POTENSI ANTIDEMENSIA TIGA TANAMAN GENUS
Syzygium MELALUI MEKANISME PENGHAMBATAN
AKTIVITAS ASETILKOLINESTERASE
FARAHDINA ALWI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Potensi Antidemensia Tiga Tanaman Genus Syzygium Melalui Mekanisme Penghambatan Aktivitas Asetilkolinesterase adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2013
ABSTRAK
FARAHDINA ALWI. Potensi Antidemensia Tiga Tanaman Genus Syzygium Melalui Mekanisme Penghambatan Aktivitas Asetilkolinesterase. Dibimbing oleh LATIFAH KOSIM DARUSMAN dan WULAN TRI WAHYUNI.
Potensi antidemensia ekstrak daun juwet, daun cengkih, daun salam, dan kuncup bunga cengkih ditentukan berdasarkan mekanisme inhibisi terhadap aktivitas enzim asetilkolinesterase (AChE). Tujuan penelitian ini adalah menentukan ekstrak yang paling berpotensi sebagai penghambat aktivitas AChE. Setiap sampel diekstraksi dengan metode sonikasi menggunakan pelarut n-heksana, etil asetat, dan metanol. Aktivitas inhibisi diuji menggunakan metode Ellman yang dimodifikasi pada skala mikro dengan menggunakan spektrofotometer microplate reader BioTek pada panjang gelombang 412 nm. Ekstrak metanol daun cengkih, daun salam, dan kuncup cengkih serta ekstrak etil asetat daun salam berpotensi sebagai inhibitor AChE. Nilai konsentrasi hambat 50% (IC50) berturut-turut sebesar 42.13, 47.15,
45.22, dan 45.02 μg/mL, sementara kontrol positif fisostigmin menunjukkan nilai IC50 sebesar 0.01 μg/mL. Pola sidik jari kromatografi lapis tipis ekstrak-ekstrak
tersebut dengan menggunakan diklorometana:etil asetat (1/2:1/2) sebagai fase gerak terbaik dan silika gel GF254 sebagai fase diam menunjukkan berturut-turut 9, 7, 2, dan
5 noda terpisah.
Kata kunci: AChE, demensia, fisostigmin, inhibitor AChE, Syzygium
ABSTRACT
FARAHDINA ALWI. Antidementia Activity of Three Syzygium Plant Based on Inhibition of Acetylcholinesterase Activity Mechanism. Supervised by LATIFAH KOSIM DARUSMAN and WULAN TRI WAHYUNI.
Antidementia activity of the Syzygium cumini, S. aromaticum, and S. polyanthum leaves, as well as S. aromaticum buds extracts were determined based on inhibition of acetylcholinesterase (AChE) activity mechanism. The aim of this study was to determine the most potent AChE inhibitor. Each samples were extracted by using sonication methods with n-hexane, ethyl acetate, and methanol as solvents. The inhibition activity was measured with modified Ellman’s method by using microplate reader spectrophotometer at 412 nm. The methanol extract of S. aromaticum leaves, S. polyanthum leaves, S. aromaticum buds, and the ethyl acetate extract of S. polyanthum leaves were potential as AChE inhibitors. The 50% inhibition concentration (IC50) values were 42.13, 47.15, 45.22, and 45.02
μg/mL, respectively, while the IC50 value of physostigmine was 0.01 μg/mL. Thin
layer chromatography fingerprint pattern of the extracts eluted with dichloromethane:ethyl acetate (1/2:1/2) as the best eluent and silica gel GF254 as
stationary phase show 9, 7, 2, and 5 separated peaks, respectively.
POTENSI ANTIDEMENSIA TIGA TANAMAN GENUS
Syzygium MELALUI MEKANISME PENGHAMBATAN
AKTIVITAS ASETILKOLINESTERASE
FARAHDINA ALWI
Skripsi
sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains
pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Skripsi : Potensi Antidemensia Tiga Tanaman Genus Syzygium Melalui Mekanisme Penghambatan Aktivitas Asetilkolinesterase Nama : Farahdina Alwi
NIM : G44104017
Disetujui oleh
Prof Dr Ir Latifah K Darusman, MS Pembimbing I
Wulan Tri Wahyuni, SSi, MSi Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS Ketua Departemen Kimia
v
PRAKATA
Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul “Potensi Antidemensia Tiga Tanaman Genus Syzygium Melalui Mekanisme Penghambatan Aktivitas Asetilkolinesterase” yang dilaksanakan sejak bulan Mei hingga Desember 2012 di Laboratorium Kimia Analitik, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor serta Laboratorium Uji Pusat Studi Biofarmaka, Institut Pertanian Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof Dr Ir Latifah Kosim Darusman, MS dan Wulan Tri Wahyuni, SSi, MSi selaku pembimbing yang senantiasa memberikan doa, arahan, pengetahuan, motivasi, saran, dan bimbingannya kepada penulis selama melaksanakan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Terima kasih kepada Bagian Kimia Analitik dan Pusat Studi Biofarmaka (PSB) yang telah memberikan kesempatan meneliti dalam hal antidemensia. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada seluruh staf Laboratorium Kimia Analitik maupun Laboratorium Uji PSB (Ibu Nunung, Ibu Nunuk, Ibu Salina, Bapak Eman, Bapak Kosasih, Mas Nio, Mas Endi, Mba Wiwi, dan Mba Kiki) atas bantuan dan masukan yang sangat berarti selama penelitian berlangsung.
Karya ilmiah ini merupakan sebuah wujud penghargaan untuk kedua Orangtua, Kakak-kakakku tercinta, dan seluruh keluarga yang telah memberikan motivasi, doa, serta kasih sayang selama penulis menempuh studi, penelitian, dan menyelesaikan karya ilmiah ini. Terima kasih penulis ucapkan kepada Genny, Dieng, Cahya, Ebta, Esty yang turut membantu memberikan bantuan koreksi, semangat, doa, dan dukungannya dalam penyusunan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada seluruh rekan peneliti di Laboratorium Kimia Analitik dan Pusat Studi Biofarmaka serta teman-teman seperjuanganku di Ekstensi Kimia angkatan 2010 atas bantuan, motivasi, diskusi, dan kebersamaan selama penulis menempuh studi dan menjalankan penelitian. Tak lupa, ungkapan terima kasih penulis sampaikan kepada teman-teman kosan Sagu 5 (mba Rose, mba Rohmah, mba Erni, Nanda, dan mba Menda) atas segala dukungan dan doa yang diberikan.
