo et al. 2011).
3
METODE
10
Bahan dan Alat
Sampel yang digunakan adalah daun sirsak dan buah mahkota dewa yang diperoleh dari kebun Pusat Studi Biofarmaka, Cikabayan, IPB. Bahan-bahan kimia untuk ekstraksi dan analisis metabolit sekunder antara lain etanol 70%, pereaksi uji flavonoid, alkaloid, terpenoid, steroid, saponin dan tannin. Bahan untuk uji aktivitas enzim α-glukosidase, yaitu enzim α-glukosidase (Sigma G 3651-250UN), p-nitrofenil α-D-glukopiranosida (PNG) (Sigma N 1377-5G),
serum bovine albumin (SBA), dan tablet akarbosa (Bayer, Jakarta-Indonesia). Bahan yang digunakan untuk analisis profil metabolit dengan KLT yaitu fase gerak metanol, etil asetat, kloroform, n-butanol, diklorometana dan n-heksana. Alat-alat yang digunakan antara lain peralatan kaca sederhana, neraca analitik, oven, penguap putar, inkubator, pembaca mikroplat, bejana kromatografi, pelat KLT G254, dan lampu UV.
Prosedur Analisis Data
Penyiapan Serbuk Buah Mahkota Dewa dan Daun Sirsak Kering
Daun sirsak yang digunakan adalah daun yang terletak pada lembaran keempat dari pucuk ke arah yang lebih tua. Buah mahkota dewa yang digunakan adalah buah tua. Masing-masing sampel dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 50 oC hingga kadar air kurang dari 10%. Hasil pengeringan kemudian digiling hingga membentuk serbuk berukuran 40 mesh (AOAC 1984).
Pengukuran Kadar Air
Pengukuran kadar air dianalisis menggunakan metode standar AOAC (1984). Cawan porselin dikeringkan pada suhu 105 oC selama 30 menit lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Sebanyak ± 3 g masing-masing simplisia dimasukkan ke dalam cawan yang telah ditetapkan bobotnya. Kemudian dimasukkan ke dalam oven pada suhu 105 °C selama 3 jam lalu didinginkan dalam desikator dan bobotnya ditimbang. Pengulangan dilakukan hingga diperoleh bobot konstan. Selanjutnya dihitung kadar air menggunakan persamaan dibawah ini:
Kadar air % = A − BA X %
Keterangan:
A = bobot sampel sebelum dikeringkan (g) B = bobot sampel setelah dikeringkan (g)
Maserasi
11
Analisis Fitokimia
Analisis metabolit sekunder dari masing-masing sampel buah mahkota dewa dan daun sirsak dilakukan menggunakan metode standar Harbone (1987). Analisis ini meliputi kandungan senyawa flavonoid, fenolik, terpenoid, steroid, alkaloid, saponin dan tanin.
Analisis Flavonoid dan Fenolik. Ekstrak sampel dilarutkan dalam air kemudian dididihkan selama 2 menit lalu disaring. Untuk pengujian flavonoid, 5 mL filtratnya ditambah H2SO4 atau setelah dipanaskan 5 ml filtrat ditambahkan
0.25 g serbuk Mg dan ditambahkan 1ml klorhidrat. Terbentuknya warna merah akibat penambahan H2SO4 menunjukkan adanya senyawa golongan flavonoid dan
terbentuknya warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol, sedangkan untuk pengujian senyawa fenolik, ditambahkan NaOH 10% (b/v) terbentuknya warna merah menunjukkan adanya senyawa fenolik hidrokuinon.
Analisis terpenoid dan steroid. Ekstrak sampel dilarutkan dalam 5 ml etanol, lalu dipanaskan pada 50°C dan disaring. Filtrat yang diperoleh diuapkan hingga kering kemudian dilarutkan dengan eter. Lapisan eter ditambah 3 tetes asetat anhidrida dan 1 tetes H2SO4 pekat. Warna merah atau ungu menunjukkan
adanya terpenoid dan warna hijau menunjukkan adanya steroid.
Analisis Alkaloid. Ekstrak sampel ditambahkan 2.5 mL kloroform dan beberapa tetes amoniak. Kemudian campuran diasamkan dengan 5 tetes H2SO4
2M. Fraksi asam dibagi menjadi tiga tabung kemudian masing-masing ditambahkan pereaksi Meyer, Wagner, dan Dragendrof. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih pada pereaksi Meyer, endapan cokelat pada pereaksi Wagner, dan terbentuk warna merah jingga pada pereaksi Dragendrof.
