PENGARUH SUHU DAN LAMA PENYIMPANAN PADA
KESTABILAN SAMPEL ENZIM ASETILKOLINESTERASE
DARI DARAH MANUSIA
TESIS
Oleh
TUTI HANDAYANI
047008008/BM
SEKOLAH PASCASARJANA
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
PENGARUH SUHU DAN LAMA PENYIMPANAN PADA
KESTABILAN SAMPEL ENZIM ASETILKOLINESTERASE
DARI DARAH MANUSIA
TESIS
Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Magister Kesehatan dalam Program Studi Biomedik
pada Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara
Oleh
TUTI HANDAYANI 047008008/BM
SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
Judul Tesis : PENGARUH SUHU DAN LAMA PENYIMPANAN PADA KESTABILAN SAMPEL ENZIM ASETILKOLINESTERASE DARI DARAH MANUSIA
Nama Mahasiswa : Tuti Handayani
Nomor Pokok : 047008008
Program Studi : Biomedik
Menyetujui Komisi Pembimbing
(dr. Yahwardiah Siregar, Ph.D) (Prof. Burhanuddin Nasution, Sp.PK (K)) Ketua Anggota
Ketua Program Studi, Direktur,
(dr. Yahwardiah Siregar, Ph.D) (Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B, MSc)
Telah diuji pada
Tanggal : 16 Januari 2009
PANITIA PENGUJI TESIS
Ketua : dr. Yahwardiah Siregar, Ph.D
Anggota : 1. Prof. Burhanuddin Nasution, Sp.PK (K)
2. Prof. Dr. Dwi Suryanto, MSc
ABSTRAK
Penelitian tentang Pengaruh Suhu Dan Lama Penyimpanan Pada Kestabilan Sampel Enzim Asetilkolinesterase Dari Darah Manusia dilaksanakan pada bulan Maret hingga bulan Mei 2008 di laboratorium Terpadu Universitas Sumatera Utara.
Pengambilan sampel pada penelitian ini dilakukan dengan teknik acak sederhana (simple random sampling) dari darah 10 pria sehat usia 18-25 tahun (mahasiswa Universitas Tjut Nyak Dhien Medan).
Rancangan yang digunakan pada penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) Faktorial, dan analisa statistik dilakukan dengan ANOVA. Plasma darah yang diperoleh diukur aktifitas enzim asetilkolinesterase (0 minggu), lalu plasma darah tersebut disimpan pada suhu -20≡Χ, 4-6≡Χ, δαν 25-30≡Χ σελαmα 2 δαν 4
minggu kemudian dilakukan pengukuran kembali aktifitas enzim asetilkolinesterase. Pengukuran aktifitas enzim asetilkolinesterase dilakukan dengan menggunakan alat spektrofotometer (genesys 5).
Hasil yang diperoleh dari penelitian ini menunjukkan bahwa plasma darah yang disimpan pada suhu -20≡Χ δαν 4-6≡Χ σελαmα 4 mινγγυ τιδακ mεmπενγαρυηι
terhadap kestabilan dan aktifitas enzim asetilkolinestrase. Sedangkan penyimpanan pada suhu 25-30≡Χ σελαmα 2 - 4 minggu berpengaruh terhadap kestabilan aktifitas enzim tersebut.
ABSTRACT
The research about Effect on Temperature And the Storage length of
Stability of Sample Enzyme Achetylcolinesterase From Blood Human which was
conducted on March until May 2008 at the Interrelated Discipline Laboratory of University of North Sumatra.
The sample of this research has been taken by way of complete simple random sampling from 10 healthy male and with the age of 18 up to 25 (University of Tjut Nyak Dhien Medan).
The method used in this research is complete factorial random, and statistic analysis conducted by way of variant analysis (ANOVA). The obtained Blood plasma is measured through the activities of enzyme achetylcolinesterase (zero week), then the blood plasma was stored in the temperature of -20≡Χ, 4-6≡Χ, ανδ 25-30≡Χ ωιτηιν
2 and 4 weeks then the re-measurement is conducted on the activity of Enzyme Achetylcolinesterase. In term of the measurement of enzyme achetylcolinesterase activity, spectrophotometer (genesys 5).
The result of this research, the blood plasma which was kept in the temperature of -20≡Χ ανδ 4-6≡Χ διδ νοτ αφφεχτ τηε σταβιλιτψ οφ ενζψmε
achetylcolinesterase activities within 4 weeks, while the blood plasma that was stored in the temperature of 25-30≡Χ ανδ τηε ενζψmε αχηετψλχολινεστερασε αχτιϖιτψ τενδσ το
change after being stored within 2- 4 weeks.
KATA PENGANTAR
Syukur Alhamdulillah penulis mengucapkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan karunia-Nya, sehingga dengan izin-Nya penulis dapat menyelesaikan tesis ini dengan judul Pengaruh Suhu Dan Lama Penyimpanan Pada Kestabilan Sampel Enzim Asetilkolinesterase Dari Darah Manusia. Tesis
ini merupakan salah satu syarat yang harus dipenuhi untuk memperoleh Gelar Magister Kesehatan dalam Program Studi Biomedik pada Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara Medan.