Penulis berharap, karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, Februari 2013
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vi
DAFTAR GAMBAR vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
PENDAHULUAN 1
TINJAUAN PUSTAKA 2
Asetilkolinesterase (AChE) 2
Demensia 3 Juwet (Syzygium cumini) 3
Cengkih (Syzygium aromaticum) 4 Salam (Syzygium polyanthum) 4
Ekstraksi Sonikasi 5
Analisis Sidik Jari 5
Desain Campuran 6
BAHAN DAN METODE 7
Alat dan Bahan 7
Ruang Lingkup Penelitian 7
Penentuan Kadar Air 7
Ekstraksi Tanaman dengan Metode Sonikasi 8
Uji Inhibisi Enzim Asetilkolinesterase 8
Pemilihan Eluen Terbaik dengan KLT 8
Analisis Sidik Jari Menggunakan KLT 9
HASIL DAN PEMBAHASAN 9
Kadar Air 9
Ekstrak 10 Daya Inhibisi Ekstrak terhadap Asetilkolinesterase 11
Analisis Sidik Jari KLT 13
Fase Gerak Terbaik 13
SIMPULAN DAN SARAN 16
DAFTAR PUSTAKA 17
LAMPIRAN 20
DAFTAR TABEL
1 Komposisi fase gerak menggunakan Simplex Centroid Design (SCD) 9
2 Kadar air simplisia genus Syzygium 10 3 Nilai IC50 pada 6 ekstrak dan kontrol positif 12
4 Jumlah noda pada elusi ekstrak metanol daun cengkih dan ekstrak etil asetat daun salam dengan 6 fase gerak tunggal 13 5 Jumlah pita pada elusi ekstrak metanol daun cengkih, daun salam, dan
kuncup cengkih menggunakan fase gerak campuran 14 6 Jumlah pita pada elusi ekstrak etil asetat daun salam menggunakan fase
gerak campuran 14
7 Jumlah pita dan nilai Rf ekstrak metanol daun cengkih, daun salam, dan kuncup cengkih serta ekstrak etil asetat daun salam menggunakan fase
gerak terbaik 15
DAFTAR GAMBAR
1 Tanaman S. cumini 3
2 Tanaman S. aromaticum 4
3 Daun S. polyanthum 5
4 Titik selektivitas berdasarkan SCD 6
5 Rendemen ekstrak berdasarkan bobot kering sampel. 11
6 Nilai IC50 pada 12 ekstrak kasar. 12
7 Profil KLT elusi ekstrak metanol daun cengkih (a), ekstrak metanol daun salam (b), ekstrak metanol kuncup cengkih (c), dan ekstrak etil asetat daun salam (d) dengan pelarut diklorometana:etil asetat (1/2:1/2) di bawah sinar
UV 366 nm. 16
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian 20
2 Kadar air simplisia daun juwet, daun cengkih, daun salam, dan kuncup
cengkih 21 3 Rendemen hasil ekstraksi daun juwet, daun cengkih, daun salam, dan
kuncup cengkih 22
4 Penentuan nilai IC50 pada ekstrak daun cengkih, daun juwet, daun salam,
dan kuncup cengkih 23
5 Kurva regresi penentuan IC50 ekstrak daun cengkih, daun salam, dan
kuncup cengkih serta fisostigmin 23
6 Pola KLT ekstrak metanol daun cengkih (6 pelarut tunggal) 26 7 Pola KLT ekstrak etil asetat daun salam (6 pelarut tunggal) 26 8 Indeks polaritas fase gerak menurut Snyder dan Kirkland (1979) 26 9 Pola KLT ekstrak metanol (10 komposisi pelarut berdasarkan SCD) 27 10 Pola KLT ekstrak etil asetat daun salam (10 komposisi pelarut berdasarkan
PENDAHULUAN
Penyakit sering lupa (pikun) sering dijumpai pada orang yang sudah lanjut usia. Pikun merupakan gejala awal demensia, berupa penurunan daya ingat secara alami akibat bertambahnya usia. Penderita demensia sulit berpikir dengan baik sehingga mengganggu aktivitas sehari-hari. Oleh sebab itu, mereka lambat laun kehilangan kemampuan untuk menyelesaikan permasalahan dan perlahan menjadi emosional yang sering kali tidak terkendali (Dastmalchi et al. 2007).
Penyakit alzheimer (PA) adalah demensia progresif yang memengaruhi kesadaran, kelakuan, dan status fungsional otak. PA dicirikan dengan gangguan memori dan fungsi kognitif yang secara progresif dapat menyebabkan kematian. Gejala umum PA adalah berkurangnya neurotransmiter asetilkolin (ACh) pada otak, antara lain disebabkan oleh meningkatnya aktivitas asetilkolinesterase (AChE). Asetilkolin yang terlibat dalam pembentukan memori akan dihidrolisis oleh AChE di celah sinaptik menjadi kolin dan asetat (Chisholm-Burns et al. 2008).
Obat yang digunakan sebagai inhibitor AChE telah dirancang untuk menghambat hidrolisis ACh tersebut sehingga kadarnya meningkat pada pasien PA (Chisholm-Burns et al. 2008). Namun, mahalnya biaya pengobatan dan efek samping berbagai obat sintetik telah meningkatkan minat eksplorasi tanaman obat sebagai alternatif inhibitor AChE dalam beberapa tahun terakhir. Efek samping yang ditimbulkan obat dari bahan alam relatif kecil meskipun digunakan dalam waktu lama sehingga dianggap lebih aman.
Penelitian penghambatan aktivitas AChE telah banyak dilakukan pada berbagai tanaman herbal yang berpotensi sebagai obat antidemensia. Beberapa tanaman obat Indonesia yang telah dikenal masyarakat secara luas berkhasiat meningkatkan daya ingat di antaranya ialah daun pegagan, rimpang kunyit, dan jahe (Dastmalchi et al. 2007). Berdasarkan penelitian SatheeshKumar et al. (2010), fraksi etil asetat, fraksi alkaloid total, dan trigonelin dari tanaman Trigonella foenum graecum memiliki daya inhibisi yang kuat terhadap AChE dengan nilai konsentrasi penghambatan 50% (IC50) berturut-turut 53.00 μg/mL,
9.23 μg/mL, dan 233 μM. Ekstrak tanaman Agrimonia pilosa memiliki aktivitas penghambatan AChE karena mengandung senyawa flavonoid glikosida, yaitu kuersitrin dengan nilai IC50 66.9 μM (Jung dan Park 2007). Beberapa tanaman
lainnya yang berpotensi sebagai inhibitor AChE ialah Centella asiatica (Mukherjee et al. 2007b), Acorus calamus (Oh et al. 2004), dan Ginkgo biloba (Das et al. 2002).
Juwet, cengkih, dan salam telah dikenal sebagai obat-obatan herbal alami. Cengkih dan salam dipercaya masyarakat dapat meningkatkan fungsi ketajaman otak dan juga berkhasiat sebagai antioksidan serta antiradang (Kanopa et al. 2012). Tanaman yang memiliki aktivitas antioksidan, antiradang, dan estrogenik berpotensi mengobati penyakit Alzheimer dengan meningkatkan fungsi kognitif (Perry et al. 2003). Ekstrak etanol 96% daun juwet, cengkih, salam, dan jambu air telah diteliti oleh Saputro (2006) sebagai inhibitor AChE. Daya inhibisi yang diperoleh masih relatif rendah (nilai IC50>1000 ppm) sehingga perlu diteliti
2
kuning yang dihasilkan dari reaksi tiokolin dengan ion 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoat (DTNB). Inhibitor AChE akan menghambat reaksi pemecahan asetiltiokolin sehingga jumlah tiokolin yang terbentuk berkurang dan warna kuning yang dihasilkan memudar.
Penelitian ini dilakukan untuk menentukan potensi ekstrak tanaman genus Syzygium sebagai inhibitor AChE. Tanaman yang digunakan meliputi daun juwet, daun dan kuncup cengkih, serta daun salam. Tanaman diekstraksi dengan beberapa pelarut yang memiliki kepolaran berbeda, yaitu n-heksana, etil asetat, dan metanol lalu diuji aktivitas inhibisi setiap ekstrak terhadap enzim AChE. Fisostigmin digunakan sebagai kontrol positif. Profil sidik jari ekstrak yang berpotensi ditentukan dengan kromatografi lapis tipis (KLT).
