EVALUASI PENGGUNAAN CpG DNA DALAM
MENINGKATKAN EKSPRESI GEN IMUN PADA IKAN
KERAPU MACAN (Epinephelus fuscoguttatus)
RUQAYYAH JAMALUDDIN
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Evaluasi Penggunaan CpG DNA dalam Meningkatkan Ekspresi Gen Imun pada Ikan Kerapu Macan (Epinephelus fuscoguttatus) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Ruqayyah Jamaluddin
RINGKASAN
RUQAYYAH JAMALUDDIN. Evaluasi Penggunaan CpG DNA dalam
Meningkatkan Ekspresi Gen Imun pada Ikan Kerapu Macan
(Epinephelus fuscoguttatus). Dibimbing oleh RETNO DAMAYANTI
SOEJOEDONO dan ASMI CITRA MALINA.
Unmethylated Cystidine Phosphate Guanosine Oligodeoxynucleotides (CpG
DNA) merupakan salah satu jenis imunostimulan berupa DNA sintetik yang mengandung CpG motif yang terdiri dari sekuens pendek yang mengandung satu atau lebih motif CpG dan berperan sebagai ”danger signal” terhadap sistem
kekebalan imun natural maupun bawaan. Tujuan penelitian ini adalah menganalisis kemampuan CpG DNA untuk meningkatkan ekspresi gen
Interleukin 1β (IL1β), Cyclooxygenase 2 (COX-2) dan Tumour Necrosis Factor
(TNF-α1) pada ikan kerapu macan agar dapat dijadikan sebagai imunostimulan maupun adjuvan vaksin. Analisis tingkat ekspresi gen dilakukan dengan mengekstrak RNA organ Head Kidney (kepala ginjal) dengan perlakuan CpG DNA dan perlakuan PBS sebagai kontrol. Sintesis DNA komplementer (cDNA) dilakukan menggunakan kit Ready To Go You Prime First Strand Beads (GE Healthcare) dengan teknik RT-PCR. Produk PCR yang dihasilkan kemudian di analisis dengan mengukur nilai luminescence photostimulated menggunakan software UN SCAN IT berdasarkan pola (ketebalan fragmen DNA).
SUMMARY
RUQAYYAH JAMALUDDIN. Evaluation of DNA CpG Utilization to Improve The Expression of Immune Gene of Tiger Grouper (Epinephelus fuscoguttatus). Supervised by RETNO DAMAYANTI SOEJOEDONO and ASMI CITRA MALINA.
Unmethylated Cystidine Phosphate Guanosine Oligodeoxynucleotides (CpG DNA) was one of type of DNA synthetic immunostimulatory that consist of short sequences containing one or more types of CpG which play role as a "danger signal" to natural the immune system and innate immunity. The aims of this study was to analyze the ability of CpG DNA to increase the gene expression of Interleukin 1β (IL1β), Cyclooxygenase2 (COX-2) and tumor necrosis factor (TNF-α1) on tiger grouper that can be used as an immunostimulatory although adjuvant vacsination. Level of gene expression was analysis by extracted RNA Head Kidney organ with CpG DNA and PBS as control treated. Synthesis of complementary DNA (cDNA) was performed by Ready To Go You Prime First Strand Beads (GE Healthcare) kit used RT-PCR. The results of PCR products were analyzed by measured the value of photostimulated luminescence used UN SCAN IT software based pattern (DNA fragment hickness).
The results obtained in this study was the level of IL1β and COX-2 of gene expression and value of photostimulated luminescence were highest at CpG DNA treated than PBS as control treated while the level of gene expression of TNF-α1 highest at CpG DNA treated than PBS as control although the difference was not significance. The value of Photostimulated luminescence IL-1β gene at CpG DNA treated was 113684 and PBS as control was 95610, COX-2 gene at CpG DNA treated was 107592 and PBS as control was 89207 and TNF-α1 gene CpG DNA treated was 54818 and PBS as controlis was 52062.
Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Bioteknologi
EVALUASI PENGGUNAAN CpG DNA DALAM
MENINGKATKAN EKSPRESI GEN IMUN PADA IKAN
KERAPU MACAN (Epinephelus fuscoguttatus)
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2015
Judul Tesis : Evaluasi Penggunaan CpG DNA dalam Meningkatkan Ekspresi Gen Imun pada Ikan Kerapu Macan (Epinephelus fuscoguttatus) Nama : Ruqayyah Jamaluddin
NIM : P051120031
Disetujui oleh Komisi Pembimbing
Prof Dr drh Retno D. Soejoedono, MS Ketua
Asmi Citra Malina, SPi MAgrPhD Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Bioteknologi
Prof Dr Ir Suharsono, DEA
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
PRAKATA
Segala puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang senatiasa memberikan pertolongan, kekuatan dan kesabaran dalam menyelesaikan dan memperoleh gelar magister ini dengan baik. Shalawat serta salam kepada Rasulullah Muhammad SAW yang telah menjadi tauladan dalam berbagai aspek kehidupan bagi kita semua. Tesis ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Program Studi Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor. Tesis ini berjudul “Evaluasi Penggunaan CpG DNA dalam Meningkatkan Ekspresi Gen Imun pada Ikan Kerapu Macan (Epinephelus fuscoguttatus)”.
Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya penulis ucapkan kepada Prof Dr drh Retno Damayanti Soejoedono, MS selaku ketua komisi pembimbing dan Asmi Citra Malina, SPi MAgr Ph.D selaku anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan ilmu, saran, motivasi, nasehat waktu konsultasi, serta solusi dari setiap permasalahan yang dihadapi penulis selama melaksanakan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Selain itu, penulis ucapkan terimakasih kepada penguji luar komisi Dr Ir Utut Widyastuti, MSi dan Prof Dr Ir Suharsono, DEA selaku ketua Program Studi Bioteknologi IPB yang telah memberikan masukan pada saat ujian siding tesis serta motivasi selama studi. Kepada DIKTI melalui Beasiswa Unggulan selama menempuh pendidikan pascasarjana di IPB.
Penghargaan Penulis sampaikan kepada staf dan laboran di laboratorium Bioteknologi BPPBAP Maros Makassar segala kebaikan dan kemudahan yang diberikan selama proses penelitian. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada semua dosen, staf pegawai dan teman-teman di prodi Bioteknologi 2012 khususnya Narti, mba Susi, Ifa, dan semuanya yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu. Semua pengalaman dan pertemanan yang terjalin selama menimba ilmu di kampus IPB ini akan selalu berkesan dan tidak akan pernah penulis lupakan.Ucapan terima kasih tak terhingga juga penulis ucapkan kepada kedua orang tua yaitu ayahanda Drs Jamaluddin, MM dan ibunda Dra Nurhayati Yusuf serta semua saudaraku Fithriani Jamaluddin, SS, Mujahidah Jamaluddin, SHut, Ulfa Jamaluddin, SPdI, Akmal Jamaluddin, Ramdhan Jamaluddin dan Dzulfikar Jamaluddin yang telah banyak memberikan do‟a, dukungan dan kasih sayangnya demi kelancaran studi penulis.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2015