Dengan selesainya tesis ini perkenankanlah penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
Rektor Universitas Sumatera Utara, Prof. dr. H. Chairuddin P. Lubis,
DTM&H, Sp.A (K) dan seluruh jajarannya yang telah memberikan kesempatan pada penulis untuk mengikuti pendidikan di Sekolah Pascasarjana USU Medan.
Direktur Sekolah Pascasarjana USU Medan, Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B.
M.Sc dan Ketua Program Studi Ilmu Biomedik sekaligus Ketua Komisi Pembimbing, dr. Yahwardiah Siregar, Ph.D atas kesempatan, fasilitas dan dorongan yang diberikan
kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan pendidikan program magister di Sekolah Pascasarjana USU Medan.
Pembimbing) serta Prof. Dr. Dwi Suryanto, MSc dan Dr. Ramlan Silaban, M.Si. (Komisi Pembanding) yang dengan penuh perhatian memberikan dorongan, bimbingan, semangat, bantuan serta saran-saran yang bermanfaat kepada penulis dari persiapan penelitian sampai pada penyelesaian tesis ini. Terima kasih juga disampaikan kepada semua dosen yang telah membimbing penulis selama mengikuti program magister ini.
Ucapan terima kasih yang tulus dan rasa hormat penulis sampaikan kepada orang tua penulis Ayahanda H. Sabaruddin Yus dan Ibunda Hj. Siti Markiah yang telah melahirkan, membesarkan dan mendidik penulis sehingga menjadi manusia yang berguna. Suami tersayang Irwansyah Simbolon, yang telah dengan tabah dan sabar memberikan dorongan baik moril maupun materil sehingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan pada Program Studi Biomedik Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara Medan. Untuk ananda tersayang Alm. Muzuni yang telah memberikan semangat pada penulis untuk menyelesaikan pendidikan ini, walaupun ananda hanya sebentar bersama penulis. Kedua Mertua penulis Bapak Khaidir Simbolon dan Ibu Maharani serta Bulek Hj. Siti Mudjina juga saudara penulis Mbak Evie, Mas Is, Mas Rudi, Mbak Indri, Mas Herri, Mbak Ida, Mas Budi, Mbak Wana dan adik penulis Suryani Simbolon juga keponakan penulis yang telah memberikan dukungan moril.
Kepada seluruh pihak yang telah membantu selama penulis mengikuti pendidikan ini tak lupa penulis sampaikan rasa terima kasih yang tidak terhingga.
Tesis ini masih jauh dari kesempurnaan, karena keterbatasan dalam berbagai bidang, karena itu penulis mengharapkan kritikan dan saran demi penyempurnaan tulisan ini pada masa mendatang. Hanya kepada Allah SWT penulis berserah diri dan semoga selalu diberikan petunjuk-Nya, Amin Ya Rabbal Alamin.
Medan, Juli 2009 Penulis
RIWAYAT HIDUP
1. Nama : Tuti Handayani
2. Tempat/Tanggal Lahir : Medan, 26 April 1971
3. Agama : Islam
4. Status : Menikah
5. Alamat : Jl. Kapt. M. Jamil Lbs No. 199/48 Medan
6. Telp/HP : (061) 7382849 / 081534733550 / (061) 77420170
7. Pendidikan :
SD Budi Satya Medan : 1977 – 1983
SMP Budi Satya Medan : 1983 – 1986 SMA Negeri 10 Medan : 1986 – 1989 Sarjana (S1) Fakultas MIPA USU : 1990 – 1996 Pascasarjana (S2) Biomedik SPS USU : 2004 – 2009 8. Riwayat Pekerjaan :
Staf Pengajar SMA Yayasan Perguruan
Pangeran Antasari : 1999 – 2006
Staf Pengajar SMKN I Medan : 2000 – 2004 Staf Pengajar Fakultas Farmasi Universitas
DAFTAR ISI
2.2. Asetilkolinesterase (AChE)... 7
2.3. Sintesis Asetilkolinesterase (AChE) ... 7
2.4. Fungsi Asetilkolinesterase... 9
2.5. Pengukuran Aktifitas Enzim Asetilkolinesterase (AChE) 12 BAB III METODOLOGI PENELITIAN ... 14
3.1. Tempat dan Waktu Penelitian ... 14
3.7. Pelaksanaan Penelitian ... 16
3.8. Variabel yang Diamati... 19
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 20
4.1. Hasil... 20
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 28
5.1. Kesimpulan... 28
5.2. Saran ... 28
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
No. Judul Halaman 1. Hidrolisis asetilkolin oleh asetilkolinesterase (AChE) ... 2
2. Sintesis asetilkolin dari kondensasi kolin dengan asetil CoA yang dikatalisir oleh enzim kolin asetiltransferase ... 8
3. Berbagai peristiwa biokimia yang berlangsung di ujung saraf kolinergik,
Asetilkolin (ACh), Asetilkolinesterase (AChE) dan reseptor (X)... ... 8 4. Ringkasan reaksi asetilkolin di sinaps ... 10 5. Struktur tiga dimensi (3-D) dari asetilkolinesterase (AChE) pada ikan
Torpedo california (Tc AChE) ... 12
