ABSTRAK
PENINGKATAN STABILITAS ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148 DENGAN MODIFIKASI KIMIA MENGGUNAKAN
ASAM GLIOKSILAT
Oleh
Rina Rachmawati Sutisna
Penelitian ini bertujuan untuk meningkatkan stabilitas enzim selulase dari isolat
bakteri lokal Bacillus subtilis ITBCCB148 dengan modifikasi menggunakan asam
glioksilat. Untuk mencapai tujuan tersebut, dilakukan produksi, isolasi, pemurnian, modifikasi glioksilat dan karakterisasi enzim selulase hasil pemurnian sebelum dan sesudah modifikasi. Hasil penelitian menunjukan enzim hasil pemurnian memiliki aktivitas unit 6,9753 U/mL, lebih murni dibandingkan dengan ekstrak kasar enzim yang mempunyai aktivitas unit 0,5963 U/mL. Enzim hasil pemurnian dan hasil modifikasi mempunyai pH optimum yang sama yaitu
6,0 dan suhu optimum yang sama yaitu 60oC. Enzim hasil modifikasi asam
glioksilat memiliki derajat modifikasi 70,54; 78,68; 68,43%. Stabilias termal enzim hasil modifikasi dengan derajat modifikasi 70,54; 78,68; 68,43%
berturut-turut: t1/2 = 22,35 menit, ki = 0,031 menit-1, ΔGi = 102,8253 kJ mol-1; t1/2 = 21,00
menit, ki = 0,033 menit-1, ΔGi = 102,6522 kJ mol-1; : t1/2 = 18,72 menit, ki = 0,037
menit-1, ΔGi = 102,3354 kJ mol-1, dan data stabilitas termal enzim hasil
pemurnian: t1/2 = 10,50 menit, ki = 0,066 menit-1, ΔGi = 100,7330 kJ mol-1.
Modifikasi kimia terhadap enzim selulase dapat meningkatkan kestabilan enzim terhadap pH dan suhu serta meningkatkan stabilitas termal enzim.
Kata kunci : Bacillus subtilis ITBCCB148, selulase, modifikasi kimia, asam
Judul Skripsi
Nama Mahasiswa
Niiiitbi' PbkokiMahasis:ma i".:t
..t. :.1 .:'
i:. :.. r . r:: ;.
iJrfr,q$mi; 1'..,' i
: i;i ;:i i "i :,:,,:; : i.:;,,1;,,, i,
-..',,'.-.t-t ';'''.: ':1 '
Fakultas
' :::r!
:
PENINGKATAN STABILITAS INZIM SELUTASE DARI SOTiIIIT S SUbIiIiSITBCCBI48 DENGAN MODIFIKASI KIMIA MENGGT]NAKAN ASAMGLIOKSILAT
101?011069
1,|i,it :i./,;, ;;.,1..i.;.\ii,Ni::..;":.a:::i.'i,.;:
:
..., .i , ' I -'.'.',....,.. ,..r. ,... . t.
Ki1glg1,;rin:,;;1";\.t;, i ,:..,i,.;;.:,,!..:ii,i-;;:i..:i",i.t,,!i...:l::.:,:,,,,.;:,.,::.:l
--. '-'-.. , ,''t,'t.-.-:r- -- ..'.i Matematih dan ihnti Fengetahuan Alam
MENYETUJUI
Komisi Pembimbing
Ketua Jurusan Kimia
Dr. Eng. Suripto DwiYuwono,lt/I.T-
f
>
NIP 19740705 200003
I
001
LProf. Dr.
Ir
Yandri A.S., M.S.NIP
19560905 199203 1001.,ji i.lr.t: i.,:'l;"ir''r it{
; !,,.r:
:ii i:. .: i. ;ni"ii:"-ii'li 7 i l,r.'it 1l -1,,;, :5. ; , .:,;,,1,1, ]
;11 ;..".1:'.
r,.;:,.:.jri' ...ii';.' liiJit.,,.r;,:.1.:f
r;i1:.! 1 ,,,.1,i:,r.]
1. Tim Penguji
Ketua
MENGESAHKAN
:
Prof. Dr.Ir. YandriA.S.' M.S.-"'{'' "' ' j'' "''
,
r,,. i1. ;;: :': t 1?; ;; t;",:1 i ) it ; ; l,: ;1 y.; y;:;
tA
rr: I.,,' .,
', ..t,"
'
{t,
t t'
,.:::':':'t'.'::tl--':-::':-,'
tr"
.,.4.-' ...a.4...aa.t...a.4.4e ...