TINJAUAN PUSTAKA
Asetilkolinesterase (AChE)
Asetilkolinesterase (AChE) adalah salah satu jenis enzim dengan bobot molekul 260.000 dalton, terdapat pada ujung serabut saraf kolinergik dan membran sel darah merah (Schamburg dan Salzmann 1990). Enzim ini menghidrolisis senyawa asetilkolin menjadi asetat dan kolin. Asetilkolin merupakan suatu neurotransmiter yang berfungsi menghantarkan impuls saraf pada otak (Chisholm-Burns et al. 2008).
Demensia
Demensia adalah gejala klinis hilangnya fungsi intelektual dan berkurangnya memori yang mengganggu aktivitas kehidupan sehari-hari, paling sering dialami oleh kaum lansia, khususnya yang berusia di atas 60 tahun. Demensia ditandai dengan proses neurodegeneratif secara progresif (Tjahyanto dan Surilena 2009). Demensia bersifat progresif bertahap, fungsi otak berangsur-angsur menurun disebabkan oleh kerusakan sel-sel otak sehingga sistem saraf tidak dapat lagi membawa informasi dari dan ke otak. Dalam sistem saraf, pesan berpindah dari satu lokasi ke lokasi lain dalam bentuk potensial aksi sepanjang akson. Di sinapsis antara 2 neuron, impuls berpindah dari neuron prasinaps ke pascasinaps (Martini dan Judi 2009).
Efek di membran pascasinaps bersifat sementara karena di celah sinapsis dan membran pascasinaps terkandung enzim AChE. Sekitar setengah dari ACh yang dilepas dari membran prasinaps dihancurkan sebelum mencapai reseptornya di membran pascasinaps. Molekul ACh yang sukses berikatan di reseptornya biasanya dihancurkan dalam waktu 20 milidetik. Enzim AChE menghidrolisis ACh menjadi asam asetat dan kolin. Kolin diserap kembali dan digunakan untuk menyintesis lebih banyak ACh. Asam asetat didifusikan dari sinapsis dan bisa diabsorpsi atau dimetabolisme oleh membran pascasinaps atau oleh sel dan jaringan lain (Martini dan Judi 2009).
Juwet (Syzygium cumini)
Tanaman S. cumini memiliki beberapa nama daerah, yaitu Jambe kleng (Aceh), Jambe kling (Gayo), Jambu kalang (Minangkabau), Jambelang (Melayu), dan Juwet (Sunda, Jawa, dan Jakarta). Juwet diklasifikasikan ke dalam divisi Magnoliophyta, kelas Magnoliopsida, famili Myrtaceae, genus Syzygium, dan spesies Syzygium cumini (L.) Skeels (Dalimartha 2007).
Tanaman juwet memiliki ketinggian sekitar 15 m, berdaun tebal, dan berbentuk lonjong (Gambar 1). Di Indonesia, tumbuhan ini bisa tumbuh dengan subur. Daging buahnya putih kemerah-merahan. Kulit buahnya tipis, halus, ungu tua sampai kehitaman dengan rasa asam manis. Buah juwet berkhasiat sebagai obat diare, diabetes, dan obat nyeri ginjal. Kulit batang dapat digunakan untuk mengobati sakit perut dan diabetes. Hampir seluruh bagian tanaman juwet mengandung saponin, flavonoid, dan tanin (Heyne 1987).
4
Cengkih (Syzygium aromaticum)
Indonesia dikenal sebagai salah satu negara penghasil cengkih. Tanaman cengkih banyak dihasilkan di daerah Maluku. Cengkih (S. aromaticum (L) Merr) diklasifikasikan ke dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Angiospermae, kelas Dicotyledoneae, ordo Myrtales, famili Myrtaceae, genus Syzygium, spesies Syzygium aromaticum (L.) Merr (Guzman dan Siemonsma 1999). Pohon cengkih dapat tumbuh hingga 20–30 m dan dapat berumur lebih dari seratus tahun. Daunnya tunggal, berbentuk kerucut memanjang dengan pangkal yang tajam, kaku, dan warna hijau kekuning-kuningan dengan sisi atas yang mengilap (Gambar 2). Kuncup-kuncup bunga diambil sebelum mekar kemudian dikeringkan. Bahan kering ini yang dikenal sebagai cengkih.
Gambar 2 Tanaman S. aromaticum (Guzman dan Siemonsma 1999).
Cengkih sebagian besar dimanfaatkan untuk penyedap makanan, tetapi pemanfaatan untuk kesehatan juga sudah dikenal selama berabad-abad salah satunya adalah untuk mengobati stres. Minyak cengkih bermanfaat sebagai zat perangsang pikiran dan mental, untuk mengobati masalah mental seperti kehilangan memori, depresi, dan kegelisahan. Selain itu, cengkih memiliki khasiat mengatasi sakit gigi, sinusitis, mual, kembung, masuk angin, sakit kepala, radang lambung, batuk, rematik, campak, dan sebagainya.
Cengkih mengandung 14–20% minyak atsiri yang terutama terdiri atas turunan fenol, seperti eugenol, asetil eugenol, kariofilena, eugenin, vanilin, dan asam galotanin. Kandungan senyawa fenolik pada cengkih dapat berperan sebagai antioksidan. Khalaf et al. (2007) telah meneliti keberadaan senyawa alkaloid, glikosida, tanin, dan flavonoid pada cengkih dengan menggunakan pelarut metanol. Hasil penelitian tersebut menunjukkan kemampuan cengkih sebagai antioksidan. Penelitian Kumala dan Indriani (2008) menunjukkan bahwa ekstrak etanol 96% daun cengkih dengan metode maserasi mempunyai efek antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan Salmonella paratyphi dan menurut Ardani et al. (2010), minyak atsiri daun cengkih terbukti meningkatkan kemampuan antibakteri sebagai antiplak gigi.
Salam (Syzygium polyanthum)
Secara morfologi, salam merupakan pohon bertajuk rimbun dengan tinggi mencapai 25 m, berbatang bulat dengan permukaan yang licin, dan berakar tunggang. Daunnya tunggal, posisi berhadapan, dengan panjang tangkai daun 0,5– 1 cm (Gambar 3) (Sumono dan Wulan 2008).
Gambar 3 Daun S. polyanthum (Sumono dan Wulan 2008).
Daun salam mengandung saponin, triterpenoid, flavonoid, tanin, dan alkaloid. Minyak atsiri dalam daun salam terdiri atas seskuiterpena, lakton, dan fenol (Heyne 1987). Daun salam berkhasiat untuk menurunkan kolesterol, mengobati diabetes, tekanan darah tinggi, radang lambung, dan diare. Daun salam telah diteliti oleh Wahyono dan Susanti (2005) dan menunjukkan bahwa ekstrak etanol 30% dan 70% daun salam dengan metode maserasi dapat memberikan efek hipoglikemik pada kelinci setelah mendapat pembebanan glukosa.