6. Grafik Histogram Aktifitas Enzim Asetilkolinesterase 0 minggu dan
setelah 2 minggu serta 4 minggu penyimpanan... 21 7. Grafik Histogram Aktifitas Enzim Asetilkolinesterase Sebelum
Perlakuan (0 Minggu) Dan Setelah Perlakuan Disimpan Pada Suhu -20≡Χ Σελαmα 2 Μινγγυ δαν 4 Μινγγυ ... 22 8. Grafik Histogram Aktifitas Enzim Asetilkolinesterase Sebelum
Perlakuan (0 Minggu) Dan Setelah Perlakuan Disimpan Pada Suhu 4-6≡Χ Σελαmα 2 Μινγγυ δαν 4 Μινγγυ... 22 9. Grafik Histogram Aktifitas Enzim Asetilkolinesterase Sebelum
Perlakuan (0 Minggu) Dan Setelah Perlakuan Disimpan Pada Suhu 25-30≡Χ Σελαmα 2 Μινγγυ δαν 4 Μινγγυ... 23 10. Grafik Histogram Aktifitas Enzim asetilkolinesterase Yang Disimpan
Pada Suhu -20≡Χ Dαν 4-6≡Χ σετελαη 2 mινγγυ... 24 11. Grafik Histogram Aktifitas Enzim asetilkolinesterase Yang Disimpan
Pada Suhu -20≡Χ Dαν 4-6≡Χ σετελαη 4 mινγγυ ... 24 12. Grafik Histogram Aktifitas Enzim asetilkolinesterase Yang Disimpan
Pada Suhu 4-6≡Χ Dαν 25-30≡Χ σετελαη 2 mινγγυ... 25 13. Grafik Histogram Aktifitas Enzim asetilkolinesterase Yang Disimpan
DAFTAR LAMPIRAN
No Judul Halaman
1. Data Penelitian ... 31 2. Analisa Data ... 32 3. Surat Keterangan Kesehatan Mahasiswa ... 36
BAB I.
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Perkembangan ilmu dan teknologi khususnya di bidang kesehatan bertujuan untuk meningkatkan kualitas hidup setiap individu untuk mencapai tingkat kesehatan yang optimal. Pada hakikatnya ini adalah untuk meningkatkan sumber daya manusia yang berkualitas serta menambah produktifitas kerja yang lebih baik.
Pada saat ini, praktek dunia kedokteran modern sering mempergunakan enzim untuk dugaan beberapa penyakit seperti Myocardiac Infarction yang mempergunakan Kreatin Kinase (KK) dan Laktat Dehidrogenase (LDH) serta Glutamat Piruvat Transaminase (GPT) dan Glutamat Oksaloasetat Transaminase (GOT) untuk mengetahui adanya kerusakan jaringan hati dan lainnya. Pengujian dengan enzim di atas berdasarkan jumlahnya dalam darah. Selain jumlah, aktifitas enzim seperti asetilkolinesterase (AChE), juga dapat memberikan informasi penting dan menjadi perhatian dengan timbulnya penyakit. Aktifitas asetilkolinesterase menurun menandakan adanya kerusakan jaringan hati. Penetapan jumlah dan aktifitas enzim yang telah diuji di laboratorium sangat membantu dalam menegakkan diagnosis beberapa penyakit (Mc.Kee and Mc.Kee, 2003).
didegradasi dalam beberapa milidetik sebelum tiba impuls syaraf berikutnya, untuk mencegah stimulasi berlebihan dari reseptor syaraf (Voet and Voet, 2004). Reaksi kimia hidrolisis asetilkolin oleh asetilkolinesterase (AChE) seperti terlihat pada Gambar 1. di bawah ini:
(Sumber : http:// www/ Chemistry emory-Edu- Justice- Seminar, 2006) Gambar 1.: Hidrolisis asetilkolin oleh asetilkolinesterase (AChE)
Gangguan kesehatan dapat terjadi akibat adanya penumpukan asetilkolin pada ujung syaraf. Hal ini dapat terjadi karena adanya penghambat kompetitif yang menyerang situs aktif dari asetilkolinesterase seperti tacrine edrophonium dan penghambat non kompetitif misalnya propidium gallamine yang berikatan dengan
peripheral site ataupun decamethonium dan BW284c51 yang mampu menyerang
enzim ini sehingga asetilkolin tidak dihidrolisis menjadi asetat dan kolin (Voet and Voet, 2004; Giles, 2006).
Dengan demikian asetilkolinesterase merupakan enzim yang biasa dipergunakan untuk menunjukkan adanya indikasi keracunan organofosfat, karena asetilkolinesterase tidak berfungsi maka terjadi penumpukan asetilkolin pada ujung syaraf, sehingga syaraf dalam tubuh terus-menerus mengirim perintah kepada otot tertentu. Dalam keadaan demikian otot-otot tersebut senantiasa berkontraksi tanpa dapat dikendalikan. Disamping timbulnya kontraksi gerakan otot tertentu, gejala lain dari keracunan pestisida organofosfat adalah pupil atau celah iris mata menyempit sehingga penglihatan menjadi kabur, mata berair, mulut berbusa atau mengeluarkan banyak air liur, sakit kepala, pusing, lemas, detak jantung cepat, mual, muntah, kejang pada perut, mencret, sukar bernafas, otot-otot tidak dapat digerakkan, lumpuh dan pingsan. Gejala tersebut disebabkan berkurangnya aktifitas enzim asetilkolinesterase karena diikat pestisida organofosfat dan ikatan ini bersifat irreversibel (Voet and Voet, 2004).