Analisis Saponin. Ekstrak dari masing-masing bagian ditambah air secukupnya dan dipanaskan selama lima menit. Larutan tersebut didinginkan kemudian dikocok. Timbulnya busa selama sekitar 10 menit menunjukkan adanya saponin.
Analisis Tanin. Ekstrak sampel ditambahkan air kemudian dididihkan selama 2 menit lalu disaring. Sebanyak 5 ml filtrat ditambahkan larutan FeCl3 1%
(b/v). Uji positif ditandai dengan munculnya warna biru tua atau hijau kehitaman.
Analisis Aktivitas Enzim α-Glukosidase
Analisis aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase mengacu pada metode yang dikembangkan (Sugiwati et al. 2006) dan (Shancheti et al. 2009). Masing-masing sampel dilarutkan dalam pelarut dimetil sulfoksida (DMSO) dengan konsentrasi 125, 250, 500, 750 dan 1000 µg ml-1. Larutan enzim dibuat dengan melarutkan 1.0
mg α-glukosidase dalam larutan buffer fosfat (pH 7) yang mengandung 200 mg serum bovin albumin. Sebelum digunakan sebanyak 1 ml enzim diencerkan 25 kali dengan buffer fosfat (pH 7). Campuran pereaksi terdiri dari 50 µL larutan buffer fosfat 0.1 M (pH 7.0), 25 µL ρ-nitrofenil α-D-glukopiranosa (ρ-NPG) 10 mM sebagai substrat, 10 µL larutan sampel dalam dimetil sulfoksida, dan 25 µL
larutan enzim α-glukosidase 0.04 unit mL-1. Setelah itu, campuran pereaksi diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit. Reaksi enzim dihentikan dengan menambahkan 100 µL sodium karbonat (Na2CO3) 0.2 M dan absorbans dari p
12
Kontrol posistif dibuat dengan melarutkan tablet akarbosa dalam buffer fosfat (pH 7) dan HCl 2N. Konsentrasi larutan standar akarbosa 1% yang digunakan dibuat dari tablet akarbosa yang dilarutkan dalam akuades dan HCl 2N (1:1). Perbandingan bobot tablet akarbosa dengan akuades dan HCl 2N adalah 1 : 100. Kemudian larutan akarbosa disentrifus dan supernatannya digunakan sebagai standar. Larutan standar diperlakukan sama dengan ekstrak. Sistem reaksi enzim selengkapnya untuk setiap sampel dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Sistem reaksi pengujian aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase
Kontrol Blanko
Setiap pengujian diulang sebanyak 3 kali. Masing-masing pengujian daya
hambat ekstrak terhadap aktivitas α-glukosidase dihitung dalam % inhibisi dengan rumus,
% inhibisi = C − SC X %
C adalah absorbans larutan tanpa adanya ekstrak (kontrol) dan S adalah absorbans larutan dengan pemberian ekstrak dari sampel. Nilai IC50 diperoleh
dengan memplot log konsentrasi versus persen inhibisi menggunakan persamaan regresi. Nilai IC50 adalah nilai konsentrasi yang menghambat 50% kerja enzim.
Pembuatan Gabungan Ekstrak Etanol Daun Sirsak dan Buah mahkota Dewa
Ekstrak gabungan ditentukan menggunakan metode numerik dengan beberapa perbandingan komposisi. Komposisi ekstrak gabungan dibuat berdasarkan nilai IC50 dari masing-masing ekstrak etanol buah mahkota dewa dan
daun sirsak. Variasi komposisi gabungan ekstrak seperti ditampilkan pada Tabel 2. Hasil penggabungan ekstrak kemudian dilakukan pengujian terhadap aktivitas
inhibisi α-glukosidase dengan metode yang sama.
Tabel 2 Komposisi gabungan ekstrak etanol buah mahkota dewa dan daun sirsak
Gabungan Perbandingan komposisi ekstrak (IC50)
Buah mahkota dewa Daun sirsak
1:1 1 1
1:1/3 1 1/3
1:2/3 1 2/3
1/3:1 1/3 1
13
Analisis Sidik Jari Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Analisis profil KLT dari masing-masing ekstrak etanol buah mahkota dewa, daun sirsak dan ekstrak gabungan yang memiliki aktivitas terbaik mengacu pada metode yang dikemukakan Rafi et al. (2011). Esktrak etanol buah mahkota dewa dan daun sirsak dilarutkan dalam pelarut etanol dan ditotolkan pada pelat KLT silika gel 60 F254. Setelah kering, pelat dimasukkan kedalam bejana kromatografi
yang diisi dengan masing-masing eluen dan telah dijenuhkan selama 30 menit. Eluen yang digunakan adalah metanol, etil asetat, kloroform, n-butanol, diklorometana dan n-heksana. Elusi dihentikan ketika eluen telah mencapai 1 cm batas atas pelat KLT. Setelah elusi selesai maka pelat diangkat, dikeringkan dan dideteksi dibawah lampu UV 254 dan 366 nm. Analisis profil KLT dari ekstrak gabungan dilakukan dengan eluen yang memberikan pemisahan yang baik berdasarkan kepolarannya.