Sekretaris
:
Dra. Aspita Laila, M.S.Penguji
Bukan Pembimbing
:
Heri Satria, M.Si.Fakultas Matematika dan Ilmu PengetahuanAlam
T,
t
I
Tanggal Lulus Ujian Skripsi
:
20 Agustus 2014;
; : ;#:X
ttll:
;
ru
;r;
;;fi
;Iffi
Iil
m;;;x
ffi
;il;
:::-il;a;
j:ffiH;l
=
:=;
ffi
:r;
IjmH
;Iilffi
;;ll
l;ffiffiI
xx
H
i;;:;Yi;
ffi
;;H
l::ffi
;Ix
;:tHI|
I;
ffi:
ffi::H
;:fn:
Xlffil:ll;
;;ffi;:I;
;;;H::ffi
;ll;fi|
;Jr;ffi
::lill
Jt{,; l-i 14' i..t;i1..$
J ;rE ;r: i_ _sri,*4r#]l,
rc 1;1$1 ti i,',rl: \. iq!;tir i i {''l G #rr;; i,..g it s i f ,*iI i-i"'"t*ip r-t
;,:,1Jr: i ;l'vi1.,::. rl.,tlr l,{l,.it :-.1",f
,S I f
il*
t"'^'&lii'l ii: "'-i l"'i t,; #i''Jii'ri::'iq $ i l?:*l. irrir$: l j {ri'i ;\:,, i. ;)+\,'ii
r'1 ; rr 1'} i',!j
i iri: .-i$, l,*. :1 i . j,,i.i::i\ i
#*
i;,*.ii t[: i+ ::; {{;,ifii..,
.:,i,i.,, 1, ,.,:.+.1]::i-ii'i'ii .ir,riir-i:j;irilr,;,; i ,r,i",ii.;i,^]
,t:: ii.* i.1,i'.li'i;i;i"; i r,tiiir;:i.;.:,:j j,,-.; 1 6iilrt]
i.p15l-l i.,.i; t..i:\iniili..iFi# iJfflv?i;llif i;ql* i-i,"irtlli.]
,irl i:.rrri l, u,'*1"";i''t1
"
'jl'aiir?.i:ir:li i.r.l::; i ,i.i.,1i'Li
lilVXl-,.,*lif* 1.,;:qigi+lf ir'i{-i 'il'\ilr'"''$rt{iil,,:,g 1^5s;tl:'l
1
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Enzim merupakan biokatalisator yang mampu mempercepat reaksi biokimia yang
terjadi di dalam sel maupun di luar sel (Poedjiadi and Supriyatin, 2006). Fungsi
enzim dalam mempercepat reaksi memberikan keuntungan bagi industri karena
menghemat waktu dan biaya (Page, 1997). Salah satu enzim yang memiliki
peranan penting adalah enzim selulase (Gunam et al., 2004).
Enzim selulase mengkatalisis hidrolisis ikatan β-1,4-glikosidik pada molekul
selulosa sehingga menghasilkan glukosa (Afsahi et al., 2007). Enzim ini
umumnya digunakan dalam berbagai industri seperti teknologi pangan, tekstil,
pakan ternak, kertas, pertanian, dan dalam pengembangan penelitian. (Kovács,
2009).
Penggunaan enzim dalam industri harus memenuhi beberapa kriteria khusus,
antara lain memiliki kestabilan pada kondisi suhu yang tinggi dan pH yang
ekstrim (Goddette et al., 1993). Untuk mendapatkan enzim yang mempunyai
kestabilan dan aktivitas yang tinggi, maka dapat dilakukan isolasi langsung dari
organisme yang terdapat di alam dan hidup pada kondisi tersebut (ekstrimofilik)
2
yang hidup pada kondisi tidak ekstrim (mesofilik) (Wagen, 1984). Cara lain yang
dapat dilakukan yaitu amobilisasi, mutagenesis terarah dan modifikasi kimia
(Mozhaev and Martinek, 1984). Modifikasi kimia merupakan suatu cara yang
sederhana dan efektif untuk meningkatkan stabilitas enzim yang larut dalam air
(Janecek, 1993). Modifikasi kimia dapat menekan terjadinya penurunan aktivitas
enzim, karena interaksi antara enzim dengan substrat tidak terhalang oleh matriks
yang tidak larut seperti metode amobilisasi (Nubarov et al., 1987) dan tidak
memerlukan informasi mengenai struktur primer dan struktur tiga dimensi pada
metode mutagenesis terarah (Mozhaev and Martinek, 1984).