Ekstraksi Sonikasi
Ekstraksi sonikasi merupakan teknik ekstraksi dengan menggunakan gelombang ultrasonik dengan frekuensi rendah 20–40 kHz yang dapat mempercepat waktu kontak antara sampel dan pelarut meskipun pada suhu ruang. Hal ini mempercepat proses perpindahan massa senyawa bioaktif dari dalam sel tanaman ke pelarut (Vinatoru 2001). Sonikasi mengandalkan energi gelombang yang menyebabkan proses kavitasi, yaitu pembentukan gelembung-gelembung kecil akibat transmisi gelombang ultrasonik untuk membantu difusi pelarut ke dalam dinding sel tanaman (Ashley et al. 2001). Dengan metode ini, waktu ekstraksi lebih singkat, keterulangan ekstraksi baik, dan dimungkinkan ukuran sampel yang beragam. Batubara et al. (2011) memperoleh aktivitas antioksidan ekstrak secang yang dihasilkan dengan teknik sonikasi menggunakan etanol 50% lebih baik dibandingkan dengan yang diperoleh dengan maserasi dalam waktu yang lebih lama.
Analisis Sidik Jari
6
dalam penelitian ini misalnya senyawa inhibitor AChE. Menurut Nowak (2007), KLT ialah metode pilihan untuk pembuktian keaslian suatu tanaman obat.
Sidik jari KLT digunakan sebagai alat untuk evaluasi dan pembandingan komposisi senyawa dalam obat herbal. Prinsip KLT adalah pemisahan komponen campuran berdasarkan distribusi di antara 2 fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase gerak bekerja berdasarkan prinsip kapilaritas pada fase diam. Fase gerak menggerakkan komponen-komponen sampel pada laju yang berbeda-beda karena perbedaan tingkat interaksi dari setiap komponen dengan matriks dan kelarutannya dalam pelarut. Pergerakan komponen relatif terhadap garis depan pelarut dalam sistem KLT didefinisikan sebagai nilai Rf, yaitu perbandingan jarak
tempuh komponen dengan jarak tempuh pelarut (eluen). Nilai Rf khas untuk suatu
senyawa tertentu (Khopkar 2003).
Desain Campuran
Desain campuran digunakan pada percobaan dengan ragam beberapa parameter. Faktornya ialah komponen-komponen dalam campuran sehingga taraf masing-masing faktor tidak saling bebas. Desain campuran terdiri atas simplex lattice, simplex centroid, dan extreme vertices. Simplex centroid (Gambar 4) diperkenalkan oleh Scheffe pada tahun 1963 untuk memberikan ulasan percobaan dari respons permukaan di bagian pusat bidang. Salah satu cara pemodelan simplex centroid adalah dengan mempertimbangkan struktur dari percobaan 3 faktor. Rancangan 3 komponen dapat digambarkan dalam 2 dimensi dengan segitiga sama sisi (Soares et al. 2008). Penelitian mengenai pengoptimuman fase gerak juga pernah dilakukan menggunakan simplex centroid design (SCD) oleh Borges et al. (2007).
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah peralatan kaca, neraca analitik, cawan porselen, oven, ultrasonic bath processor 38 kHz, penguap putar, microplate reader BioTek, 96-well-plates, mikropipet, vorteks, pH-meter, inkubator, lampu ultraviolet (UV) 254/366 nm, Camag Linomat 5, dan Camag Reprostar 3.
Bahan-bahan yang digunakan adalah kuncup cengkih kering yang diperoleh dari Cikereteg (Sukabumi Jawa Barat), daun cengkih, daun juwet, daun salam yang diperoleh dari Cikabayan (Kebun Biofarmaka IPB), n-heksana, etil asetat, metanol, akuades, kloroform, n-butanol, diklorometana, asam asetat, NaOH 1 M, enzim AChE dari Sigma-Aldrich, asetiltiokolin klorida dari Sigma-Aldrich, reagen ion DTNB dari Sigma-Aldrich, fisostigmin dari Sigma-Aldrich, bufer N-2-hidroksietilpiperazin-N-2-asam etana sulfonat (HEPES) pH 8, dimetil sulfoksida (DMSO), dan pelat KLT silika gel GF254 dari Merck.
Ruang Lingkup Penelitian
Metode penelitian yang dilakukan mengikuti diagram alir pada Lampiran 1 yang meliputi beberapa tahap. Simplisia yang telah dikeringudarakan dan dikeringkan dalam oven pada suhu 40 oC ditentukan kadar airnya kemudian diekstraksi menggunakan 3 pelarut yang berbeda kepolarannya (n-heksana, etil asetat, metanol). Setelah itu, daya inhibisi ekstrak terhadap aktivitas AChE diuji hingga diperoleh informasi nilai IC50. Ekstrak dengan IC50 terbaik kemudian
dianalisis profil sidik jarinya dengan menggunakan KLT.
Penentuan Kadar Air
Kadar air ditentukan merujuk AOAC (2007). Cawan porselen dikeringkan dalam oven pada suhu 105 oC selama 30 menit, didinginkan dalam eksikator selama 30 menit, dan ditimbang bobot kosongnya. Sampel tanaman ditimbang masing-masing 2 g dan dimasukkan ke dalam cawan porselen tersebut. Sampel beserta cawan dimasukkan kembali ke dalam oven bersuhu 105 oC selama 5 jam, didinginkan dalam eksikator selama 30 menit, dan ditimbang. Pemanasan dan penimbangan diulangi hingga diperoleh bobot konstan. Kadar air simplisia tanaman dihitung dengan rumus
Kadar air (%) = − ×100% a
b a
8
Ekstraksi Tanaman dengan Metode Sonikasi
Ekstraksi dengan metode sonikasi dilakukan merujuk Yonanda (2011). Serbuk tanaman ditimbang sebanyak 25 g, lalu ditambahkan pelarut n-heksana, etil asetat, dan metanol secara bertahap dengan nisbah 1:5 (b/v) masing-masing sebanyak 3 kali ulangan. Campuran ditempatkan di dalam penangas ultrasonik dan diekstraksi selama 30 menit sebanyak 3 kali ulangan dengan frekuensi gelombang 38 kHz. Ekstrak disaring, dipekatkan dengan penguap putar, lalu dikeringkan beku hingga diperoleh ekstrak kering.
Uji Inhibisi Enzim Asetilkolinesterase
Aktivitas enzim AChE diukur dengan menggunakan microplate reader dengan memodifikasi metode Ellman et al. (1961) dan Oh et al. (2010). Enzim menghidrolisis substrat asetiltiokolin menghasilkan tiokolin yang akan bereaksi dengan reagen DTNB. Warna kuning yang terbentuk kemudian diukur absorbansnya pada panjang gelombang 412 nm.
Setiap ekstrak dilarutkan dalam bufer HEPES pH 8 dengan konsentrasi 2120 μg/mL. Sebanyak 112 μL larutan ekstrak tersebut ditambahkan ke dalam 112 μL bufer HEPES pH 8 lalu ditambahkan 40 μL AChE (0.36 U/mL dalam bufer HEPES pH 8) dan diinkubasi pada suhu 8 oC selama 30 menit. Setelah itu, ditambahkan larutan DTNB 0.5 mM dan asetiltiokolin klorida 0.6 mM masing-masing sebanyak 20 μL, diinkubasi kembali pada suhu 37 oC selama 20 menit. Selanjutnya 20 μL fisostigmin 0.1 mM ditambahkan untuk menghentikan reaksi enzim.