Analisis LC-MS
Sampel ekstrak buah mahkota dewa, daun sirsak dan ekstrak kombinasi masing-masing dilarutkan dalam pelarut etanol, kemudian disaring menggunakan filter milipore berukuran 0.45 mikron. Masing-masing sampel diinjeksikan ke dalam system instrument ultra performance liquid chromatography-electro spary ionization-quadropole time of flight (UPLC-ESI-QTOF). MS yang digunakan adalah system Xevo G2-S TOF dengan mode ionisasi positif. Parameter ESI yang digunakan meliputi suhu kapiler 120oC, dengan laju aliran gas 50 L/jam, sumber tegangan sebesar +2.9 kV. Modus full scan dari m/z 100-1000 dilakukan dengan suhu sumber 41oC. Kolom UPLC yang digunakan Acquity UPLC BEH C18 1.8
µm x 2.1 x 150 mm, dengan eluen yang digunakan adalah metanol:air.
Selanjutnya dilakukan pengolahan data menggunakan perangkat lunak
mzMine. Data kromatogram yang dihasilkan diubah kedalam bentuk NetCDF dan diolah melalui beberapa tahapan yaitu filtering, baseline peak, peak detection, deisotope, aligment, gap filling, dan normalisasi. Hasil yang diperoleh setelah dilakukan beberapa tahap berupa data mass array dari kromatogram masing-masing ekstrak yang meliputi 3 variabel yaitu m/z, waktu retensi, dan intensitas puncak. Identifikasi senyawa metabolit dugaan dilakukan dengan mencocokkan data m/z hasil analisis dengan masa akurat pada literatur (Castillo et al. 2011).
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis Kadar Air dan Rendemen
14
Tabel 3 Kadar air dan rendemen ekstrak etanol buah mahkota dewa dan daun sirsak
Simplisia Kadar air (%)a Rendemen (%)a
Buah mahkota dewa 5.60 ± 0.60 16.51 ± 1.28
Daun sirsak 7.42 ± 0.07 16.11 ± 0.29
a
Hasil dinyatakan dalam ± relatif standar deviasi (n = 3)
Tabel 3 menunjukkan persentase kadar air dari serbuk kering buah mahkota dewa dan daun sirsak, dan juga persentase rendemen dari ekstrak buah mahkota dewa dan daun sirsak yang dimaserasi menggunakan pelarut etanol 96%. Kadar air dari kedua sampel berada di bawah 10%, hal ini menunjukkan sampel buah mahkota dewa dan daun sirsak yang digunakan dalam penelitian ini memenuhi persyaratan untuk ekstrak herbal Menteri Kesehatan Republik Indonesia No.661/Menkes/sk/vii/1994. Ekstraksi dilakukan dengan teknik maserasi menggunakan pelarut etanol, pelarut ini mampu mengekstrak semua senyawa metabolit yang bersifat polar maupun kurang polar. Selain itu, berdasarkan Menteri kesehatan, (2009), etanol merupakan salah satu jenis pelarut selain pelarut air yang diizinkan untuk membuat ekstrak sediaan bahan alam yang dijadikan sebagai ekstrak herbal. Rendemen ekstrak yang diperoleh dari buah mahkota dewa dan daun sirsak tidak jauh berbeda, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3. Hal ini menunjukkan bahwa kandungan senyawa bioaktif yang bersifat polar maupun kurang polar dari buah mahkota dewa dan daun sirsak yang mampu terekstrak dengan pelarut etanol tidak jauh berbeda.
Analisis Fitokimia
Analisis fitokimia secara kualitatif sangat penting untuk mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder dalam ekstrak etanol buah mahkota dewa dan daun sirsak. Kedua ekstrak tersebut mengandung senyawa metabolit sekunder golongan flavonoid, fenolik, terpenoid, steroid, alkaloid, saponin dan tannin (Lampiran 4). Hasil ini sesuai dengan temuan Lay et al. (2014) dan Gavamukulya
et al. (2014). Keberadaan senyawa metabolit sekunder inilah yang diduga dapat memberikan efek farmakologis untuk berbagai penyakit dari suatu bahan alam, salah satunya sebagai inhibitor enzim α-glukosidase. Golongan senyawa metabolit sekunder seperti fenolik, alkaloid, saponin dan antrakuinon dari berbagai tumbuhan telah dilaporkan memiliki aktivitas antidiabetes (Qi et al. 2010).