Di laboratorium dapat diperiksa aktifitas enzim asetilkolinesterase dengan menggunakan sampel serum darah. Pemeriksaan aktifitas enzim asetilkolinesterase ini dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti suhu, pH, dan waktu. Disamping itu penyimpanan sampel penting diperhatikan untuk mempertahankan kestabilan enzim ini terutama berkaitan dengan temperatur penyimpanan. Enzim asetilkolinesterase yang immobil jika disimpan pada temperatur 4°Χ δαπατ βερταηαν σελαmα 140 ηαρι.
Plumlee et al (1994) melakukan penelitian tentang pengaruh lama penyimpanan dan suhu penyimpanan pada sampel darah. Hasil penelitiannya menunjukkan sampel darah yang disimpan selama 1 minggu masih dapat digunakan untuk mengukur aktifitas asetilkolinesterase jika disimpan pada suhu 50C sedangkan plasma kolinesterase jika disimpan selama 21 hari pada suhu 40C dalam larutan
citrate-phosphate-dextrose aktifitasnya hanya tinggal 87 % saja (Epstein et.al., 1980;
King and Morgan, 1970).
Penyimpanan enzim asetilkolinesterase ini penting diperhatikan, karena kemungkinan lokasi pengambilan sampel dan tempat analisis sampel bukan berada pada satu daerah, sehingga cara penyimpanan dan transportasinya akan mempengaruhi aktifitas enzim tersebut. Salah satu cara yang saat ini dipergunakan untuk penyimpanan sampel adalah dengan pendinginan (Feld, 2006).
Suhu merupakan salah satu faktor penting yang harus diperhatikan pada proses penyimpanan sampel yang akan dianalisis. Perubahan suhu dapat mempengaruhi aktifitas enzim tersebut dan ini dapat mengakibatkan kesalahan dalam interpretasi hasil pemeriksaan terhadap aktifitas enzim tersebut.
1.2 Perumusan Masalah
Masalah yang diangkat dalam penelitian ini adalah:
Bagaimana pengaruh perbedaan suhu dan lamanya penyimpanan terhadap aktifitas enzim asetilkolinesterase.
1.3Tujuan Penelitian
Tujuan umum dari penelitian ini adalah :
Untuk melihat hubungan antara suhu penyimpanan dan lamanya waktu penyimpanan dengan aktifitas enzim asetilkolinesterase.
Tujuan khusus dari penelitian ini adalah :
Untuk mengetahui aktifitas enzim asetilkolinesterase yang disimpan pada suhu –200C, 4-60C dan 25–300C , masing-masing selama 2 dan 4 minggu.
1.4 Hipotesis
Suhu 4-60C merupakan suhu yang paling baik untuk penyimpanan selama 2 dan 4 minggu serta tidak mempengaruhi aktifitas enzim asetilkolinesterase.
1.5 Manfaat Penelitian
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Enzim
Reaksi-reaksi biokimia yang sangat kompleks berlangsung di dalam tubuh makhluk hidup secara terus-menerus dengan kecepatan yang sangat tinggi dan terarah. Reaksi yang kompleks ini dapat juga berlangsung di luar sel, tetapi reaksinya berjalan dengan lambat. Hal ini disebabkan di dalam sel hidup terdapat suatu zat yang bersifat sebagai biokatalisator yaitu enzim. Enzim disintesis dalam sel, dapat mempercepat proses suatu reaksi tanpa mempengaruhi hasilnya, sehingga kecepatan reaksi dapat berjalan sesuai dengan proses biokimia yang dibutuhkan untuk mengatur kehidupan.
Setiap enzim bekerja hanya terhadap zat tertentu saja yaitu suatu substrat. Untuk mempermudah mengenal lebih jauh tentang enzim dilakukan pengklasifikasian sesuai dengan substrat yang dikerjakannya ditambah dengan akhiran – ase. The International Union of Biochemistry (IUB), memberikan sistematik penamaan enzim berdasarkan reaksi yang dikatalisnya dan sampai saat ini dikenal enam kelompok besar enzim yaitu oksidoreduktase, transferase, hidrolase, liase, isomerase dan ligase (Mc. Kee and Mc. Kee, 2003).
2.2 Asetilkolinesterase (AChE)
Satu dari sekian banyak enzim dalam tubuh adalah asetilkolinesterase atau sering disingkat dengan kolinesterase saja. Studi tentang kolinesterase diawali pada tahun 1914, kemudian dilanjutkan oleh Loewi dan Navratil pada tahun 1926 dengan mengisolasi dari jantung katak untuk membuktikan adanya penghambatan
physostigmin (eserine) dan efeknya pada asetilkolin. Selanjutnya pada tahun 1932
Stedman et al mengisolasi enzim ini dari serum kuda dan dikenal sebagai kolin-esterase (Giles, 2006). Kolinkolin-esterase ini berfungsi untuk mendegradasi asetilkolin menjadi kolin dan asam asetat.
