Pengembangan Metode Diagnostik Hibridisasi Molekuler dengan Pelacak DNA Non Radio Aktif untuk Mendeteksi Peanut Stripe Virum dari Benih Kacang Tanah

PENGEMBANGAN METODE DIAGNOSTIK

HIBRIDISASI MOLEKULER

DENGAN PELACAK DNA NON RADIO-AKTIF UNTUK

MENDETEKSI

Peanut Stripe Virus

DARI BE NIH

KACANG TANAH

OLEH

IFAMANZILA

96173

PROGRAM PASCASARJANA

INSTITUT PERT ANIAN BOGOR

RlNGKASAN

IFA MANZILA. 1999. Pengembaogan metode diagnostik bibridisasi molekuler dengan pelacak DNA non radio-aktif untuk mendetebi PealUlt Stripe Virus dari benih kacang taoab (Dibawab bimbingan Rusmilah Suseno 5ebagsi ｫ･ｴｵ｡ｾ＠ Sri

Hendrastuti Hidayat dan Jumanto Harjo8udarmo sebagai anggota)

Telah diketahui bahwa

Peanut Stripe Viru.\'

dapat

terbawa benih 5-20 persen.

Untuk mendeteksi PStV dalam benih kacang tanah telah dicoba beberapa cara, aotara

lain menggunakan cara-cara yang dapat digunakan

WItuk

mendeteksi PStV dalam

daun terinfeksi yaitu serologi dao teknik hibridisas. dot blot radio-aktif. Cara-cara

tersebut belum berbasil mendeteksi PStV dalam benih.

Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode diagnostik molekuler

dot blot hibridisasi dengan pelacak DNA nonradio-aktif untuk mendeteksi PStV

dalam benih kacang tanah yang terinfeksi PStY.

Penelitian dilaksanakan

<Ii

rumah kaea dan laboratorium virologi Balai

Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan Bogor (BALITBIO). Penelitian

berlangsung selama 9 bulan sejak bulan April 1998 sampai dengan Desember 1998.

Penelitian ini dilakukan dengan 6 tahapan, yaitu (I) Isolasi PStV dari tanamao yaog terinfeksi, (2) Inokulasi PStV pada tanaman uji. Pada tabap ini menggunakan

Rancaogan Faktorial dalam Rangcangan Acak Lengkap yang terdiri alas 3 faktor

yaitu varietas kacang

tanah

dengan 2 taraf, Isolat PStV dengan 3 taraf, dao

waktu

inokulasi dengan 4 tamf. Varielas kacang tanah yaog digunakan adalah varielas

ii

dan Jombang. Waktu inokulasinya adalah I, 2, 3, dan 4 minggu setelab tanam (mst).

Inokulasi dilakukan secara mekanik. Untuk kontrol. tanaman diperlakukan sarna

tetapi tidak menggunakan sumber PStV tetapi hanya bufer. (3) Pembuatan antiserum

PStV pohklonal. Pada pembuatan im menggunakan PStV mumi yang disuntikan

kedalam kelinci sebanyak 50 - 100 uglpenyuntikan. Penyuntikan dilakukan 4 kali

dengan mterval waktu satu minggu. Satu minggu setelah penyuntikan terakhir darah

kelinei diambil. (4) Deteksi PStV menggunakan IEM, (5) Deteksi PStV

menggunakan DIDA, (6) Deteksi PStV dengan metode hioridisasi dengan pelacak

DNA nonradio-aktif (Dietzgen, 1997).

Dalam penelitian tahap (I) diperoleh hasil bahwa pada tanaman indikator C.

amaranlic%r, PStV memperlihatkan gejala lesio lokal sedangkan pada tanaman

indikator

P. vulgaris tidak memperlihatkan gejala lesio lokal. Teknik

ini

adalah

cara

cepat membedakan PStV

dan

PeMoV yang gejala dan sifatnya mirip PStY. Pada

tanaman kacang

tanah

yang diperuntukkan sebagai sumber inolrulum isolat virus

yang digunakan memperlihatkan gejala bercak-bercak (bilur) hijau pada permukaan

daun. Gejala awal dapat dilihat pada daun muda dengan bereak bijau yang samar dan

tidal< beraturan. disekelilingnya

tampa](

warna yang agak muda (klorosis), dan daun berkerut Lama kelamaan gejala ini memperlihatkan gejala yang khas, warna bijaunya semakin tua tidal< beraturan dan mosaik.