Aktivitas Inhibisi Enzim α-Glukosidase
15
Gambar 4 Aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase ekstrak etanol buah mahkota dewa dan daun sirsak
Hasil analisis menunjukkan bahwa aktivitas inhibisi semakin meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi masing-masing sampel (Gambar 4). Perhitungan persentase inhibisi pada masing-masing konsentrasi ekstrak dapat dilihat pada Lampiran 5a dan 5b. Aktivitas inhibisi ekstrak (etanol 96%) buah mahkota dewa (24.53% sampai 89.683%) pada penelitian ini lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak etanol 30% yang dilaporkan Suparto et al. (2008) dengan aktivitas inhibisi pada konsentrasi 1.5% (setara dengan 15.000 µg mL-1) sebesar 29.22%. Hal ini diduga karena perbedaan kepolaran pelarut yang menghasilkan senyawa yang berbeda-beda di dalam masing-masing ekstrak, sehingga bioaktivitas yang dihasilkan juga akan berbeda. Ekstrak etanol buah mahkota dewa dalam penelitian ini memiliki aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak flavonoid dari buah mahkota dewa yang dilaporkan Suparto et al. (2009) dengan aktivitas inhibisi sebesar 40.26% pada konsentrasi 1% (setara dengan 10.000 µg mL-1). Umumnya, senyawa-senyawa metabolit yang terkandung dalam ekstrak kasar suatu bahan alam bekerja sinergis dalam menginhibisi aktivitas enzim, sehingga memiliki aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan satu golongan senyawa (Kumar et al. 2011).
Namun demikian, aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase ekstrak etanol buah mahkota dewa pada penelitian ini lebih rendah dibandingkan dengan ekstrak metanol dan air hasil temuan Sugiwati et al. (2006) yang memiliki aktivitas tertinggi pada konsentrasi 50 µg mL-1 yaitu masing-masing 40.44 dan 26.59%. Begitu pula dengan ekstrak etanol daun sirsak (26.920% sampai 62.307%), yang memiliki aktivitas yang lebih rendah dibandingkan ekstrak air, metanol dan juga ekstrak etil asetat yang dilaporkan Kumar et al. (2011). Perbedaan pelarut dan sumber sampel yang digunakan dapat mempengaruhi aktivitas inhibisinya terhadap enzim α-glukosidase.
Berdasarkan nilai IC50, yang dihitung menggunakan persamaan kurva
hubungan antara log konsentrasi versus persentase inhibisi (Lampiran 5c), menunjukkan bahwa ekstrak etanol buah mahkota dewa memiliki aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak etanol daun sirsak. Nilai IC50 yang
diperoleh berturut-turut adalah 261.343 dan 428.790 µg mL-1. Namun, kedua ekstrak ini memiliki aktivitas yang sangat rendah jika dibandingkan dengan akarbosa, yang merupakan kontrol positif yang memiliki mekanisme inhibisi
16
enzim α-glukosidase, dengan nilai IC50 yang diperoleh dalam penelitian ini adalah
0.616 µg mL-1 (Lampiran 7). Oleh karena itu, kombinasi ekstrak etanol buah mahkota dewa dan daun sirsak dilakukan untuk mengetahui sinergitas dari gabungan ekstrak dalam menginhibisi aktivitas enzim α-glukosidase. Penggabungan ekstrak dilakukan berdasarkan konsentrasi IC50 dari
masing-masing ekstrak etanol buah mahkota dewa dan daun sirsak.