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ii
DAFTAR GAMBAR ii
DAFTAR LAMPIRAN ii
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Perumusan Masalah 3
Tujuan Penelitian 3
Manfaat Penelitian 4
Hipotesis 4
TINJAUAN PUSTAKA 4
Klasifikasi dan Morfologi 4
Sistem Pertahanan Tubuh Ikan 5
Imunostimulan 6
CpG Oligodeoxynucleotides (CpG DNA) 7
METODE 12
Waktu dan Tempat Penelitian 12
Bahan 12
Alat 12
Prosedur Analisis Data 12
Hewan Uji 12
Preparasi CpG Oligodeoxynucleotides (CpG-DNA) 2133 12
Rancangan Penelitian 13
Pemberian CpG DNA 13
Pengamatan Ekspresi Gen Imun 13
Ekstraksi RNA 13
Uji Kualitas RNA Hasil Ekstraksi 14
Sintesis cDNA dengan RT PCR 14
Semi-Quantitatif Analysis 14
Elektroforesis 15
Analisis Data 15
HASIL DAN PEMBAHASAN 16
Hasil Ekstraksi RNA Head Kidney Ikan Kerapu Macan 16
Ekspresi Gen Imun Interleukin 1β (IL-1β) 17
Ekspresi Gen Imun Cyclooxygenase2 (COX-2) 18
Ekspresi Gen Imun Tumor Necrosis Factorα1 (TNF-α1) 19
Analisis Ekspresi Gen Imun Menggunakan Uji T 20
SIMPULAN 24
DAFTAR PUSTAKA 24
DAFTAR GAMBAR
1 Morfologi Ikan Kerapu Macan (E.fuscoguttatus) 4
2 Ligan yang Dikenali oleh TLR 10
3 Mekanisme Pengenalan CpG DNA oleh TLR 9 11
4 Skema Rancangan Penelitian 13
5 Amplifikasi PCR β aktin RNA HK. E. fuscoguttatus 16 6 Amplifikasi RNA Gen IL1β E. fuscoguttatus 17 7 Amplifikasi RNA Gen COX-2 E. fuscoguttatus 18 8 Amplifikasi RNA Gen TNFα1 E. fuscoguttatus 19
9 Diagram Batang Ekspresi Gen Imun COX-2 20
10 Diagram Batang Ekspresi Gen Imun IL1β 21 11 Diagram Batang Ekspresi Gen Imun TNFα1 22
DAFTAR LAMPIRAN
1 Klasifikasi dari CpG DNA 31
2 Komposisi Kit Pure Taq RTG PCR 32
3 Konsentrasi dan Tingkat Kemurnian RNA Hasil Ekstraksi dengan Gene
Quant 32
4 Nilai Luminescence Photostimulated Menggunakan Software UN
SCAN IT 33
5 Nilai luminescence photostimulated setelah di bagi dengan β aktin 33
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Ikan kerapu (Epinephelus) merupakan salah satu komoditas perikanan yang mempunyai nilai prospek yang cukup baik dipasaran, baik pasar domestik maupun pasar internasional. Jenis ikan kerapu yang mempunyai nilai jual tinggi dipasaran adalah ikan kerapu macan (Epinephelus fuscoguttatus). Ikan kerapu macan mempunyai nilai yang cukup menguntungkan diantaranya ikan kerapu macan merupakan makanan yang enak dan gurih serta disukai banyak orang. Secara ekonomi sangat menguntungkan dikarenakan harga ikan ini di pasaran cukup tinggi serta pertumbuhannya cepat dan dapat di produksi secara massal untuk memenuhi permintaan pasar ikan kerapu dalam keadaan hidup dan lain-lain. Ada tiga jenis ikan kerapu yang umum dipasarkan diwakili oleh genus:
Epinephelus, Cromileptes dan Plectropomus. Harga jual ikan kerapu hidup sangat
mahal sehingga merangsang pelaku usaha untuk membudidayakannya (Rimmer dkk. 2004). Salah satu jenis ikan kerapu yang mempunyai nilai ekonomis penting yaitu ikan kerapu macan (Epinephelus fuscoguttatus FORSSKAL) (Kani et al. 2012).