2.3 Sintesis Asetilkolinesterase (AChE)
adanya kondensasi kolin dan asetil CoA yang dikatalisir oleh enzim kolin asetil transferase yang reaksinya seperti terlihat di bawah ini:
(Sumber : Devlin, 2000)
Gambar 2. : Sintesis asetilkolin dari kondensasi kolin dengan asetil CoA yang dikatalisir oleh enzim kolin asetiltransferase
Kolin juga dibentuk dalam neuron, asetat diaktifkan melalui penggabungan gugus asetat dengan koenzim A reduksi. Reaksi antara asetat aktif (asetil koenzim A) dengan kolin, dikatalisis oleh enzim kolin asetiltransferase. Kolin secara aktif diambil ke dalam neuron kolinergik dengan menggunakan suatu transporter seperti terlihat pada Gambar 3. di bawah ini:
Neuron kolinergik
(Sumber : Ganong, 1995)
Enzim kolin asetiltransferase dengan kosentrasi tinggi terdapat di sitoplasama ujung-ujung saraf kolinergik, lokasinya demikian spesifik sehingga adanya enzim ini dengan konsentrasi tinggi di suatu daerah persarafan, menunjukkan bahwa sinaps-sinaps di daerah itu adalah kolinergik (Ganong, 1995). Selain di syaraf asetilkolinesterase (AChE) juga dapat dijumpai di darah.
Kolin diperoleh dari diet, beberapa diperoleh dari reabsorbsi synaptic junction atau dari sumber metabolik lainnya. Sumber terbesar asetil CoA adalah dekarboksilasi piruvat oleh kelompok piruvat dehidrogenase (Devlin, 2000). Asetil CoA disintesis di mitokondria dan kolin asetiltransferase terdapat di sitosol. Sintesa asetilkolin berlangsung pada neuron presinaptik. Asetilkolin dilepaskan dan berinteraksi dengan reseptor nikotinik yang terletak pada membran post sinaptik.
2.4. Fungsi Asetilkolinesterase
(Sumber : Devlin, 2000)
Gambar 4.: Ringkasan reaksi asetilkolin di sinaps
Kolinesterase yang terdapat di plasma ini ada di bawah kendali sistem endokrin dan dipengaruhi oleh perubahan variatif fungsi hati. Sebaliknya kolinesterase spesifik yang terdapat di ujung saraf tempatnya sangat terlokalisasi. Pembentukan enzim ini disandikan oleh satu gen tunggal, tetapi dua unit katalitik terbentuk melalui penyambungan alternatif mRNA. Satu terikat pada membran sel melalui kaitan glikolipid sedangkan yang satu lagi biasanya berekor kolagen. Hidrolisis asetilkolin oleh kolinesterase yang berlangsung cukup cepat dapat menjadi dasar penjelasan perubahan konduktans Na+ dan kegiatan listrik yang terjadi pada peristiwa transmisi sinaptik (Ganong, 1995).
Enzim asetilkolinesterase (AChE), mempunyai KM 9,5x 10–9, Kcat 1,4 x 104 S-1, efisiensi katalitik (KCat/KM) 1,5 x 108 M-1S-1 adalah suatu katalisator yang baik. Penelitian tentang asetilkolinesterase (AChE) telah dilakukan pada tahun 1991 oleh Israel Silman dan Joel L. Jussman, pada ikan Torpedo california (Tc AChE) dan mendapatkan struktur 3 dimensi (3-D), catalytic triad pada AChE, seperti terlihat pada Gambar 5. di bawah ini. Didapati 537 residu AChE pada ikan Torpedo
(Sumber : http://www/Weizman ac-Il-home Joel-papers-science, 2006)
Gambar 5. : Struktur tiga dimensi (3-D) dari asetilkolinesterase (AChE) pada ikan
Torpedo california (Tc AChE)
Sejumlah gas syaraf dan neurotoksin lainnya menginhibisi aktifitas asetilkolinesterase dengan mengadakan reaksi pada bagian aktif serin. Akibatnya toksin ini memperpanjang aksi asetilkolin, sehingga memperpanjang reaksi depolarisasi membran. Inhibitor tersebut dapat mematikan karena pencegahan relaksasi otot pernafasan (Voet and Voet, 2004).
2.5 Pengukuran Aktifitas Enzim Asetilkolinesterase (AChE)
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Tempat Dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Terpadu Universitas Sumatera Utara. Waktu penelitian adalah mulai dari bulan Maret 2008 hingga bulan Mei 2008.
3.2 Alat Dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: Centrifuge (Fisher scientific), jarum suntik (Terumo), mikro pipet (Biorad), kuvet, lemari pendingin, tabung eppendorf, termometer, spektrophotometer (Genesys 5), spidol, vortex (Thermolyne),dan waterbath. Bahan-bahan yang digunakan adalah: aquadestilata, EDTA, kapas, kit achetylcholinesterase (Ecolin S+), kit total protein (Biuret), tisue dan serum darah yang diperoleh dari sampel mahasiswa.
3.3 Rancangan Penelitian
3.4 Populasi Penelitian
Populasi penelitian diambil dari orang sehat pria (mahasiswa Universitas Tjut Nyak Dhien Medan) yang berusia 18-25 tahun, karena subjek penelitian berumur 18 tahun sudah bisa menanda tangani informed consent sendiri dan subjek penelitian dibatasi pada umur 25 tahun, karena aktifitas mereka dianggap masih homogen.
