ABSTRACT
THE IMMOBILIZATION OF -AMYLASE ENZYME FROMBacillus subtilisITBCCB148 USING CM-Sephadex C-50
BY Feraliana
-amylase is an enzyme that breaks -1,4 glycoside bond in amylum. It has been widely used in a number of industrial processes such as food industry and non food industry. In industrial process, this enzyme must be able to work in an extreme pH and temperature. However, an enzyme is not normally stable in these conditions.
The aim of this research is to increase the stability of -amylase obtained from
Bacillus subtilisITBCCB148 with immobilization method using CM-Sephadex C-50. To achieve this aim, the steps done in this research were production, isolation, and purification of the enzyme which includes fractionation with ammonium sulphate, dialysis and chromatography with CM-cellulose. The pure enzyme was then immobilized using CM-Sephadex C-50. The activity of -amylase was determined by Fuwa and Mandels methods, while the protein concentration was determined by Lowry method.
The result showed that the specific activity of pure enzyme was 21.400 U/mg, an increase of 15 times compared to the enzyme raw extract with a recovery of 11%. The optimum temperature for pure enzyme was 60oC, KM value of 6.32 mg mL-1 substrate and Vmax value of 138.89 mol mL-1 min.-1. The thermal stability test at 60°C for 60 minutes showed the residual activity of 23%, t1/2 = 33.64 minutes, ki = 0.0206 min.-1
i = 103.97 kJ mol-1. The immobilized enzyme has optimum temperature of 70oC, KM value of 6.90 mg mL-1 substrate and Vmax. value of 90.09 mol mL-1 min.-1. The thermal stability test of immobilized enzyme at 60°C for 60 minutes showed the residual activity was 51%, ki = 0.0136 min.-1, t1/2 = 50.96 minutes i= 105.12 kJ mol-1.
Compared to the pure enzyme, the thermal stability of the immobilized enzyme was increased 1.51 times. The decrease of KM value, the increase of Vmax value, the decrease of ki, the increase of t1/2 and ishowed that the immobilization process has increased the rigidity of the enzyme, as a result the enzyme was more stable against pH and temperature.
ABSTRAK
AMOBILISASI ENZIM -AMILASE DARIBacillus
subtilisITBCCB148 DENGAN MENGGUNAKAN CM-Sephadex C-50 Oleh
Feraliana
- -1,4 glikosida
pada amilum. Enzim ini banyak dimanfaatkan dalam proses-proses industri baik yang berhubungan dengan pangan maupun non-pangan. Dalam proses industri, enzim ini harus mampu bekerja pada pH ekstrim dan mempunyai stabilitas termal yang tinggi. Namun, umumnya enzim tidak stabil pada kondisi tersebut.
-amilase dari
Bacillus subtilis ITBCCB148 dengan cara amobilisasi menggunakan CM-Sephadex C-50. Untuk mencapai tujuan tersebut, dilakukan produksi, isolasi, dan pemurnian enzim meliputi : fraksinasi dengan amonium sulfat, dialisis, dan kromatografi kolom penukar kation CM-selulosa. Enzim hasil pemurnian kemudian diamobilisasi dengan menggunakan CM-Sephadex C-50. Penentuan aktivitas -amilase dilakukan dengan metode Fuwa dan metode Mandels, sedangkan penentuan kadar protein dilakukan dengan metodeLowry.
Hasil penelitian menunjukkan enzim hasil pemurnian memiliki aktivitas spesifik sebesar 21.400 U/mg, meningkat kemurniannya 15 kali dibandingkan ekstrak kasar enzim dengan perolehan 11%. Enzim ini memiliki suhu optimum 60°C, harga KM = 6,32 mg mL-1 substrat dan harga Vmaks= 138,89 mol mL-1 menit-1. Uji stabilitas termal pada suhu 60°C selama 60 menit masih memiliki aktivitas sisa 23%, t1/2 = 33,64 menit, ki = 0,0206 menit-1 i= 103,97 kJ mol-1. Amobilisasi enzim hasil pemurnian dengan menggunakan CM-Sephadex C-50 menghasilkan enzim hasil amobilisasi dengan suhu optimum yaitu 70°C dengan nilai KM yaitu 6,90 mg mL-1 dan Vmaks yaitu 90,09 mol mL-1 menit -1. Uji stabilitas termal enzim sesudah amobilisasi pada suhu 60°C selama 60 menit masih memiliki aktivitas sisa sebesar 51%, ki = 0,0136 menit-1, t1/2 = 50,96 menit,
i= 105,12 kJ mol-1.
Hasil amobilisasi menunjukkan peningkatan stabilitas termal enzim hingga 1,51 kali dibandingkan enzim hasil pemurnian sebelum amobilisasi. Data yang diperoleh menunjukkan penurunan nilai KM dan kenaikan nilai Vmaks, penurunan nilai ki, peningka iyang menunjukkan bahwa amobilisasi meningkatkan rigiditas enzim sehingga lebih stabil terhadap pH dan suhu.
V. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa : -amilase hasil pemurnian hingga tahap
kromatografi kolom menggunakan CM-selulosa adalah 21.400 U/mg, kemurniannya meningkat sebesar 15 kali dibandingkan dengan ekstrak kasar enzim dengan perolehan 11%.
2. Enzim -amilase hasil pemurnian memiliki suhu optimum 60oC, nilai KM= 6,32 mg mL-1 substrat, nilai Vmaks = mL-1menit-1, dan uji stabilitas enzim hasil pemurnian pada suhu 60oC selama 60 menit masih memiliki aktivitas sisa = 23%.
3. Enzim hasil amobilisasi mengalami pergeseran suhu optimum menjadi 70oC, nilai KM = 6,90 mg mL-1 substrat, nilai Vmaks = 90,09 mL-1 menit-1, enzim hasil amobilisasi dapat digunakan hingga 3 kali pengulangan, dan uji stabilitas enzim hasil amobilisasi pada suhu 60oC selama 60 menit masih memiliki aktivitas sisa = 51%.
4. Uji stabilitas enzim hasil pemurnian pada suhu 60oC memiliki t½ = 33,64 menit, ki= 0,0206 menit-1
i= 103,97 kJ mol-1-.
5. Uji stabilitas enzim hasil amobilisasi pada suhu 60oC memiliki t½= 50,96 menit, ki= 0,0136 menit-1 i= 105,12 kJ mol-1-. Stabilitas termal enzim hasil amobilisasi meningkat hingga 1,51 kali dibandingkan dengan enzim hasil pemurnian. Penurunan nilai ki, peningkatan waktu paruh (t½),
menunjukkan bahwa enizm hasil amobilisasi lebih stabil dibandingkan dengan enzim hasil pemurnian.
B. Saran
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Enzim adalah katalis yang memiliki keunggulan sifat dapat membantu proses-proses kimia kompleks pada kondisi percobaan yang lunak dan lebih ramah lingkungan (Mateo, 2007). Kelebihan enzim sebagai katalisator antara lain enzim memiliki spesifitas tinggi, mempercepat reaksi kimiawi spesifik tanpa pembentukan senyawa samping, produktivitas tinggi, dan umumnya produk akhir yang terbentuk tidak terkontaminasi sehingga mengurangi biaya purifikasi (Chaplin dan Bucke, 1990). Salah satu enzim yang sering digunakan dalam -amilase. Enzim -amilase adalah enzim yang dapat mengkatalisis penguraian pati menjadi glukosa, maltosa, dan oligosakarida. Pada industri pangan enzim -amilase digunakan dalam memproduksi sirup gula cair, sari buah, dan selai sedangkan pada industri non pangan banyak dipakai pada industri tekstil (Richana, 2000).
-amilase dapat diperoleh dari berbagai sumber, salah satunya dari
2
-amilase dapat digunakan dalam industri jika memiliki kestabilan termal yang tinggi dan rentang pH yang lebar sehingga diperlukan metode yang tepat untuk mendapatkan enzim dengan kestabilan yang tinggi (Soemitro, 2005). Salah satu cara yang dapat digunakan untuk mendapatkan enzim yang stabil adalah dengan teknik amobilisasi. Chibata (1978) menjelaskan bahwa metode amobilisasi enzim ada tiga macam yaitu : (1) Metode penjebakan, (2) Metode pengikatan (adsorbsi) pada bahan pendukung, dan (3) Metode ikatan silang.
Amobilisasi enzim dengan metode pengikatan (adsorpsi) dapat dilakukan dengan berbagai cara yaitu dengan adsopsi fisik, ikatan ionik, dan ikatan kovalen. Amobilisasi enzim dengan metode pengikatan (adsorbsi) dengan cara ikatan ion dapat dilakukan dengan berbagai bahan pendukung, salah satunya dengan CM-Sephadex C-50 (karboksi metil Sephadex C-50). Diantara yang telah menggunakan metode pengikatan (adsorbsi) dengan cara ikatan ion sebagai pengamobil yaitu Devi Susanti (2010), dengan menggunakan CM-selulosa (karboksi metil selulosa). Hal ini mengindikasikan bahwa CM-Sephadex C-50 (karboksi metil Sephadex C-50) sangat berpeluang sebagai adsorben pengamobil enzim -amilase yang dihasilkan olehBacillus subtilisITBCCB148.
B. Tujuan Penelitian
3
1. Memproduksi, mengisolasi dan memurnikan enzim -amilase dari
Bacillus subtilis ITBCCB148 hingga tahap kromatografi kolom menggunakan CM-selulosa.
2. Menentukan karakteristik enzim yang meliputi suhu optimum, stabilitas termal, dan nilai KMdan VMaksenzim hasil pemurnian.
3. Menentukan karakteristik enzim yang meliputi suhu optimum, stabilitas termal, nilai KM dan VMaks, serta pemakaian berulang enzim hasil hasil amobilisasi.
4. Menentukan konstanta laju inaktivasi termal (ki), waktu paruh (t½), dan i) enzim hasil pemurnian.
5. Menentukan konstanta laju inaktivasi termal (ki), waktu paruh (t½), dan perubahan energ i) enzim hasil amobilisasi.