Usaha budidaya ikan kerapu macan (E. fuscoguttatus) sangat potensial untuk dikembangkan. Akan tetapi dalam pembudidayaannya, para petani juga sering mengalami beberapa kendala atau masalah. Permasalan yang utama adalah adanya serangan penyakit yang disebabkan oleh bakteri, virus, parasit, dan lain-lain. Para pembudidaya harus mengeluarkan biaya ekstra yang cukup besar untuk membeli obat-obatan kimia sebagai langkah mengatasi serangan penyakit. Untuk mengobati penyakit dari ikan kerapu macan khususnya yang disebabkan oleh mikroorganisme, biasanya para pembudidaya menggunakan berbagai jenis antibiotik seperti ampisilin, neosin, gentamisin, penisilin G, dan lain-lain. Fakta belakangan terungkap bahwa antibiotik yang umum digunakan para pembudidaya ikan untuk menyembuhkan penyakit bakterial ternyata menimbulkan strain baru bakteri yang resisten, sehingga tidak efektif dalam penanggulangan penyakit (Rantetondok 2002). Alternatif lain yang dapat dilakukan adalah penerapan vaksinasi, namun penggunaan vaksin disamping harganya mahal juga bersifat spesifik terhadap agen penyakit tertentu. Oleh karena itu diperlukan penggunaan zat lain yang dapat mencegah penyakit yang membantu meningkatkan kekebalan tubuh terhadap agen penyakit yang dikenal dengan imunostimulan. Penggunaan imunostimulan merupakan solusi yang paling aman sebagai upaya perlindungan terhadap serangan penyakit, karena dapat meningkatkan sistem kekebalan natural (innate immunity) dan kekebalan bawaan (adaptive immunity) pada ikan (Sakai 1999; Ortuno et al. 2002).
Salah satu jenis immunostimulan yang sangat potensial dan efektif dalam meningkatkan kekebalan tubuh mamalia, ikan dan udang adalah berupa sekuen nukleotida spesifik yang di sebut motif unmethylated cystidine phosphate
guanosine (CpG) (Krieg 2002; Tassakka dan Sakai 2004; Chen et al. 2007). Motif
2
atau mengenal CpG yang tidak termetilasi sehingga motif CpG diambil dari bakteri bukan dari mamalia.
Seiring dengan perkembangan teknologi dan tuntutan kebutuhan akan CpG ini semakin meningkat maka selanjutnya ditemukan imunostimulan DNA sintetik yang sekuennya menyerupai CpG DNA bakteri yang disebut CpG
oligodeoxynucleotides atau CpG-ODNs (Tokunaga et al. 1984).
Oligodeoxynucleotide sintetik ini mengandung CpG motif yang terdiri dari
sekuens pendek yang mengandung satu atau lebih motif CpG dan berperan sebagai ”danger signal” terhadap sistem imun vertebrata, memberikan
perlindungan terhadap infeksi bakteri, mengaktivasi Antigen Presenting Cells
(APCs) dan menginduksi respon imun tipe Th1. Secara garis besar CpG-ODNs diklasifikasikan menjadi tiga tipe yaitu D, K, dan C (dapat di lihat pada lampiran Tabel 1.). CpG-ODN yang berada dalam tipe yang sama bukan berarti bahwa CpG ODN ini memiliki sekuen spesifik pada organisme yang sama, namun boleh jadi tipe yang berbeda tetapi spesifik pada organisme yang sama. Misalnya sekuen motif “TTCGTT” dapat meningkatkan respon imun pada manusia namun tidak efektif meningkatkan respon imun pada ikan sedangkan motif “GACGTT”, “GTCGTT” atau “AACGTT” memiliki efek kekebalan pada ikan (Jorgensen et al. 2001). Telah ada beberapa penelitian mengenai CpG ini yang dilakukan pada ikan. Selain terjadi peningkatan respon imun, hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian CpG-ODN pada ikan Atlantik salmon (Salmon salar) juga dapat meningkatkan resistensi terhadap penyakit seperti amoebic gill disease (Bridle et al. 2003). Jorgensen et al (2003) memperlihatkan adanya peningkatan ketahanan tubuh ikan Atlantik salmon terhadap infeksi pancreatic necrosis virus setelah diberi CpG-ODN. CpG-ODN juga dapat berfungsi sebagai adjuvan pada goldfish (Kanellos et al. 1999).