Aktivitas Inhibisi Enzim α-Glukosidase menggunakan Ekstrak Gabungan
Analisis aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase dari gabungan ekstrak etanol buah mahkota dewa dan daun sirsak dilakukan untuk mengetahui efek sinergis dari ekstrak gabungan. Aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase dari gabungan ekstrak buah mahkota dewa-daun sirsak yang diperoleh ditampilkan pada Tabel 4. Tabel 4 Aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase dari gabungan ekstrak etanol buah
mahkota dewa dan daun sirsak
Hasil dinyatakan dalam ± relatif standar deviasi (n = 3)
Gabungan ekstrak pada berbagai variasi komposisi memberikan aktivitas inhibisi yang lebih baik dibandingkan dengan masing-masing ekstrak (63.89±0.94% sampai 84.51±0.79%) yang dianalisis secara individual. Hal ini menunjukkan bahwa gabungan kedua ekstrak etanol buah mahkota dewa-daun sirsak diduga bekerja sinergis, sehingga lebih efektif dibandingkan masing-masing ekstrak dalam meningkatkan aktivitas inhibisi terhadap enzim α -glukosidase (Tabel 4). Persentase inhibisi aktivitas enzim α-glukosidase dari ekstrak gabungan sangat bervariasi, sehingga dapat dikatakan bahwa aktivitas inhibisi ekstrak gabungan bergantung pada perbandingan konsentrasi dan sinergitas dari komponen-komponen yang terkandung di dalam masing-masing ekstrak. Aktivitas inhibisi tertinggi diperoleh pada perbandingan 1:2/3 yaitu sebesar 84.52±0.79%, sedangkan terendah diperoleh pada konsentrasi 1/3:1 (63.89±0.94%). Aktivitas inhibisi dari ekstrak gabungan dapat diprediksikan bahwa ekstrak buah mahkota dewa memberikan kontribusi yang lebih besar dibandingkan dengan ekstrak daun sirsak, yang selaras dengan nilai IC50 dari
masing-masing ekstrak. Hal ini ditunjukkan dengan semakin besar konsentrasi dari ekstrak buah mahkota dewa maka aktivitas inhibisi semakin meningkat. Sebaliknya, aktivitas menurun dengan menurunnya konsentrasi ekstrak buah mahkota dewa. Meskipun demikian, ekstrak daun sirsak juga memberikan
kontribusi dalam menginhibisi aktivitas enzim α-glukosidase.
17 memberikan efek inhibisi terhadap suatu organisme sasaran dari gabungan dua komponen bioaktif dengan aktivitas paling baik yang tidak dapat dihasilkan komponen tunggal. Senyawa-senyawa yang terkandung dalam suatu ekstrak dengan sedikit atau bahkan tidak memiliki aktivitas terhadap suatu target, akan membantu memperkuat komponen utama dengan memperkuat bioviabilitas atau dengan menurunkan metabolisme. Namun, tidak semua komposisi kombinasi dapat dikatakan bekerja sinergi. Studi in vivo sangat diperlukan untuk mengetahui efek di dalam metabolisme yang menunjukkan efek antagonis dan tidak dapat terdeteksi secara in vitro.
Analisis Profil Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Analisis KLT dilakukan untuk mengetahui profil metabolit dari masing-masing ekstrak etanol buah mahkota dewa, daun sirsak dan ekstrak gabungan. Analisis awal dilakukan terhadap masing-masing ekstrak etanol buah mahkota dewa dan daun sirsak menggunakan 6 jenis fase gerak yang berbeda berdasarkan kepolarannya. Setiap fase gerak memberikan pemisahan dengan warna spot dan nilai Rf yang berbeda-beda untuk masing-masing ekstrak etanol buah mahkota dewa dan daun sirsak. Hasil analisis menunjukkan masing-masing fase gerak n-butanol dan etil asetat memberikan pemisahan yang baik untuk kedua ekstrak yang dielusi (Lampiran 8a dan 8b).
Profil KLT ekstrak gabungan dielusi menggunakan fase gerak n-butanol dan etil asetat. Hasil analisis menunjukkan bahwa fase gerak n-butanol memberikan pemisahan yang lebih baik dibandingkan dengan fase gerak etil asetat (Lampiran 9a dan 9b). Namun, profil yang dihasilkan menggunakan fase gerak n-butanol masih menunjukkan spot yang sangat berdekatan dan berekor. Oleh karena itu, diperlukan penambahan suatu aditif untuk mendapatkan profil dengan pemisahan yang lebih baik. Aditif yang dipilih adalah kloroform, hal ini sesuai dengan kepolaran senyawa yang terkandung dalam masing-masing ekstrak etanol buah mahkota dewa dan daun sirsak. Kombinasi kedua fase gerak ini diharapkan dapat memberikan profil metabolit yang lebih baik terhadap masing-masing ekstrak dan ekstrak gabungan.
Profil KLT dari ekstrak etanol buah mahkota dewa, daun sirsak dan gabungan kedua ekstrak dianalisis menggunakan kombinasi fase gerak n-butanol:kloroform pada beberapa variasi komposisi yaitu 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, dan 7:3 (v/v). Keterpisahan yang baik dan jumlah spot yang banyak diperoleh pada penggunan fase gerak n-butanol:kloroform dengan komposisi 6:4 (v/v), dengan warna spot dan nilai Rf yang berbeda-beda untuk masing-masing ekstrak etanol buah mahkota dewa, daun sirsak dan ekstrak gabungan (Lampiran 10a dan 10b).