Pada penelitian sebelumnya telah dilakukan modifikasi kimia enzim selulase dan
α-amilase menggunakan beberapa senyawa kimia. Modifikasi kimia enzim
selulase yang telah dilakukan menggunakan senyawa kimia sitrakonat anhidrida
(Iftiqoriyyah, 2014) dan sianurat klorida polietilenglikol (CC-PEG) (Fitriyanti,
2014) terbukti dapat meningkatkan stabilitas enzim terhadap pH dan suhu serta
meningkatkan stabilitas termal enzim. Sedangkan modifikasi kimia enzim
α-amilase yang telah dilakukan menggunakan senyawa kimia asam glioksilat
menunjukkan adanya peningkatan stabilitas termal enzim modifikasi sebanyak
1,2-1,4 kali dibandingkan enzim hasil pemurnian (Anggraini, 2011). Oleh karena
itu, dilakukan penelitian mengenai modifikasi kimia enzim selulase yang diisolasi
dari Bacillus subtilis ITBCCB148 menggunakan senyawa asam glioksilat dan
3
B. Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah :
1. Mengisolasi ekstrak kasar enzim selulase dari Bacillus subtilis
ITBCCB148 pada kondisi optimum sehingga diperoleh enzim yang
memiliki aktivitas unit terbaik.
2. Memurnikan ekstrak kasar enzim selulase dengan metode fraksinasi
menggunakan garam amonium sulfat dan metode dialisis sehingga
diperoleh enzim selulase dengan tingkat kemurnian terbaik.
3. Meningkatkan stabilitas enzim selulase dari Bacillus subtilis ITBCCB148
melalui modifikasi kimia dengan asam glioksilat.
4. Melakukan karakterisasi enzim selulase hasil pemurnian dan hasil
modifikasi meliputi penentuan pH dan suhu optimum, penentuan nilai KM
dan Vmaks, penentuan nilai ki, t1/2dan ∆Gi sehingga diperoleh informasi
mengenai pengaruh modifikasi dan variasi konsentrasi asam glioksilat.
C. Manfaat Penelitian
Manfaat yang dapat diambil dari penelitian ini adalah :
1. Memberikan informasi tentang cara meningkatkan stabilitas enzim dengan
modifikasi kimia dan pengaruh modifikasi kimia terhadap stabilitas enzim
selulase dari Bacillus subtilis ITBCCB148.
2. Enzim selulase dengan kestabilan yang tinggi dapat digunakan dalam
57
DAFTAR PUSTAKA
Afsahi, B., Kazemi, A., Kheirolomoom, A., Nejati, S. 2007. Immobilization of
Cellulase on Non-Porous Ultra Fine Silica Particels. Scientia Irania. 14
(4): 379-383.
Agustien. A. and Munir. E. 1997. Purifikasi penisilin asilase dari Bacillus.
Prosiding Seminar Wawasan Keilmuan Untuk Meningkatkan Kualitas
Pembangunan Bangsa Indonesia. Malaysia. PPI Universitas Sains
Malaysia. 270-177.
Ahern, T.J. and A.M. Klibanov. 1987. Why do enzyme irreversibly inactive at
high temperature. Biotec 1. Microbial Genetic Engineering and Enzyme
Technology. Gustav Fischer. Stuttgart. New York.
Anggraini, N. 2011. Peningkatan Kestabilitas Enzim α-amilase dari Bacillus
subtilis ITBCCB148 Dengan Modifikasi Kimia Menggunakan Asam Glioksilat. (Skripsi). Universitas Lampung. Bandar Lampung.
Boyer, R.F. 2000. Modern Experimental Biochemistry. Benjamin Cumming
Publising Company. San Francisco, California.
Duff, S.J.B and Murray, W.D. 1996. Bioconvertion of forest products industry
waste cellulosics to fuel ethanol: a review. Bioresource Technology. 55:
1-33.
Eijnsink, G.H., Sirgit, G. Torben, V. Bertus van de Burg. 2005. Directed
Evolution of Enzyme Stability. Biomolecular Engineering. 23: 21-30.