Menurut penelitian Tasakka 2005, motif CpG ODN 1668 dengan sekuen “TCCATGACGTTCCTGATGCT” yang tergolong ke dalam tipe D spesifik terhadap ikan mas (Cyprinus carpio). Motif CpG ODN 2006 dengan sekuen “TTCGTCGTTTTGTCGTTTGTCGTT” yang tergolong ke dalam tipe K spesifik terhadap udang windu (Penaeus monodon) (Handoyo 2013 dan Nursida 2015). Hasil penelitian terbaru mengenai penggunaan CpG ODN ini yang dilakukan oleh Kani et al. (2012) adalah mengenai pengaruh pemberian CpG ODN terhadap ikan
kerapu macan dengan menggunakan CpG-ODN 1668
3 kekebalan tubuh. Ini adalah sekelompok molekul yang di bagi ke dalam keluarga seperti interleukin, limfokin, faktor pertumbuhan, interferon serta kemokin (Thomson 1994). Dalam melihat tingkat ekspresi, gen-gen imun yang cukup sering untuk diamati adalah gen interleukin 1β (IL-1β), tumour necrosis factor
(TNF-α1) serta cyclooxygenase (COX-2) (Tasakka 2005). Interleukin 1β (IL-1β) merupakan mediator kunci dalam menanggapi adanya serangan mikroba dan adanya jaringan yang terluka serta dapat merangsang respon sistem kekebalan tubuh dengan mengaktifkan limfosit atau dengan menginduksi pelepasan sitokin lain yang dapat mengaktifkan makrofag, sel NK dan limfosit serta menyusun berbagai respon imun dengan memulai ekspresi gen (Low et al. 2003). Tumour necrosis factor (TNF-α1) sama halnya dengan IL-1β merupakan respon imun utama yang dapat menginduksi ekspresi factor pertumbuhan autokrin lainnya, meningkatkan respon selular untuk faktor pertumbuhan dan menginduksi jalur sinyal yang dapat menyebabkan proliferasi (Tasakka 2005). Cyclooxygenase
(COX-2) merupakan enzim dalam bentuk indusibel dan tidak terdeteksi dalam semua jaringan normal, akan tetapi COX-2 dapat terinduksi oleh berbagai macam inflamasi dan stimulus mitogenik (Nilanjan et al. 2010).
Perumusan Masalah
Efektivitas penggunaan CpG-ODN sangat bergantung pada sekuen atau motif dari DNA sintetik tersebut. Misalnya CpG-ODN sebagai imunostimulan,
protective agent dan adjuvan vaksin pada vertebrata memiliki sekuens spesifik (optimal motif) yang berbeda antara satu spesies dengan spesies lainnya. Misalnya, sekuens ”TTCGTT” dapat meningkatkan respon imun pada manusia, tetapi sekuen ini tidak efektif meningkatkan respon imun pada ikan. CpG-ODN 1668 dengan sekuens (TCCATGACGTTCCTGATGCT) yang mengandung motif „GACGTT‟, CpG-ODN 2133 dengan sekuens (TCGTCGTTGGTTGTCGTTTTG GT) yang mengandung motif „GTCGTT‟ dan CpG-ODN 2006 dengan sekuen (TTCGTCGTTTTGTCGTTTGTCGTT) yang mengandung motif „GTCGTT‟ telah terbukti dapat meningkatkan kekebalan tubuh ikan dan udang (Tasakka dan Sakai, 2004). Hasil penelitian terbaru menunjukkan bahwa CpG-ODN 2133 ini dapat meningkatkan respon imun pada ikan kerapu macan (Epinephelus fuscoguttatus). Oleh karena itu, maka batasan masalah yang akan dibahas dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :
1. Apakah CpG ODN 2133 mampu meningkatkan ekspresi gen interleukin 1β (IL1β) ?
2. Apakah CpG ODN 2133 mampu meningkatkan ekspresi gen Cyclooxygenase 2
(COX-2) ?
3. Apakah CpG ODN 2133 mampu meningkatkan ekspresi gen tumour necrosis factor (TNF-α1) ?
Tujuan Penelitian
4
tumour necrosis factor (TNF-α1) pada ikan kerapu macan agar dapat dijadikan sebagai imunostimulan maupun adjuvan vaksin.