18
Gambar 5 Profil KLT dari kuersetin (Q), kumarin (K), buah mahkota dewa (MD), daun sirsak (DS) dan gabungan ekstrak buah mahkota dewa-daun sirsak (MD-DS); UV 254 nm (kiri); UV 366 nm (kanan).
Hasil analisis menunjukkan pita senyawa standar kuercetin dan kumarin ikut terbawa ke atas dengan pergerakan fase gerak (Gambar 5). Hal ini kemungkinan dipengaruhi oleh kepolaran fase gerak yang sangat dekat dengan kepolaran standar kuersetin dan kumarin, sehingga menyebabkan kedua senyawa standar tersebut ikut terbawa bersamaan dengan pergerakan fase gerak. Sehingga tidak dapat terdeteksi pada masing-masing ekstrak dan ekstrak gabungan. Perbandingan nilai Rf dan warna pita dari masing-masing ekstrak dan ekstrak gabungan dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5 Nilai Rf dan warna pita profil KLT ektrak etanol buah mahkota dewa, daun sirsak dan ekstrak gabungan
Buah mahkota dewa Daun sirsak Gabungan ekstrak buah mahkota dewa-daun sirsak Nilai Rf UV 366 nm Nilai Rf UV 366 nm Nilai Rf UV 366 nm
0.36 Kuning pudar 0.26 Biru 0.25 Kuning pudar
0.45 Biru 0.50 Merah 0.46 Merah
0.52 Biru terang 0.67 Merah 0.67 Merah
0.67 Biru 0.75 Merah 0.75 Merah
0.76 Merah 0.82 Merah 0.84 Merah
0.88 Kuning pudar - -
Hasil analisis terhadap ekstrak gabungan menunjukkan bahwa pita-pita yang terdeteksi memiliki nilai Rf dan warna pita yang mirip dengan pita pada masing-masing ekstrak etanol buah mahkota dewa dan daun sirsak (Gambar 5 dan Tabel 5). Hal ini diduga karena konsentrasi masing-masing ekstrak yang digunakan hampir berdekatan. Warna profil hanya dapat berfloreusen di bawah lampu UV 366 nm. Meskipun demikian, di bawah UV 254 nm juga dapat terdeteksi pita-pita berwarna gelap yang memiliki nilai Rf yang sama dengan pita yang terdeteksi di bawah UV 366 nm.
19 lampu UV 366 terdeteksi adanya pita berwarna kuning pudar, biru, biru terang dan merah. Warna profil ini menunjukkan adanya senyawa fenolik yang memiliki struktur aromatik. Menurut Harbone (1984), senyawa fenolik yang mengandung struktur aromatik berfluoresensi hijau, kuning, putih kekuning pucat, ungu, merah muda, merah, biru, coklat atau hitam di bawah lampu UV 366 nm. Sebagian besar warna ini terdeteksi pada ekstrak etanol buah mahkota dewa, daun sirsak dan ekstrak gabungan. Beberapa hasil penelitian telah membuktikan bahwa senyawa fenolik dari berbagai tumbuhan memiliki aktivitas antidiabetes (Qi et al. 2010).
Analisis Profil Metabolit Menggunakan LC-MS
Analisis profil metabolit menggunakan LC-MS dilakukan untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa metabolit dugaan yang terkandung di dalam masing-masing ekstrak etanol buah mahkota dewa, daun sirsak dan gabungan ekstrak yang memiliki aktivitas terbaik. Kromatogram yang dihasilkan dari ekstrak gabungan memiliki pola yang mirip dengan masing-masing ekstrak etanol buah mahkota dewa dan daun sirsak. Pemprofilan metabolit menggunakan LC-MS menghasilkan matriks data tiga dimensi yang berukuran sangat besar dan kompleks, yang meliputi nilai rasio massa terhadap muatan (m/z), waktu retensi dan intensitas puncak (Gambar 6).
Gambar 6 Kromatogram LC-MS ekstrak etanol buah mahkota dewa, daun sirsak dan ekstrak gabungan.