Larutan blangko (tanpa sampel) dibuat dengan perlakuan sama seperti sampel. Larutan fisostigmin dalam bufer HEPES pH 8 digunakan sebagai kontrol positif. Larutan pada setiap sumur diukur absorbansnya dengan menggunakan microplate reader BioTek pada 412 nm untuk menentukan persen inhibisi dan nilai IC50. Sampel dan kontrol positif diukur masing-masing 2 kali ulangan
(duplo). Persentase inhibisi dihitung dengan cara membandingkan absorbans sampel pada 412 nm tanpa penambahan ekstrak (E) dan dengan penambahan ekstrak (S):
% inhibisi = − ×100% E
S E
Nilai IC50 diperoleh dengan mengalurkan konsentrasi ekstrak sebagai sumbu x dan
% inhibisi sebagai sumbu y.
Pemilihan Eluen Terbaik dengan KLT
diangkat, dikeringkan, kemudian dideteksi di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Tiga pelarut tunggal yang memberikan pemisahan terbaik dipilih untuk digunakan sebagai fase gerak (A, B, dan C) dan dikombinasikan berdasarkan SCD (Tabel 1) (Borges et al. 2007).
Tabel 1 Komposisi fase gerak menggunakan SCD
Fase gerak Nisbah komposisi fase gerak (v/v/v)
A B C 1 1 0 0 2 0 1 0 3 0 0 1 4 ½ 0 ½ 5 0 ½ ½ 6 ½ ½ 0
7 1/3 1/3 1/3
8 1/6 2/3 1/6
9 1/6 1/6 2/3
10 2/3 1/6 1/6
Selanjutnya komponen pada ekstrak metanol daun cengkih, daun salam, dan kuncup cengkih serta ekstrak etil asetat daun salam dipisahkan dengan 10 kombinasi pelarut tersebut. Deteksi menggunakan sinar UV pada 254 dan 366 nm lalu dihitung nilai Rf dari setiap noda yang terbentuk. Nilai Rf serta jumlah noda
yang diperoleh menjadi parameter untuk menentukan eluen terbaik.
Analisis Sidik Jari Menggunakan KLT
Analisis sidik jari KLT merujuk Nowak (2007). Ekstrak yang memiliki nilai IC50 terbaik dilarutkan dalam pelarut yang sesuai dengan konsentrasi 10000
μg/mL dan ditotolkan pada pelat KLT GF254. Elusi menggunakan fase gerak
terbaik hasil pemilihan eluen. Pelat KLT yang telah dielusi selanjutnya diangkat, dikeringkan, dan dideteksi. Deteksi dilakukan di bawah UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar Air
10
Tabel 2 Kadar air simplisia genus Syzygium Sampel Kadar air (%b/b)
Daun juwet 5.52±0.08
Daun cengkih 7.23±0.09
Daun salam 4.86±0.08
Kuncup cengkih 12.40±0.12
Kadar air simplisia serbuk kering daun berkisar 4.86–7.23%. Kadar air tersebut telah memenuhi kriteria sebagai bahan baku obat herbal. Selain itu, sampel dapat disimpan dalam waktu relatif lama. Kadar air serbuk kuncup cengkih masih 12.40% meskipun seluruh simplisia tanaman telah dikeringkan dalam oven bersuhu 40 oC. Hal ini disebabkan kuncup cengkih memiliki permukaan yang lebih tebal daripada daun sehingga kandungan airnya lebih sulit teruapkan. Perhitungan kadar air setiap sampel disajikan pada Lampiran 2.
Ekstrak
Ekstraksi dilakukan untuk memisahkan senyawa yang larut dalam pelarut yang digunakan. Metode ekstraksi sonikasi memanfaatkan energi gelombang ultrasonik yang menyebabkan proses kavitasi sehingga diharapkan senyawa dalam sel tanaman akan terekstraksi dalam waktu lebih singkat. Ekstraksi dilakukan secara bertingkat dengan menggunakan pelarut n-heksana, etil asetat, dan metanol masing-masing selama 30 menit sebanyak 3 kali ulangan. Ekstraksi bekerja berdasarkan prinsip like dissolves like, artinya pelarut polar akan melarutkan senyawa polar dan pelarut nonpolar akan melarutkan senyawa nonpolar. Jumlah senyawa yang terekstraksi dalam pelarut dapat dilihat dari persen (b/b) rendemen yang diperoleh.
Gambar 5 Rendemen ekstrak berdasarkan bobot kering sampel
( dan )
Pada kuncup cengkih, rendemen tertinggi diperoleh saat digunakan pelarut metanol (19.03%). Sifat polar pelarut metanol mampu mengekstraksi komponen senyawa aktif yang larut dalam cairan ekstraselular dan intraselular (Harborne 1987). Rendemen ekstrak tertinggi kedua pada kuncup cengkih diperoleh pada pelarut n-heksana. Hal ini membuktikan bahwa terdapat cukup banyak senyawa nonpolar juga pada kuncup cengkih. Menurut Farrel (1985) dan Nurdin et al. (2001), ekstrak cengkih menghasilkan minyak atsiri sebesar 17% (eugenol 93%). Perhitungan rendemen ekstrak disajikan pada Lampiran 3.
Daya Inhibisi Ekstrak terhadap Asetilkolinesterase
Daya inhibisi senyawa bioaktif yang terkandung dalam ekstrak n-heksana, etil asetat, dan metanol dari tanaman genus Syzygium terhadap enzim AChE dinyatakan dengan IC50, yaitu konsentrasi ekstrak yang mampu menghambat
hidrolisis asetiltiokolin sebesar 50% (Nino et al. 2006). Reaksi hidrolisis asetiltiokolin oleh enzim AChE diharapkan dapat dihambat oleh inhibitor kolinesterase hanya dengan konsentrasi yang rendah. Oleh sebab itu, rendahnya nilai IC50 suatu ekstrak menunjukkan aktivitas inhibisi yang semakin baik.
Berdasarkan Gambar 6, ekstrak daun cengkih, daun salam, dan kuncup cengkih memiliki potensi yang lebih baik (nilai IC50 lebih rendah) dibandingkan
dengan ekstrak daun juwet. Pada tahap berikutnya dilakukan pengujian lanjutan terhadap 6 ekstrak terpilih, yaitu ekstrak n-heksana, etil asetat, dan metanol daun cengkih; ekstrak etil asetat dan metanol daun salam; serta ekstrak metanol kuncup cengkih. Enam ekstrak tersebut dipilih berdasarkan nilai IC50 terendah dan nilai
regresi yang baik (Lampiran 4).
12
Daun juwet Daun cengkih Daun salam Kuncup cengkih
Eks trak
Kontrol positif yang digunakan ialah fisostigmin, zat inhibitor AChE dalam bentuk obat sintetik yang tersedia untuk menangani penyakit demensia (Mukherjee et al. 2007). Fisostigmin bekerja menginaktifkan AChE secara reversibel melalui mekanisme hidrolisis oleh enzim (Marston et al. 2002). Fisostigmin menunjukkan nilai IC50 sebesar 0.01 μg/mL. Hasil pengujian lebih
lanjut disajikan pada Tabel 3 dan menunjukkan bahwa ekstrak tanaman dari genus yang sama cenderung meningkat nilai IC50-nya. Hal ini disebabkan oleh
menurunnya stabilitas enzim selama penyimpanan sehingga aktivitas inhibisinya menurun. Kurva regresi penentuan IC50 dapat dilihat pada Lampiran 5.