Hasil pengamatan tahap (2) ketiga isolat mempunyai tingkat patogenisitas

yang berbeda pada pengujian menggunukan tanaman indikator. Jurnlab lesio lokal

iii

diinokulasikan dengan PStV isolat Pasuruan dan Jombang. Untuk isolat Pasuruan dan

Jombang relatif sarna. Pengamatan terhadap tanaman uji yaitu varietas Gajah

dan

Kelinci yang diinokulasi dengan PStV isolat Bogor menghasilkan jumlah polong,

bobot polong dan bobotlbiji lebih bcsar dan pada tanaman yang diinokulasi dengan

PStV isolat Pasuruan dan Jombang. Tanaman yang diinokulasi dengan PStV isolat

Pasuruan dan Jombang menghasilkan Jumlah polons, bobot polong dan bobotlbiji

berbeda tidak nyata

Hasil pengamatan tahap (3) hasil pembuatan antiserum PStV poliklonal

dengan menggunakan spektrofotometer, menunjukkan bahwa konsentrasi

virus

mumi

yang diperoleh masing-masing 143 ug/300ul, 144 ug/300ul, dan 144 ugl300ul.

Pengamatan dengan mikroskop e1ektron terhadap virus murni isolat Jombang terlihat

sebanyak 13 partikel atau lebih

I

bidang pandang sedang yang lain

kurang dari

13

partikel virus. Pengamatan tersebut dilakukan sebanyak 4

kali

dibang pandang.

Antiserum yang diperoleh berasaJ dan virus mumi PStV isolat Jombang. Absorban

hasil pemumian antiserum pada pengamatan dengan spektrofotometer adaIah 2.249.

Hasil deteksi dengan metode !EM dan DIBA (tahap 4

dan

5) terhadap daun

yang terinfeksi PStV memperoleh hasil yang positif Pada

!EM

positif sampai

pengenceran antiserum 2000 kali

dan

pada DIBA positif sampai pengenceran ekstrak

,ampel 500 kali. Deleksi

pada

metode yang sama pada biji memperlihatkan signal

positif yang lemah (tidak memperlihatkan adanya reaksi).

Dan basil pengamatan deteksi menggunakan metode dot blot hibndisasi

iv

tersebut dapat digunakan untuk mendeteksi PSt V didalam benih dengan

menggunakan bufer ekstraksi C yang komposisinya adalah I M Tns-HCI, pH 7,6;

200 mM LiCI; 2% SDS; 20 mM EOTA; dan fenollkloroform Kepekaan mctodc

tersebut untuk mendeteksi daun hingga pengenceran 2500 kali

dan

pada blJI sampal

pengenceran 100 kab. Deoga" metode yang sarna pula diketahui bahwa tidak semua biji yang berasal daTi tanama" kacang laoah varietas Gajah

dan

Kelinci terinfeksi

PENGEMBANGAN METODE DIAGNOSTIK HmRIDISASI MOLEKULER

DENGAN PELACAK DNA NON RADiO-AKTIF UNTUK MENDETEKSI

Peanut Stripe Virus DARI BENIH KACANG TANAH

Oleh

IFAMANZILA

96173

Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains pada

Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor

PROGRAM PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

Judul Penelitian : PENGEMBANGAN METODE DIAGNOSTIK HIBRIDISASI MOLEKULER DENGAN PELACAK DNA NON RADIO-AKTIF UNTUK MENDETEKSI Peanut Stripe Virus DAR! BENrn KACANGTANAH

Nama Mahaslswa IFA MANZILA

NRP :96173

Program studi . ENTOMOLOGI- FITOPATOLOGI

Menyetujui Komisi Pembimbing

Prof Dr.

If.

Rusmilah Suseno. MSc.

Ketua

ｾｊｭｕｊｩｫ｛ｲ＠

Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat. MSc. Dr r Jwnanto 'osudarmo Anggota

Ketu. Program Studi

Entomologi- Fitopatologi

--ＭＭＭｦｾｾ＠

J

l .

Dr. Ir. ! 011)'

ｓｾ＠

ga,MSc.

Tanggal Lulus : 4 Mei 1999

Anggota

Direktur

ascasaIJana

RIWAYAT HIDUP

Penulis djlahirkan di Jakarta pada tanggal 21anuari 1964, daTi Ayahanda

H.