Fan, L.T., Y.H. Lee, M.M. Gharpuray. 1982. The nature of lignocellulosics and
their pretreatment for enzymztic hydrolysis. Advances in Biochemical
Engineering. 23: 158-187.
Fessenden, R.J. and J.S. Fessenden. 1994. Kimia Organik. Jilid 2. Edisi 3. Alih
58
Fitriyanti. 2014 . Peningkatan Kestabilitas Enzim selulase dari Bacillus subtilis ITBCCB148 Dengan Modifikasi Kimia Menggunakan Sianurat Klorida Polietilenglikol (CC-PEG). (Skripsi). Universitas Lampung. Bandar Lampung.
Francis, G. E., C. Delgado, and D. Fisher. 1992. PEG Modified Protein. In :
Ahern, T.J , Manning MC, editors. Stability of Protein Pharmaceutical
Part B,. New York, NY: Plenum Press; 1992. 235-263.
Goddete, D.W., C. Terri, F.L. Beth, L. Maria, R.M. Jonathan, P. Christian, B.R. Robert, S.Y. Shiow, and C.R. Wilson. 1993. Strategy and implementation
of a system for protein engineering. Journal of Bioechnology. 28: 41-54.
Gunam, I.B.W, Hardiman, T. Utami. 2004. Chemical Pretreatments on Bagasse
to Enhance Hydrolysis of Its Cellulose Enzymatically. The 3th Hokkaido
Indonesian Student Association Scientific meeting (HISAS 3). Sapporo.
Gupte, S. 2001. Mikrobiologi Dasar. Alih bahasa oleh Dr. Julius E. S.
Binarupa Aksara. Jakarta.
Grisham, Charles M.; and Reginald H. Garrett. 1999. Biochemistry. Saunders
College Pub. Philadelphia.
Iftiqoriyyah, F. 2014 . Peningkatan Kestabilitas Enzim selulase dari Aspergillus niger L-51 Dengan Modifikasi Kimia Menggunakan Sitrakonat Anhidrida. (Skripsi). Universitas Lampung. Bandar Lampung.
Ikram, Ul-haq, Muhammad Mohsin Javed, Tehmina Saleem Khan and Zafar Siddiq. 2005. Cotton Saccharifying Activity of Cellulases Produced by
Co-culture of Aspergillus niger and Trichoderma viride. Research
Journal of Agriculture and Biological Sciences. 1(3): 241-245.
Illanes, A. 1999. Stability of biocatalysts. Electronic Journal of Biotechnology.
2(1): 1-2.
Janecek, S. 1993. Strategies for Obtaining Stable Enzymes. Process
Biochemistry. 2: 435-445.
Junita. 2002. Mempelajari Stabilitas Termal Enzim Protease dari Bacillus stearothermophillus Dalam Pelarut Heksana, Toluena, dan Benzena. (Skripsi). Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Kamelia, R., Muliawati S. and Dessy N. 2005. Isolasi dan Karakterisasi Protease
Intraseluler Termostabil dari Bakteri Bacillus stearothermophilus RP1.
Seminar Nasional MIPA. Departemen Kimia, Institut Pertanian Bogor.
59
Kazan, D., H. Ertan and A. Erarslan. 1997. Stabilization of Escherichia coli
Penicillin G Acylase agains thermal Inactivation by cross-linking with
dextran dialdehyde polymers. Applied Microbiology and Biotechnology.
48: 191-197.
Koolman, J. 2001. Atlas Berwarna dan Teks Biokimia. Penerbit Hipokrates.
Jakarta.
Kovács, K. 2009. Production of Cellulolytic Enzymes with Trichoderma
Atroviride Mutans for The Biomass-To-Bioethanol Process.(Tesis).
Lay, B. W. dan Sugyo,H. 1992. Mikrobiologi. Rajawali Pers. Jakarta. 107-112.
Lee, S.M., and Koo, Y.M. 2001. Pilot scale production of cellulose using
Trichoderma reesei Rut C-30 in fed-batch mode. Journal of Microbiology
and. Biotechnology. 11: 229-233.
Lehninger, A.L. 2005. Dasar-Dasar Biokimia. Erlangga. Jakarta.
Lowry, O. H., N. J., Rosebrough, A. L., Farr and R. J. Randall. 1951. Protein
measurement with the folin phenol reagent. Journal of Biology and
Chemistry. 193-265.