Tabel 3 Nilai IC50 pada 6 ekstrak dan kontrol positif
Ekstrak Persamaan regresi R IC50
Aktivitas inhibisi ekstrak masih lebih rendah bila dibandingkan dengan fisostigmin (Tabel 3). Walaupun demikian, ekstrak menunjukkan aktivitas inhibisi yang kuat karena memiliki IC50 kurang dari 200 μg/mL (Oh et al. 2004).
Dibandingkan dengan penelitian lain, yaitu tanaman Centella asiatica, Nardostachys jatamansi, dan Myristica fragrans yang memiliki nilai IC50
berturut-turut 106.55, 130.11, dan 133.28 μg/mL (Mukherjee et al. 2007), tanaman Syzygium yang diteliti memiliki aktivitas inhibisi lebih baik karena mempunyai IC50 kurang dari 100 μg/mL.
etil asetat, metanol)
Analisis Sidik Jari KLT
Kromatografi lapis tipis merupakan suatu metode pemisahan senyawa kimia berdasarkan perbedaan distribusi di antara 2 fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Silika gel yang dilapiskan pada logam sepanjang 10 cm digunakan sebagai fase diam KLT, dan pelarut tunggal atau campuran dalam bejana kromatografi merupakan fase geraknya. Ekstrak yang dianalisis sidik jari adalah yang memiliki aktivitas inhibisi terbaik (nilai IC50 terendah), yaitu ekstrak metanol daun cengkih,
daun salam, dan kuncup cengkih serta ekstrak etil asetat daun salam. Analisis sidik jari dengan KLT diawali dengan penentuan fase gerak terbaik agar diperoleh pola kromatografi yang baik.
Fase Gerak Terbaik
Pemilihan eluen diawali dengan mengelusi ekstrak metanol daun cengkih dan ekstrak etil asetat daun salam menggunakan 6 pelarut tunggal dengan kepolaran berbeda, yaitu n-butanol, metanol, asam asetat, diklorometana, kloroform, dan etil asetat. Pita yang terbentuk dideteksi dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Pelat KLT yang digunakan pada penelitian ini ialah pelat silika gel GF254, yang berarti bahwa pelat akan berpendar ketika
dikenai sinar UV 254 nm dan noda hasil pemisahan akan teramati sebagai noda gelap. Namun, setelah dideteksi, pita lebih terlihat jelas pada 366 nm, maka digunakan untuk pengamatan selanjutnya. Hasil elusi ekstrak metanol daun cengkih dan ekstrak etil asetat daun salam dengan 6 pelarut tunggal ditunjukkan pada Lampiran 6 dan 7. Jumlah noda yang diperoleh disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4 Jumlah noda pada elusi ekstrak metanol daun cengkih dan ekstrak etil asetat daun salam dengan 6 fase gerak tunggal
Fase gerak
Jumlah noda
Ekstrak metanol daun cengkih Ekstrak etil asetat daun salam
n-Butanol 7 5
Metanol 6 2
Asam asetat 2 2
Diklorometana 5 3
Kloroform 5 6
Etil asetat 6 3
Fase gerak n-butanol, metanol, diklorometana, kloroform, dan etil asetat menunjukkan jumlah noda yang lebih banyak dan keterpisahan yang baik dibandingkan dengan asam asetat dalam mengelusi ekstrak metanol daun cengkih maupun ekstrak etil asetat daun salam. Tiga pelarut tunggal dipilih untuk dimasukkan ke dalam model SCD berdasarkan tingkat kepolaran masing-masing yang dapat mewakili keterpisahannya untuk memperoleh komposisi campuran terbaik dari campuran 3 pelarut tersebut sebagai fase gerak.
14
baik senyawa dalam jumlah yang banyak (Harborne 1987). Eluen n-butanol menunjukkan jumlah noda terbanyak, tetapi keterpisahannya kurang baik karena terdapat noda di tengah dan akhir elusi yang menunjukkan bahwa komponen bersifat semipolar dan lebih cocok terelusi oleh eluen yang juga bersifat semipolar. Selain itu, masih terdapat beberapa noda yang belum terpisahkan dengan baik (Lampiran 6).
Tiga fase gerak yang digunakan untuk elusi ekstrak etil asetat daun salam ialah n-butanol, diklorometana, dan etil asetat. Eluen kloroform dan etil asetat menunjukkan keterpisahan yang baik serta menghasilkan jumlah noda terbanyak (Lampiran 7). Namun, berdasarkan indeks polaritas, sifat kepolaran kloroform hampir mirip dengan n-butanol, sedangkan etil asetat lebih semipolar dibandingkan n-butanol (Lampiran 8). Oleh karena itu, dipilih eluen yang memiliki kepolaran berbeda agar dapat memisahkan lebih banyak komponen dalam ekstrak tanaman.
Ketiga fase gerak terbaik kemudian dicampurkan sesuai dengan Tabel 1. Hasil elusi ekstrak metanol dan ekstrak etil asetat dengan komposisi fase gerak tersebut diperlihatkan pada Lampiran 9 dan 10. Jumlah pita terbanyak dan pemisahan yang baik diperoleh pada komposisi 5, yaitu diklorometana-etil asetat (1/2:1/2), untuk pemisahan ekstrak metanol (Tabel 5) maupun ekstrak etil asetat (Tabel 6). Berdasarkan hasil ini, fase gerak terbaik untuk ekstrak metanol daun cengkih, daun salam, dan kuncup cengkih maupun ekstrak etil asetat daun salam ialah diklorometana-etil asetat (1/2:1/2).
Tabel 5 Jumlah noda pada elusi ekstrak metanol daun cengkih, daun salam, dan kuncup cengkih menggunakan fase gerak campuran di bawah sinar UV 366 nm
Komposisi
Fase gerak (metanol:diklorome
tana:etil asetat)
Jumlah pita ekstrak metanol
Tabel 6 Jumlah noda pada elusi ekstrak etil asetat daun salam menggunakan fase
gerak campuran di bawah sinar UV 366 nm
Komposisi Fase gerak (n
-butanol:diklorometana:etil asetat)
Jumlah pita ekstrak etil asetat daun salam
Jumlah noda yang diperoleh pada setiap ekstrak berbeda dan nilai Rf yang
dihasilkan tidak jauh berbeda pada profil KLT ekstrak metanol daun cengkih, daun salam, dan kuncup cengkih serta ekstrak etil asetat daun salam saat elusi menggunakan pelarut yang sama (Tabel 7). Hal ini membuktikan bahwa komponen dalam ekstrak metanol dan ekstrak etil asetat hampir seluruhnya bersifat semipolar. Pola sidik jari KLT dapat dilihat pada Gambar 7.
Tabel 7 Jumlah noda dan nilai Rf ekstrak metanol daun cengkih, daun salam, dan
16
Gambar 7 Profil KLT ekstrak metanol daun cengkih (a), daun salam (b), dan kuncup cengkih (c), serta ekstrak etil asetat daun salam (d) dengan pelarut diklorometana-etil asetat (1/2:1/2) di bawah sinar UV 366 nm.