3.5 Sampel Penelitian
Sampel pada penelitian ini diambil dengan teknik acak sederhana (simple
random sampling) dan memenuhi kriteria inklusi.
Kriteria inklusi :
a. Mahasiswa b. Pria
c. Usia 18-25 tahun
d. Sehat, tidak menderita penyakit hati, mal nutrisi, infeksi akut dan kronis, serta nefrotik sindrom (melalui anamnese).
Kriteria eksklusi :
a. Semua yang tidak sesuai dengan kriteria di atas.
3.6 Besar Sampel
Besar sampel pada penelitian ini dihitung berdasarkan rumus :
Keterangan :
= Standar Deviasi = 0,3
(dari penelitian sebelumnya oleh Plumlee, et al, 1994). Z = 1,96
Z = 0,842
1 = 2,0
2 = 2,4 (dari penelitian sebelumnya oleh Plumlee, et al, 1994).
n = Besar sampel = 8,9 ! 10 sampel
3.7 Pelaksanaan Penelitian
a. Pengambilan Sampel
Dengan menggunakan jarum suntik (terumo), diambil 3 ml dari masing-masing sebanyak 10 orang mahasiswa. Kemudian darah tersebut dimasukkan dalam tabung reaksi yang telah diisi EDTA lalu tiap tabung reaksi tersebut disentrifugasi selama 5 menit. Setelah terjadi pemisahan antara plasma dan darah kemudian dimasukkan sebanyak 200 ∝λ πλασmα κεδαλαm mασινγ-masing mikrosentrifugasi
(tabung eppenddorf) kemudian tiap tabung disimpan pada suhu –200C (freezer), 4-60C (kulkas) serta 25–300C (suhu ruang) dan diukur aktifitas asetilkolinesterase
b. Pemeriksaan sampel
Pada penelitian ini selain dilakukan pengukuran pada aktifitas enzim asetilkolinesterase, juga dilakukan pengukuran total protein untuk mengetahui perubahan yang mungkin terjadi pada protein.
b.1 Pemeriksaan enzim asetilkolinesterase (AChE)
Aktifitas enzim asetilkolinesterase (AChE) dapat diukur dengan menggunakan alat spektrofotometer (Genesys 5). Alat spektrofotometer (Genesys 5) dihidupkan dan dibiarkan pengaturan automatiknya bekerja, sambil menunggu spektrofotometer dapat dipergunakan waterbath dihidupkan dan diukur sampai suhu 37°C. Kemudian dilakukan pembuatan blanko dengan cara dipipet aquadestilata sebanyak 20 l dan dimasukkan dalam tabung eppendorf lalu ditambahkan reagensia 1 (kit cholinesterase) sebanyak 1000 l dan dihomogenkan (vortex mixer) serta diinkubasikan dalam waterbath (37 oC) selama ± 3 mενιτ, σετελαη ιτυ διταmβαηκαν
reagensia 2 (kit cholinesterase) sebanyak 250 l dan dihomogenkan lalu di masukkan dalam kuvet. Pembacaan dilakukan setelah 2 menit pada panjang gelombang 405 nm dan lama pembacaan 3 menit dengan interval 1menit. Untuk pengukuran sampel, dilakukan dengan cara diambil plasma sebanyak 20 l dan di masukkan dalam tabung
eppendorf lalu ditambahkan reagensia 1 (kit cholinesterase) sebanyak 1000 l dan
dihomogenkan (vortex mixer) serta diinkubasikan dalam waterbath (37oC) selama
dan dihomogenkan lalu di masukkan dalam kuvet, pembacaan dilakukan dengan cara yang sama seperti membaca blanko diatas.
b.2 Perhitungan aktifitas enzim asetilkolinesterase (AChE)
Aktifitas enzim diukur dengan cara mengambil nilai A/min yaitu: nilai
rata-rata selisih absorbansi yang dibaca 3 kali dengan inteval 1 menit dan dikalikan dengan 68500 (hasil perkalian oleh kit reagensia asetilkolinestrase).
Hasil perhitungan yang diperoleh lalu dibandingkan dengan nilai normal yang ada yaitu:
Nilai normal : a. Pria : 4620 – 11500 [U/I] b. Wanita : 3930 – 10800 [U/I]
b.3 Pemeriksaan total protein
Pemeriksaan total protein dilakukan dengan menggunakan metode biuret, sebagai larutan blanko digunakan 1000∝λ Ρ1 (ρεαγεντ 1) δαν λαρυταν στανδαρ αδαλαη
campuran dari 20∝λ Ρ2 (ρεαγεντ στανδαρδ) δενγαν 1000∝λ ρεαγεντ Ρ1 ψανγ
dihomogenkan (vortex mixer) dan diinkubasikan dalam waterbath selama 10 menit pada suhu 20–25 ≡Χ, λαλυ διmασυκκαν κε δαλαm κυϖet. Untuk pengukuran sampel dilakukan dengan cara mencampur 20 ∝λ πλασmα δενγαν 1000∝λ ρεαγεντ Ρ1 κεmυδιαν
gelombang 546 nm. Pembacaan di lakukan 2 kali dengan selang waktu 30 menit. Hasil yang diperoleh adalah langsung konsentrasi protein dalam larutan tersebut karena alat spektrofotometer langsung membaca absorbansi dengan memperhitumgkan blanko dan standard.
b.4. Perhitungan nilai total protein
Nilai total protein yang diperoleh dari hasil pembacaan oleh spektrofotometer dibandingkan dengan nilai normal total protein. Nilai normal total protein adalah antara 66-87 (g/l).