Manfaat Penelitian
Manfaat atau kegunaan penelitian ini salah satunya adalah untuk mengembangkan potensi CpG-ODNs sebagai imunostimulan, agen pertahanan terhadap serangan penyakit maupun sebagai adjuvant vaksin pada ikan kerapu macan yang sangat berguna dalam mencegah timbulnya penyakit ataupun mengatasi perluasan penyakit yang disebabkan oleh bakteri, virus maupun organisme patogen lainnya.
Hipotesis
Hipotesis dari penelitian ini adalah CpG-ODN 2133 mampu meningkatkan ekspresi gen interleukin 1β (IL1β), cyclooxygenase 2 (COX-2) dan tumour necrosis factor (TNF-α1).
TINJAUAN PUSTAKA
Klasifikasi dan Morfologi
Secara geografis, ikan kerapu macan terdistribusi pada wilayah Indo-Pasifik, termasuk laut merah namun tidak ditemukan di Teluk Persia, Hawaii atau Polinesia Perancis. Ikan kerapu macan dapat ditemukan di hampir semua kepulauan tropis lautan Indonesia dan Pasifik Barat (dari timur hingga Samoa dan Phoenix Island) sepanjang pantai timur Afrika hingga Mozambique, dan juga dilaporkan terdapat di Madagaskar, India, Thailand, Indonesia, Pantai tropis Australia, Jepang, Filipina, Papua Nugini dan Kaledonia Baru.
5 Tarwiyah 2001 mengklasifikasikan ikan kerapu macan (E. fuscoguttatus) ke dalam :
Species : Epinephelus fuscoguttatus
Bentuk badan ikan kerapu macan memanjang dan gepeng atau agak membulat. Mulut lebar serong ke atas dengan bibir bawah menonjol ke atas. Rahang bawah dan atas dilengkapi dengan gigi geretan berderet dua baris, lancip dan kuat serta ujung luar bagian depan adalah gigi yang terbesar. Sirip ekor umumnya membulat. Warna dasar sawo matang, perut bagian bawahnya agak putih dan pada badannya terdapat titik berwarna merah kecoklatan serta tampak pula 4-6 baris warna gelap yang melintang hingga ekornya. Badan tertutupi oleh sisik kecil mengkilap dan memiliki ciri-ciri loreng (Tarwiyah 2001).
Ikan kerapu macan muda umumnya hidup di perairan karang pantai dengan kedalaman 0,5-3 m. Selanjutnya menginjak dewasa beruaya ke perairan yang lebih dalam antara 7-40 m, biasanya perpindahan ini berlangsung pada siang dan senja hari. Habitat favorit larva ikan kerapu adalah perairan pantai dekat muara sungai dengan dasar pasir berkarang yang banyak ditumbuhi padang lamun. Telur dan larva bersifat pelagis (berada di dalam kolam air), sementara itu ikan kerapu muda hingga dewasa bersifat demersal atau berdiam di dasar kolam (Apdhaliah 2009).
Sistem Pertahanan Tubuh Ikan
6
Menurut Almendras dan Catap (2002) mengatakan bahwa Sistem pertahanan non spesifik pada ikan meliputi fisik (kulit, sisik, lendir), humoral (lisozim, asam lambung, laktoferin, komplemen, interferon) serta selular (fagosit, sel NK). Sistem imun spesifik pada dasarnya merupakan mekanisme interaksi antara sel limfosit dan fagosit. Respon spesifik ini diawali dengan kerja sel-sel fagosit/ makrofag atau antigen presenting cell (APC) yang memproses dan mempresentasikannya pada sel-sel imun spesifik (sel T dan sel T) (Kresno 2001; Kollner et al. 2002). Sistem imun ikan mengenal dan merespon hanya pada bagian kecil dari molekul besar antigen yang dikenal dengan istilah antigenic determinant atau hapten. Sel limfosit mempunyai reseptor yang secara spesifik mengenal dan berikatan dengan antigen (Almendras dan Catap 2002).