Berdasarkan Gambar 7, elusi ekstrak metanol daun cengkih menghasilkan 9 noda yang terpisah, sedangkan elusi ekstrak metanol kuncup cengkih dihasilkan 2 noda terpisah. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun cengkih memiliki komponen senyawa yang lebih kompleks dibandingkan dengan ekstrak metanol kuncup cengkih dan cenderung bersifat semipolar karena lebih kuat berinteraksi dengan fase gerak diklorometana:etil asetat. Sementara itu, ekstrak metanol daun salam menghasilkan 7 noda yang terpisah, lebih banyak dibandingkan dengan ekstrak etil asetat daun salam (5 noda). Hal ini membuktikan bahwa campuran eluen yang digunakan mampu memisahkan lebih banyak komponen pada ekstrak metanol daun salam dibandingkan dengan ekstrak etil asetat daun salam.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Ekstrak metanol daun cengkih, daun salam, dan kuncup cengkih serta ekstrak etil asetat daun salam merupakan ekstrak teraktif sebagai inhibitor AChE yang memiliki daya inhibisi lebih baik dibandingkan dengan ekstrak lainnya. Nilai IC50 yang dihasilkan berturut-turut sebesar 42.13, 47.15, 45.22, dan 45.02
μg/mL. Eluen yang baik digunakan untuk pemisahan ekstrak metanol daun cengkih, daun salam, dan kuncup cengkih serta ekstrak etil asetat daun salam adalah campuran diklorometana dengan etil asetat (1/2:1/2) yang berturut-turut menghasilkan 9,7, 2, dan 5 noda.
Saran
DAFTAR PUSTAKA
[AOAC] Association of Official Analytical Chemists. 2007. Official Methods of AOAC International. Rev ke-2. Vol ke-1. Maryland: AOAC International. Ardani M, Pratiwi S, Hertiani T. 2010. Efek campuran minyak atsiri daun cengkih
dan kulit batang kayu manis sebagai antiplak gigi. Maj Farm Indones. 21(3):191-201.
Ashley K, Andrews RN, Cavazos L, Demange M. 2001. Ultrasonic extraction as a sample preparation technique for elemental analysis by atomic spectrometry. J Anal Atomic Spectrom. 16:1147-1153.
Batubara I, Mitsunaga T, Darusman LK, Febriani S, Rahminiwati M. 2011. Efisiensi sonikasi dan penyaringan ekstrak secang terhadap aktivitas antijerawat. Program Riset Unggulan Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Natural Product Chemistry, Gifu University.
Borges CN, Bruns RE, Almeida AA, Scarminio IS. 2007. Mixture-mixture design for the fingerprint optimization of chromatographic mobile phases and extraction solutions for Camellia sinensis. Anal Chim Acta. 595:28-37. Chisholm-Burns MA, Wells BG, Schwinghammer TL, Malone PM, Kolesar JM,
Rotschafer JC, Dipiro JT. 2008. Pharmacotherapy Principles and Practice. New York (US): McGraw-Hill.
[Depkes RI] Departemen Kesehatan RI. 2008. Farmakope Herbal Indonesia Edisi I. Jakarta: Depkes RI.
Dalimartha S. 2007. Atlas Tumbuhan Obat Indonesia, Jilid 2. Jakarta (ID): Trubus Agriwidya.
Das A, Shanker G, Nath C, Pal R, Singh S, Singh HK. 2002. A comparative study in rodents of standardized extracts of Bacopa monniera and Ginkgo biloba anticholinesterase and cognitive enhancing activities. Pharmacol Biochem & Behavior. 73:893-900.
Dastmalchi K, Dorman HJD, Vuorela H, Hiltunen R. 2007. Plants as potential sources for drug development against Alzheimer’s disease. Int J Biomed Pharm Sci. 5:88-90.
Ellman GE, Courtney KD, Andersen V, Featherstone RM. 1961. A new and rapid calorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol. 7:88-95.
Farrel KT. 1985. Spices Condoments and Seasonings. New York (US): Van Vostrand Reinhold.
Guzman CCD, Siemonsma JS. 1999. Plant Resources of South-East Asia Spices. Bogor (ID): Prosea.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah; Niksolihin S, editor. Bandung (ID): ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Methods.
Harjadi W. 1993. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta (ID): Gramedia Pustaka Utama.
Heyne K. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia, Jilid 3. Jakarta (ID): Yayasan Sarana Wana Jaya.
18
Kanopa IU, Momuat LI, Suryanto E. 2012. Aktivitas antioksidan tepung pisang goroho (Musa spp) yang direndam dengan beberapa rempah-rempah. J MIPA Unsrat. 1(1):29-32.
Khalaf NA, Ashok KS, Atif AO, Zaha EA, Husni F. 2007. Antioxidant activities of some common plants. Turk J Biol. 31:1-5.
Khopkar SM. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Saptorahardjo, penerjemah. Jakarta (ID): UI Pr. Terjemahan dari: Basic Concept of Analytical Chemistry.
Kumala S, Indriani D. 2008. Efek antibakteri ekstrak etanol daun cengkih (Eugenia aromatica L.). J Farm Indones. 4(2):82-87.
Marston A, Kissling J, Hostettmann K. 2002. A rapid TLC bioautographic method for the detection of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibitors in plants. Phytochem Anal. 13:51-54.
Martini FH, Judi LN. 2009. Fundamentals of Anatomy and Physiology. Ed ke-8. San Francisco (US): Pearson Education. hlm. 414-415.
Mukherjee PK, Kumar V, Houghton PJ. 2007. Screening of Indian medicinal plants for acetylcholinesterase inhibitory activity. Phytother Res. 21:1142-1145.
Nino J, Hernandez JA, Correa YM, Mosquera OM. 2006. In vitro inhibition of acetylcholiesterase by crude plant extracts from Colombian flora. Pharm Biol. 101(7):783-785.
Nowak R. 2007. TLC fingerprinting analysis of the European Dog Rose. J Planar Chromatogr. 20:43-48.
Nurdin A, Achmad M, Hadi S. 2001. Isolasi eugenol dari minyak daun cengkih skala pilot plant. J Sains Teknol 3:58-62.
Oh MH, Houghton PJ, Whang WK, Cho JH. 2004. Screening of Korean herbal medicines used to improve cognitive function for anti-cholinesterase activity. Phytomedicine. 11:544-548.
Perry NSL, Bollen C, Perry EK, Ballard C. 2003. Salvia for dementia therapy: review of pharmacological activity and pilot tolerability clinical trial. Pharmacol Biochem & Behaviour. 75:651-659.
Saputro DA. 2006. Uji aktivitas inhibitor asetilkolinesterase ekstrak etanol 96% daun Syzygium cumini, Syzygium aromaticum, Syzygium polyanthum, dan Syzygium aquaeum [skripsi]. Surabaya (ID): Universitas Airlangga.
SatheeshKumar N, Mukherjee PK, Bhadra S, Saha BP. 2010. Acetylcholinesterase enzyme inhibitory potential of standardized extract of Trigonella foenum graecum L and its constituents. Phytomedicine. 17:292-295.
Schamburg D, Salzmann M. 1990. Enzym Handbook 3. Springer. Verlag Berlin, Heidelberg. hlm. 1-7.
Snyder LR, Kirkland JJ. 1979. Introduction to Modern Liquid Chromatography. New York: J Wiley.
Soares PK, Burns RE, Scarminio IS. 2008. Statistical mixture design-principal component optimization for selective compound extraction from plant material. J Sep Sci. 30:3302-3310.
Tjahyanto A, Surilena. 2009. Penatalaksanaan nonfarmakologis demensia. Maj
Kedokteran Damianus. 8(1):1-4.
Vinatoru M. 2001. An overview of the ultrasonically assisted extraction of bioactive principles from herbs. Ultrasonics Sonochem. 8(3):303-313.