3.8. Variabel Yang Diamati
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil
Dari penelitian ini didapatkan aktifitas enzim asetilkolinesterase adalah seperti terlihat pada Tabel 1. dibawah ini:
Tabel 1. Rerata Aktifitas Enzim Asetilkolinesterase (AChE) Rerata Aktifitas Enzim
Gambar 6. Grafik Histogram Aktifitas Enzim Asetilkolinesterase 0 Minggu Dan Setelah 2 Minggu Serta 4 Minggu Penyimpanan
dari grafik diatas dapat diketahui bahwa aktifitas enzim asetilkolinesterase sebelum penyimpanan (0 minggu) dan setelah dilakukan penyimpanan selama 2 minggu dan 4 minggu pada suhu –200C dan 4-60C tidak terdapat perbedaan bermakna (p>0,05), sedangkan penyimpanan pada suhu 25–300C terdapat perbedaan bermakna (p<0,05). Lama penyimpanan (0, 2 dan 4 minggu) pada suhu –200C dan 4-60C dari hasil uji statistik yang dilakukan untuk pengukuran aktifitas enzim asetilkolinesterase tidak terdapat perbedaan bermakna (p>0,05). Hal ini dapat dilihat pada Gambar 7 dan 8 grafik histogram dibawah ini:
Gambar 7. Grafik Histogram Aktifitas Enzim Asetilkolinesterase Sebelum Perlakuan (0 Minggu) dan Setelah Perlakuan Disimpan Pada Suhu –200C Selama 2 Minggu Dan 4 Minggu
Gambar 8. Grafik Histogram Aktifitas Enzim Asetilkolinesterase Sebelum
Perlakuan (0 Minggu) dan Setelah Perlakuan Disimpan Pada Suhu 4-60C Selama 2 Minggu Dan 4 Minggu
Sedangkan penyimpanan (0, 2 dan 4 minggu) pada suhu 25–300C dari hasil uji statistik yang dilakukan untuk pengukuran aktifitas enzim asetilkolinesterase terdapat perbedaan bermakna (p<0,05) namun untuk lama penyimpanan setelah 2 dan
4 minggu tidak terdapat perbedaan bermakna (p>0,05). Hal ini dapat dilihat pada Gambar 9 grafik histogram dibawah ini:
Gambar 9. Grafik Histogram Aktifitas Enzim Asetilkolinesterase Sebelum
Perlakuan (0 Minggu) dan Setelah Perlakuan Disimpan Pada Suhu 25–300C Selama 2 Minggu Dan 4 Minggu
Gambar 10. Grafik Histogram Aktifitas Enzim Asetilkolinesterase Yang Disimpan Pada Suhu –200C dan 4-60C setelah 2 Minggu
Gambar 11. Grafik Histogram Aktifitas Enzim Asetilkolinesterase Yang Disimpan Pada Suhu -200C dan Suhu 4-60C setelah 4 Minggu
Sedangkan aktifitas enzim asetilkolinesterase jika disimpan pada suhu 4-60C dan 25–300C setelah 2 minggu dan 4 minggu terdapat perbedaan bermakna (p<0,05). Hal ini dapat dilihat pada Gambar 12 dan 13 grafik histogram dibawah ini:
Gambar 12. Grafik Histogram Aktifitas Enzim Asetilkolinesterase Yang Disimpan Pada Suhu 4-60C dan Suhu 25–300C setelah 2 Minggu
4.2. Pembahasan
Pada gambar 6. dapat dilihat aktifitas enzim asetilkolinesterase berbeda bermakna dari saat pengukuran sesaat setelah pengambilan sampel dan setelah disimpan pada suhu 25–300C selama 2 minggu dan 4 minggu. Hal ini sesuai dengan penelitian Ono, et all (1981) dan Heins, et all (1995) bahwa sampel enzim asetilkolinesterase tetap stabil jika disimpan pada suhu ruang selama 2 sampai 3 hari. Tetapi jika disimpan pada suhu 40C-60C dan suhu –200C aktifitas enzim asetilkolinesterase tidak berbeda bermakna karena sampel enzim asetilkolinesterase dapat bertahan selama lebih dari 1 bulan. (Fernando, 2002)
Lama penyimpanan tidak memberikan pengaruh pada aktifitas enzim asetilkolineserase jika disimpan pada suhu yang sama, ini dapat dilihat dari gambar 7,8 dan 9.
sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Plumlee, et.al (1994), pada sampel darah yang berkaitan dengan waktu dan suhu penyimpanan. Hasil penelitiannya didapatkan sampel darah yang disimpan 1 minggu masih dapat digunakan untuk mengukur aktifitas asetilkolinesterase (AChE) jika disimpan pada suhu 50C.