Mandels, M., A. Raymond, R. Charles. 1976. Measurement of saccharifying
cellulose. Biotechnology and Bioengineering. John Wiley & Sons Inc.
Martoharsono and Soeharsono. 2006. Biokimia Jilid I. UGM Press. Yogyakarta.
Mozhaev, V.V. and K. Martinek. 1984. Structur-Stability Relationship in
Protein: New Approaches to Stabilizing Enzymes. Enzyme and Microbial
Technology. 50-59.
Mozhaev, V.V., N.S. Melik-Nubarov, V.A. Siksnis and K. Martinek. 1990. Strategy for Stabilizing Enzymes. Part Two: Increasing Enzyme Stability
by Selective Chemical Modication. Biocatalysts. 173: 189-196.
Nubarov, N.S., V.V. Mozheav, V.A. Siksnis and K. Martinek. 1987. Enzyme
Stabilization of α-Chymotrypsin by Reductive Alkylation with Glyoxylic
Acid. Biotechnology Letters. 9: 725-730.
Page, D.S. 1997. Prinsip-Prinsip Biokimia. Erlangga. Jakarta.
Pelczar, M.J. and E. C. S. Chan. 2005. Dasar- Dasar Mikrobiologi. UI Press.
Jakarta.
60
Pohl, T. 1990. Concentration of protein removal of salute dalam M.P.
Deutscher, Methods of Enzymology: Guide to Protein Purification.
Academic Press. New York.
Priest, F.G. 1993. Systematics and ecology of Bacillus. In: Sonenshein AL, Hoch
J, Losick R (eds) Bacillus subtilis and other gram positive bacteris,
biochemistry, physiology and molecular genetics. American Society for Microbiology Press. Washington. DC.
Rahayu, K. 1991. Teknologi Enzim. PAU Pangan dan Gizi UGM. Yogyakarta.
Rodwell, V.W. 2011. Harper’s Review of Biochemistry. EGC Kedokteran.
Jakarta.
Sariningsih, R. 2000. Produksi Enzim Protease oleh Bacillus subtilis BAC-4. (Skripsi). Universitas Padjajaran. Bandung.
Schlegel, H.G. and K. Schmidt. 1994. Mikrobiologi Umum. UGM Press.
Yogyakarta.
Scopes, R.K. 1987. Protein Purification. Springer Verlag. New York.
Shahib, N. 2005. Biologi Molekular Medik I. Unpad Press. Bandung.
Snyder, S.L., P.Z. Sobocinski. 1975. An improved 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic
acid method for the determination of amines. Analytical Biochemistry.
64(1): 284-8.
Soemitro, S. 2005. Pengaruh Modifikasi Kimiawi Selektif Terhadap Kestabilan
α-amilase dari Saccharomycopsis fibuligera. Jurnal Bionatura. 7(3):
259-273.
Stahl, S. 1999. Thermophilic microorganisms: The biological background for
thermophily and thermoresistance of enzyme in Thermostability of
Enzymes (Gupta , M.N. editor). Springer Verlag. New Delhi. 59-60.
Suhartono, M.T. 1999. Enzim dan Bioteknologi. Penelitian Antar Universitas
IPB. Bogor.
Virdianingsih, R. 2002. Mempelajari Stabilitas Termal dari Bacillus pumilus y1 dalam pelarut Heksana, Toluena, dan Benzena. (Skripsi). Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Wagen, E.S. 1984. Strategies for increasing the stability of enzymes, in Enzyme
Engineering . The New York Academy of Sciences. New York. 1-19.
Walsh, G. and D.R. Headon. 1994. Protein Biotechnology. John Willey and
61
Winarno, F.G. 2002. Kimia Pangan dan Gizi. PT. Gramedia Pustaka Utama.
Jakarta.
Wirahadikusumah, M. 2001. Biokimia: Protein, Enzim dan Asam Nukleat. ITB
Press. Bandung.
Wiseman, A. 1985. Handbook of Enzymes Biotechnology 2nd Ed. Ellis Harwood
Lim. Chicester.
Yandri, A.S. 2004. Karakterisasi dan Modifikasi Kimia α-amilase dari Bakteri
Isolat Lokal Bacillus subtilis ITBCCB148. (Disertasi). Institut Teknologi
Bandung. Bandung.
Yang, Z., D. Michael, A. Robert, X.Y. Fang and J.R. Alan . 1996. Polyethylene
Glycol-Induced Stabilization of Subtilisin. Enzyme Microbiology and