Imunostimulan
Imunostimulan merupakan zat atau senyawa tertentu yang dapat meningkatkan mekanisme pertahanan tubuh baik secara spesifik maupun non spesifik dan terjadi induksi non spesifik baik mekanisme pertahanan seluler maupun humoral (Anderson 1993). Pertahanan non spesifik terhadap antigen ini disebut paramunitas dan zat berhubungan dengan penginduksi disebut paraimunitas. Induktor semacam ini biasanya tidak atau sedikit sekali kerja antigennya, akan tetapi sebagian besar bekerja sebagai mitogen yaitu meningkatkan proliferasi sel yang berperan pada imunitas. Sel tujuan adalah
makrofag, granulosit, limfosit T dan B, karena induktor paraimunitas ini bekerja menstimulasi mekanisme pertahanan seluler. Mitogen ini dapat bekerja langsung maupun tak langsung (misalnya melalui sistem komplemen atau limfosit, melalui produksi interferon atau enzim lisosomal) untuk meningkatkan phagositosis mikro dan makro. Mekanisme pertahanan spesifik maupun non spesifik umumnya saling berpengaruh. Dalam hal ini pengaruh pada beberapa sistem pertahanan mungkin terjadi, hingga mempersulit penggunaan imunomodulator, dalam praktek. imunostimulan juga berfungsi memperbaiki fungsi sistem imun dengan menggunakan bahan yang merangsang sistem imun tersebut (Baratawidjaja 2006). Menurut Brown (2000) imunostimulan merupakan bahan yang bisa meningkatkan resistensi organisme terhadap infeksi patogen. Pemberian imunostimulan dimaksudkan untuk mengaktifkan sistem imun non spesifik sel seperti makrofag pada vertebrata dan haemosit pada avertebrata (Dugger dan Jory 1999).
Secara umum, imunostimulan meningkatkan aktivitas makrofag, komplemen, fagosit, limfosit, dan non spesifik sel sitotoksik, mengakibatkan perlawanan dan perlindungan terhadap berbagai penyakit. Beberapa yang menjadi pertimbangan dalam menentukan suatu bahan disebut imunostimulan, yaitu penggunannya efektif dan bersifat ramah lingkungan, tidak memiliki efek samping serta dapat memberikan berbagai perlindungan dan dapat meningkatkan sistem pertahanan terhadap berbagai penyakit. Banyak jenis imunostimulan yang sering digunakan untuk meningkatkan sistem kekebalan tubuh dari hewan-hewan akuatik seperti β-Glucan, Chito-Oligosacharida (COS), herbal mix dan DNA sintetik. DNA sintetik yang paling efektif meningkatkan respon imun mamalia, ikan dan udang adalah nukleotida spesifik yang disebut motif unmethylated
7
CpG oligodeoxynucleotides (CpG-ODN)s Sejarah dan Peranan CpG-ODNs
CpG-ODNs merupakan DNA sintetik, disamping berfungsi sebagai materi pengkodean genetik, CpG-ODN mempunyai efek menstimulasi kekebalan tubuh, sebagai agen pertahanan terhadap serangan patogen dan sebagai adjuvan vaksin. Sejak 1893, telah diakui bahwa toksin Coley, campuran lisat sel bakteri, memiliki sifat imunostimulan yang dapat mengurangi perkembangan dari beberapa karsinoma. Tokunaga et al. (1984), khusus mengidentifikasi DNA bakteri sebagai komponen yang mendasari lisat yang menimbulkan respon. Selanjutnya Tokunaga
et al. (1992), Yamamoto et al. (1994) dan Krieg et al. (1995) menunjukkan bahwa motif CpG dalam DNA bakteri bertanggung jawab atas efek imunostimulan dan dikembangkan menjadi CpG-ODN sintetis.