Wahyono D, Susanti. 2005. Aktivitas hipoglikemik ekstrak etanolik daun salam (Syzygium polyanthum (Wight) Walp) dan pengaruhnya terhadap stimulasi parasimpatik pada kelinci jantan yang dibebani glukosa [skripsi]. Yogyakarta (ID): Universitas Gajah Mada.
20
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Ekstrak n-heksana Ampas
Ekstrak etil asetat Ampas
Ekstraksi ultrasonikasi dengan etil asetat
Ekstrak metanol Ampas
Ekstraksi ultrasonikasi dengan metanol
Ekstrak teraktif inhibitor AChE
IC50 terbaik
Uji inhibisi aktivitas AChE Preparasi simplisia
(daun cengkih, daun juwet, daun salam, dan cengkih)
Serbuk daun cengkih, daun juwet, daun salam, dan cengkih
Ekstraksi ultrasonikasi dengan n-heksana
Penentuan kadar air
Lampiran 2 Kadar air simplisia daun juwet, daun cengkih, daun salam, dan kuncup cengkih
Sampel Ulangan
kosong Contoh awal
Cawan+contoh
kering Contoh kering
22
Lampiran 3 Rendemen hasil ekstraksi daun juwet, daun cengkih, daun salam, dan kuncup cengkih
Sampel Ulangan
n-Heksana Etil asetat Metanol n-Heksana Etil
asetat Metanol
Daun
15.28 11.80 18.24
15.12 0.23
Contoh perhitungan : sampel daun juwet (ulangan 1)
Lampiran 4 Penentuan nilai IC50 pada ekstrak daun cengkih, daun juwet, daun
salam, dan kuncup cengkih
Ekstrak Persamaan regresi R IC50
(μg/mL)
n-Heksana daun cengkih y = 24.782 ln x– 21.058 0.9616 17.5899 Etil asetat daun cengkih y = 23.214 ln x – 31.634 0.9618 33.6692
Metanol daun cengkih y = 22.11 ln x– 25.051 0.9905 29.7978
n-Heksana daun juwet y = 11.502 ln x– 1.9736 0.8915 91.7124 Etil asetat daun juwet y = 21.343 ln x– 33.83 0.9765 50.7926
Metanol daun juwet y = 34.177 ln x– 101.51 0.9347 84.1918
n-Heksana daun salam y = 9.1494 ln x + 23.068 0.6762 18.9837 Etil asetat daun salam y = 24.992 ln x– 28.267 0.9945 22.9125
Metanol daun salam y = 19.828 ln x– 17.707 0.9488 30.4083
n-Heksana kuncup cengkih y = 23.575 ln x– 49.894 0.9888 69.2197 Etil asetat kuncup cengkih y = 17.478 ln x– 21.434 0.9457 59.5658 Metanol kuncup cengkih y = 20.64 ln x– 25.471 0.9583 38.7272
Regresi Linear: Alur konsentrasi (sumbu x) dan % inhibisi (sumbu y) y = a + bx
50 = 24.782 ln x – 21.058
24
Lampiran 5 Kurva regresi penentuan IC50 ekstrak daun cengkih, daun salam, dan
kuncup cengkih serta fisostigmin
Contoh perhitungan ekstrak metanol daun salam: y = a + bx
[ekstrak heksana daun cengkeh] (μg/mL)
%
[ekstrak EtOAc daun cengkeh] (μg/mL)
%
[ekstrak MeOH daun cengkeh] (μg/mL)
%
[ekstrak EtOAc daun salam] (μg/mL)
%
[ekstrak MeOH daun salam] (μg/mL)
%
[ekstrak MeOH cengkeh](μg/mL)
Nilai persen inhibisi fisostigmin terhadap AChE
[Fisostigmin] (μg/mL) % inhibisi
0.05 67.35 0.025 62.45 0.0125 54.69 0.00625 44.90 0.003125 35.10 0.0015625 15.10 0.00078125 2.86
y = 15.857 ln(x) + 120.83 R = 0.9811
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
[Fisostigmin] (μg/mL)
% i
n
h
ib
is
i
Perhitungan nilai IC50 fisostigmin:
y = a + bx
26
Lampiran 6 Pola KLT ekstrak metanol daun cengkih (6 pelarut tunggal)
Di bawah sinar UV 254 nm Di bawah sinar UV 366 nm
Lampiran 7 Pola KLT ekstrak etil asetat daun salam (6 pelarut tunggal)
Di bawah sinar UV 254 nm Di bawah sinar UV 366 nm
Keterangan:
1. n-Butanol 4. Diklorometana
2. Metanol 5. Kloroform
3. Asam asetat 6. Etil asetat
Lampiran 8 Indeks polaritas fase gerak menurut Snyder dan Kirkland (1979)
Fase gerak Indeks polaritas
n-Butanol 3.9 Metanol 5.1
Asam asetat 6.0
Diklorometana 3.1 Kloroform 4.1
Lampiran 9 Pola KLT ekstrak metanol (10 komposisi pelarut berdasarkan SCD)
Di bawah sinar UV 254 nm
Di bawah sinar UV 366 nm
Keterangan:
1. Metanol (MeOH) 8. MeOH:CH2Cl2:EtOAc (1/6:1/6:2/3)
2. Diklorometana (CH2Cl2) 9. MeOH:CH2Cl2: (1/6:2/3:1/6)
3. Etil asetat (EtOAc) 10. MeOH:CH2Cl2:EtOAc (2/3:1/6:1/6)
4. MeOH:EtOAc (1/2:1/2) a = ekstrak metanol daun cengkih 5. CH2Cl2:EtOAc (1/2:1/2) b = ekstrak metanol daun salam
6. MeOH:CH2Cl2 (1/2:1/2) c = ekstrak metanol kuncup cengkih
28
Lampiran 10 Pola KLT ekstrak etil asetat daun salam (10 komposisi pelarut berdasarkan SCD)
Di bawah sinar UV 254 nm Di bawah sinar UV 366 nm
Keterangan:
1. n-Butanol
2. Diklorometana (CH2Cl2)
3. Etil asetat (EtOAc)
4. n-Butanol:EtOAc (1/2:1/2) 5. CH2Cl2:EtOAc (1/2:1/2)
6. n-Butanol:CH2Cl2 (1/2:1/2)
7. n-Butanol:CH2Cl2:EtOAc (1/3:1/3:1/3)
8. n-Butanol:CH2Cl2:EtOAc (1/6:1/6:2/3)
9. n-Butanol:CH2Cl2:EtOAc (1/6:2/3:1/6)
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 19 Juni 1989 dari Bapak H M Alwi Latief dan Ibu Hj Bunga Rajeng. Penulis merupakan anak keempat dari 4 bersaudara. Penulis menyelesaikan studi di SMAN 56 Jakarta pada tahun 2007. Pada tahun yang sama penulis diterima di Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) Program Diploma Institut Pertanian Bogor pada Program Keahlian Analisis Kimia. Tahun 2010, penulis mengikuti kegiatan praktik lapangan di Balai Besar Industri Agro, Bogor pada Laboratorium Makanan Olahan dan menyelesaikan laporan akhir dengan judul ”Perbandingan Metode Analisis Siklamat dalam Serbuk Minuman Ringan dengan Gravimetri dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi”. Pada bulan Oktober 2010, penulis dinyatakan lulus sebagai Ahli Madya Analisis Kimia dan pada tahun yang sama diterima di Program Alih Jenis Sarjana Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB.