Satu puncak dalam kromatogram LC-MS dapat terdiri dari lebih dari satu ion molekul, sehingga perlu identifikasi ion molekul yang sesuai dengan waktu retensi dalam kromatogram. Kompleksitas data ini dapat ditangani dengan pengolahan data menggunakan perangkat lunak mzMine. Perlakuan pendahuluan ini dapat menghindari masalah akibat geseran garis dasar (background) dan mengurangi derau acak pada kromatogram awal. Identifikasi metabolit dugaan dari kromatogram LC-MS dilakukan dengan mencocokkan nilai m/z pada tabel
mass array dengan massa akurat senyawa metabolit pada literatur dan data base
20
Hasil analisis menggunakan perangkat lunak mzMine diperoleh data berupa tabel mass array yang meliputi massa akurat, waktu retensi dan intensitas puncak yang ternormalisasi. Puncak ion molekul atau ion fragmen yang dihitung adalah ion molekul atau ion fragmen yang memiliki nilai rasio sinyal terhadap derau (S/N) sama dengan 10. Nilai S/N ini diperoleh dari pengolahan data menggunakan perangkat lunak mzMine dari masing-masing ekstrak buah mahkota dewa, daun sirsak dan gabungan ekstrak. Jumlah puncak ion molekul atau ion fragmen yang diperoleh dari masing-masing ekstrak etanol buah mahkota dewa, daun sirsak dan ekstrak gabungan berturut-turut adalah 73, 78, dan 87 puncak ion molekul atau ion fragmen. Namun demikian, tidak semua senyawa dapat diidentifikasi sebagai senyawa metabolit dugaan, hal ini dikarenakan keterbatasan data base dari masing-masing ekstrak buah mahkota dewa dan daun sirsak.
Senyawa metabolit dugaan yang teridentifikasi dari masing-masing ekstrak etanol buah mahkota dewa, daun sirsak dan ekstrak gabungan dapat dilihat pada Lampiran 11. Senyawa yang teridentifikasi dari ekstrak gabungan merupakan senyawa yang sama yang terkandung di dalam masing-masing ekstrak buah mahkota dewa dan daun sirsak. Ekstrak etanol buah mahkota dewa, daun sirsak dan ekstrak gabungan mengandung senyawa golongan flavonoid, fenolik dan alkaloid. Selain itu, senyawa yang diduga paling dominan di dalam ekstrak gabungan adalah senyawa yang tergolong dalam kelompok annonaceae acetogenin dan senyawa flavonol, seperti senyawa golongan kuersetin. Beberapa senyawa golongan kuersetin yang diduga terkandung dalam ekstrak gabungan adalah dihydroquertin (taxifolin), quercetin 3-O-α-rhamnosyl-(1 −> 6)-β -sophorisede, dan 3,7-Di-O-methylquercetin, yang memiliki nilai m/z berturut-turut adalah 305.065, 772.585 dan 330.170 (Lampiran 11). Menurut Plotnikof et al. (2003) senyawa golongan flavonoid seperti kelompok senyawa kuersetin memiliki aktivitas antidiabetes.
5
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
21
Saran
Pengujian toksisitas terhadap ekstrak gabungan dan studi in vivo disarankan untuk mengetahui efek sinergis atau antagonis di dalam metabolisme yang tidak dapat terdeteksi secara in vitro.
DAFTAR PUSTAKA
Adewole SO, Martin C EA. 2006. Morphological changes and hypoglycemic effects of Annona muricata Linn. (Annonaceae) leaf aqueous extract on
pancreatic β-cells of streptozotocin-treated diabetic rats. Afr J Biomed Res. 9:173-187.
Adeyemi, Olawale D, Komolafe, Aderibigbe O, Adewole, Stephen O, Martins OE, Kehinde AT. 2009. Anti hyperglycemic activities of Annona Muricata
(LINN). Afr J Trad CAM. 6(1):62–69. ISSN 0189-6016.
Alali FQ, Rogers L, Zhang Y, McLaughlin JL. 1998. Unusual bioactive annonaceous acetogenins from Goniothalamus giganteus. Tetrahedron. 54:5833-5844. PH: S0040-4020(98)00286-5.
Ali R, Atangwho I, Kuar N, Mohamed E, Mohamed A, Asmawi M. Z, Mahmud R. 2012. Hypoglycemic and anti-hyperlycemic study of Phaleria Macrocarpa fruits pericarp. J Med Plant Res. 6(10):1982-1990.
Altaf R, Zaini M, Dewa A, Sadikun A, Umar MI. 2013. Phytocemistry and medicinal properties of Phaleria Macrocarpa (Scheff.) Boerl extracts.
Pharmacogn Rev.7(5):73-80.doi:10.4103/0973-7847.112853.
AOAC. 1984. Official Methods of Analysis. Associat Official Anal Chemist. Washington D.C.