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan
Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa :
1. Suhu penyimpanan sampel plasma darah dapat mempengaruhi aktifitas dan kestabilan enzim asetilkolinesterase dari darah manusia.
2. Penyimpanan plasma darah pada suhu –200C dan 40C-60C tidak mempengaruhi kestabilan enzim asetilkolinesterase selama rentang waktu 4 minggu dan sampel yang disimpan pada temperatur tersebut masih dapat digunakan.
3. Plasma darah yang disimpan pada suhu ruang tidak dapat dipergunakan untuk mengetahui aktifitas enzim asetilkolinesterase setelah disimpan selama 2 minggu dan lebih (4 minggu).
5.2. Saran
1. Untuk pekerjaan dilaboratorium perlu diperhatikan suhu penyimpanan sampel jika sampel yang akan dianalisa tidak langsung dikerjakan, misalnya jika sampel diperiksa secara kolektif.
DAFTAR PUSTAKA
Chibata, I., Tosa, T., Sato, T.and Mori, T., 1978, Immobilized Enzymes, Kodansha LTD, Japan, 134-37.
Devlin, T.M., 2000, Textbook of Biochemistry 3 rd Ed, A. John Wiley and Sons, Inc. Publication, New York.
Epstein, H.M., Jarzemsky, D., Zuckerman, L., and Vagher, P., 1980, Plasma Cholinesterase Activity In Bank Blood, General Article Anasthesia And Analgesia. Vol. 59: 211-4, International Anasthesia Research Society.
Feld, V., 2006, Effect of Temperature on Cholinesterase Storage, ASA review, Applied Science And Analysis, Inc., St. Petersburg, Russia.
Fernando, T., Candido, G.P.; Silvia, M.S.; Jse, C; (2002). A Effect of different variables on whole blood cholinesterase analysis in dogs, Journal of veterinary diagnostic investigation. Vol. 14.: 132-39.
Fleiss, J. L., 1986, The Design and Analysis of Clinical Experiments, Division of biostatistics school of public health Colombia University, John Wiley and Sons, Inc. USA, 369.
Ganong, W.F., 1995, Review of Medical Phsyciology 17 th ad, Jack and De Loris Lange Professor of Phsyciology Emeritus University of California, 93-4. Giles, K., 2006, Cholinesterase, Joel Sussman Group Page, Available from :
Kurt@sgjs6.weizmann.ac.il.
Google Images, 2006, Available from : http//www.chemistryemory-edu-Justice Seminar.
_____________, 2006, Available from : http//www.Weizmann.ac.-il-home-Joe-papers-Science.
Heins, M.; Heil; Withld, 1995, Storage of Serum or Whole Blood Samples ? Effect of Time and Temperature 22 Serum Analytes; European Journal of Clinical Chemistry And Clinical Biochemistry; 231-38.
Henry, R.J, 1964, Clinical Chemistry Principles and Technics, Hoeber Medical Division Harper and Row Publisher, 494-5.
King, J., and Morgan, H.G., 1970, The Temperature Activity Relationships of Serum Cholinesterases, Departement of Biochemistry, Royal Infirmary, Glasgow, J. Clin. Path, 23 : 730-2.
Marjani, Ph.D, (2007). Effect of Storage Time and Temperature on some serum, analytis, The Internet Jurnal of Laboratory Medicine, vol. 2.: 1-14.
Ono, T. Kitaguchi, K. Takehara, M. Shiiba, M. And Hayami, K. 1981, Serum-Constituen Analyses : Effect of Duration and Temperature of Storage of Clotted Blood.
Mc. Kee and Mc. Kee, 2003, Biochemistry : the molecular basis of life, 3rd ed, University of the science in Philadelphia, Mc.Graw Hill, : 165-171, 517-20. Plumlee, K.H., Richardson, E.R., Gardner, I.A. and Galey, F.D., 1994, Effect of Time
and Storage Temperatur on Cholinesterase Activity and Blood From Normal and Organophosphorus Insectiside-Treated Horses, Vol 6, issue 2 : 247-9, Journal of veterinary diagnostic investigation.
Voet, D. and Voet, J.G., 2004, Biochemistry 3rd ed, John Wiley and Sons, Inc.: 758-9.
Lampiran 1.
1. DATA PENELITIAN
A. Data Aktifitas Enzim Asetilkolinesterase (U/I).
Sampel
Sampel Nilai Total Protein
Lampiran 2.
ANOVA
Post Hoc Tests
perlakuan (J) suhu perlakuan Lower Bound Upper Bound
post 2 kulkas 383.90 203.615 .497 -236.23 1004.03
preperlakuan -383.90 203.615 .497 -1004.03 236.23
post 2 freezer -50.00 203.615 1.000 -670.13 570.13
preperlakuan -333.90 203.615 .657 -954.03 286.23
post 2 kulkas 50.00 203.615 1.000 -570.13 670.13
preperlakuan -3152.20 203.615 .000 -3772.33 -2532.07
post 2 kulkas -2768.30 203.615 .000 -3388.43 -2148.17
preperlakuan -3368.70 203.615 .000 -3988.83 -2748.57
post 2 kulkas -2984.80 203.615 .000 -3604.93 -2364.67