Abdul AZlz (Aim) dan Ibunda H). SIll Zub.edah.

Pada tahun 1970 penults masuk Sekolah Dasar Negeri Pejaten Pasar Mlnggu

dan menyelesaikanny.

pada

tahun 1976, dilanjutkan ke SMP Negeri Islam 1

Mampang Prapatan, Jakarta dan selesai pada tahun 1979, dan dilanjutkan ke SMA

Negeri 38 Jakarta dan selesai

pada

tahun 1982.

P.da tahun

198211983

penolis di terim. di Fak. Biologi Universitas Nasion.1 Jakarta

dan

selesai

pada

tanggal14 mei 1988. Pada tahun yang sam. penolis diterim.

bekeIj.

pada

konsoltan pertanian PPA (Posat Pengembangan Agribisnis-Jakarta)

sampai tahun 1992. Sejak tahun 1993 sampai sekarang menjadi staf peneliti

pada

Balai Penelilian Bioteknologi Tanaman Pangan (BALITBIO) Bogor. Mulai

.wal

september 1996 terdaftar seb.g.i mahasiswa Program Magister Program Studi

KATA PENGANTAR

Pemanfaatan asam nukleat, DNA dan RNA, dalam metode praktis uotuk

deteksi alau identifikasi patogen-patogen tanaman merupakan hal yang masih baru.

jika dibandingkan dengan penggunaan mctode serologt dan

palolog1

klinik dalam

bidang ilmu penyakit tumbuhan. Kepraktisan menggunakan metode seroiogi dalam

patoiogi taoaman mempunyai keterbatasan yailu antara lain harns memilikl

antiserum yang sesuai dan dibutuhkan konsentrasi virus yang cukup tinggi. Oleh

karena itu penggunaan metode pelacak DNAIRNA molekuler dapat digunakan

sebagai altematif. Semua kebutuhan tcrsebut dikembangkan menjadi sistim

pengujian

praktis,

bermanfaat bagi kewatan di laboratorium dan lapang.

Tulisan ini memuat serangkaian percobaan yang dilakukan untuk mengetahui

keberadnan virus di dalam jaringan tanaman, daun maupun biji, menggunakan teknik

dot blot hibridisasi non radio aktif.

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu

Prof.

Dr.!r. Rusmilab Suseno M.Sc., Ibu Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat M.Sc., dan Bapak

Dr. Ir. Jumanto Hrujosudarmo, selaku komisi pembimbing atas kritik, saran dan

bimbingannya selama penelitian berlangsung hingga penulisan tesis ini.

Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Kepala Balai Penelitian

Bioteknologi Tanaman pangan Bogor, Bapak Dr. Djoko S. Damardjati , Direktur

Program Pascasarjana IPB, dan Ketua Program Studi Entomologi - Fitopatologi PPS

- IPB. Ucapan terima kasih disarnpaikan pula kepada Pengelola AClAR Project

yang telah membiayai sebagian penelitian

ini.

Terima kasih

kepada Bapak

Dr. Roechan Martoatmodjo ,lbu Ir. Minantyorini, Ibu Ir. Yati Supriati MS. Ketua Kelti

RPI , Wawan

serta

seluruh staf peneliti dan teknisi RPI dan Balitbio yang telab

memberikan dorongan semaogat dan saran-saran yang sangat berguna dalaro

Rasa terima kasih penulis sampaikan pula kepada ternan-ternan di Program

Studi Fitopatologi-Entomologi , Bapak Kikin, Bapak Edi Irwansyah dan khususnya

angkatan 96/97.

Penghormatan yang setinggi-tingginya dan penghargaan yang tidak tcrhingga

ditujukan keharibaan yang mulia Ibunda Hj. Siti Zubaedah AZlZ, Ayahanda II Ahdul

Aziz (Aim), Kakak, adik dan ipar serta semua keluarga atas pengorbanan dan

pengertiannya sehingga dapat mengantarkan penulis ke Perguruan Tinggi ini.

Penghargaan dan terima kasih yang tidak terhingga penulis sampaikan

kepada yang terkasih Mas Sandi Nugroho, yang telah banyak memberikan dorongan

semangat, pengertian dan membantu penulis dalam menyelesaikan penyusunan

tesis ini.

Penulis berharap agar tulisan 1m akan membawa manfaat bagi pengembangan penelitian berikulnya.

Bogor, April 1999