Arthur F.K.N, Woode E, Terlabi E.O, Larbie C. 2011. Evaluation of acute and subcrhonic toxicity of Annona Muricata (Linn.) aqueos extract in animals.
Europ J Exp Bio. 1(4):115-12.ISN:2248-9215.
Bansal A, Chhabra V, Rawal RK, Sharma S. 2013. Chemometrics: A new scenario in herbal drug standardization. J Pharm Analys. 4(4):223-233. Blesson J, Saji CV, Nivya RM, Kumar R. 2014. Synergistic antibacterial activity
of natural plant extracts and antibiotic against methicillin resistant staphylococcus aureus (MRSA). J Pharm and Pharmaceutical Scie. 03(4):741-763. ISSN:2278-4357.
Castillo S, gopalacharyulu P, Yetukuri L, Oresic M. 2011. Agorithms and tools for the preprocessing of LC-MS metabolomics data. Chemo and Intellig Lab Systems 108:23-32.
Champy P, Guerineau V, Laprevote O. 2009. MALDI-TOF MS profiling of Annonaceous acetogenins in Annona muricata products for humam consumtion. Molecules. 14:5235-5246. doi:10.3390/molecules14125235. Chang F R, Wu Y C. 2001. Novel cytotoxid Annonaceous Acetogenins from
22
Daszykowski M, Wu W, Nicholls A.W, Ball R.j, Czekaj T, Walczak B. 2007. Identifying potential biomarker in LC-MS data. J Chemometrics. 21:292-302.doi: 10.1002/cem.1066.
Diabetes Care. 2011. Diagnosis and Clasification of Diabetes Mellitus. Diabetes care. 34(1).doi: 10.2337/dc11-S062.
[FHI] Farmakope Herbal Indonesia. 2009. Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor 261/Menkes/SK/IV/2009 Tentang Farmakope Herbal Edisi Pertama. Jakarta: MENKES RI.
Florence NT, Benoid MZ, Jonas JK, Alexandra T, Desire DD, Pierre K, Theophile D. 2014. Antidiabetic and antioxidant effects of annona muricata
(Annonaceae), Aqueous extract on streptozotocin-induced diabetic rats. J Etnopharmacol. 151(2):784-790.doi:10.1016/j.jep.2013.09.021.
Floris et al. 2005. α-glucosidase inhibitors for patient with type 2 diabetes.
Diabetes Care 28:154-163.
Fofana S, Ziyaev R, Abdusamatov, Zakirov K. 2011. Alkaloid from Annona Muricata leaves. Chem Nat Comp. 47(2):321.UDC:547.944/945.
Gavamukulya Y, Abou F E, Wamunyokoli F, Shemy H A. 2014. Phytochemical screening, anti-oxidant activity and in vitro anticancer potential of ethanolic and water leaves extracts of Annona muricata (Graviola). Asian Pac Trop Med.7(1):S355-S363. doi: 10.1016/S1995-7645(14)60258-3.
Gleye C, Laurens A, Hocquemiller R, Cave A. 1997. Isolation of montecristin, a key metabolite in Biogenesis of Acetogenins from Annona muricata and its structure elucidation by using tandem mass spectrometry. J Org Chem. 62(3):510-513.
Gleye C, Raynaud S, Fourneau C, Laurens A, Lavrevote O, Serani L, Fournet A, Hocqumiller R. 2000. Cohinins C dan D, two important metabolites in the biogenesis of acetogenins from Annona muricata and Annona nutans. J Nat Prod. 63(9):1192-1196
Harbone JB. 1987. Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Bandung:ITB.
Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. USA:McGraw-Hill Companies. Inc.
Hendra R, Ahmad S, Sukari A, Shukor MY, Oskoueian E. 2011. Flavonoid analyses and antimicrobial activity of various parts of Phaleria Macrocarpa
(Scheff.) Boerl fruit. Int J Mol Sci. 12:3422-3431.doi:10.3390/ijms12063422.
Korfmacher WA. 2005. Foundation review: Principles and applications of LC-MS in new drug discovery. 10:20: 1357-1367. PII: S1359-6446(05)03620-2. Kumar P, Chu C, Krisnaiah D, Bono A. 2006. High hydrostatic pressure
extraction of antioxidants from morinda cicitrifolia fruit process parameters optimization. J enginering Sci&Tech. 1(1):41-49.
Kumar R, Arora V, Ram V, Bhandari A, Vyas P. 2011. Hypoglicemic and hypolipidemic effect of allopolyherbal formulation in streptozotocin induced diabetes mellitus in rats. Int J Diabet Mell. Xxx: xxx-xxx