Oligodeoxynucleotides CpG (atau CpG-ODN)s beruntai tunggal pendek,
molekul DNA sintetis yang mengandung "C" Citosin diikuti dengan phospat ”P" dan”guanin "G". Oligodeoxynucleotides sintetis (ODNs) dan DNA bakteri yang mengandung nucleotides CpG tidak termetilasi diapit oleh urutan basa spesifik (CpG-DNA) memiliki efek imunomodulator pada limfosit B, makrofag, sel dendritik, dan sel-sel pembunuh alami. DNA sintetis oligodeoxynucleotides mengandung CpG-motif yang tepat (CpG-ODNs), bisa menirukan efek imunostimulan dari DNA bakteri (Krieg et al. 1995).
Kehadiran CpG yang tidak termetilasi dengan urutan dinukleotida yang mengapit CpG juga berperan untuk induksi aktivitas imunostimulan. Penelitian awal menunjukkan bahwa efektivitas motif CpG bervariasi dari spesies ke spesies. Motif CpG yang paling efektif mengaktifkan sel-sel pada tikus dan kurang menstimulasi kekebalan tubuh pada manusia, disebabkan karena perbedaan antara spesies dalam mengenal CpG (Krieg dan Hartmann 2000). Sel darah mononuklear perifer (PBMC) manusia berpotensi diaktifkan oleh ODN berisi motif 'GTCGTT', 'AACGTT' atau 'TTCGTT' (Krieg 2002).
8
Sekuen Spesifik CpG-ODN Terhadap Ikan
CpG-ODNs secara garis besar diklasifikasikan menjadi tiga jenis yaitu jenis D, K dan C (lampiran 1.). CpG ODN tipe K memiliki tipe tulang punggung
phosphorothioate dan terdapat beberapa motif CpG (Krieg et al. 2000). CpG ODN tipe D memiliki tipe tulang punggung berupa fosfodiester-phosphorothioate
backbone dan mengandung purin hexameric tunggal/ pirimidin/ CpG/ purin/
pirimidin motif diapit oleh basis komplementer yang membentuk struktur stem-loop tertutup pada ujung 3' oleh ujung Poli-G. CpG ODN tipe C awalnya digambarkan untuk mengekspresikan sebuah 'TCGTCG' 5 di ujung dan sering mengandung motif tipe K internal (seperti 'GTCGTG') yang tertanam di urutan
palindrome (Verthelyi et al. 2001; Hartmann et al. 2000; Hartmann dan Krieg 2000).
Penggolongan tipe CpG-ODN sesuai petunjuk diatas memberi petunjuk bahwa CpG-ODN 2133 termasuk dalam tipe C, dan CpG-ODN 2006 tergolong berbeda; motif 'GTCGTT' adalah optimal untuk stimulasi in vitro proliferasi
limfosit pada spesies dalam negeri, termasuk sapi, domba, kambing, kuda, babi, anjing, kucing dan ayam, sementara motif 'GACGTT' sangat optimal untuk kelinci inbrida dan tikus dan pengujian in vitro dan in vivo pada ikan telah mengungkapkan bahwa oligodeoxynucleotides berisi motif 'GACGTT', 'GTCGTT' atau 'AACGTT' memiliki efek kekebalan pada ikan (Jorgensen et al. 2001).
CpG-ODN sebagai imunostimulan, protective agent dan adjuvan vaksin pada vertebrata memiliki sekuen spesifik/motif optimal yang berbeda antara satu spesies dengan spesies lainnya. Contohnya sekuen ”TTCGTT” dapat meningkatkan respon imun pada manusia, tetapi sekuen ini tidak efektif meningkatkan respon imun pada ikan (Bauer et al. 1999; Hartmann dan Krieg 2000). Pada sekuen CpG-ODN yang lain ternyata dapat bersifat imunostimulan pada ikan, misalnya meningkatkan aktivitas sel-sel fagosit pada ikan grass carp,
common carp dan rainbow trout dan beberapa sekuen CpG-ODN yang dapat
meningkatkan respon imun pada krustasea.
9
Mekanisme Pengenalan CpG-ODN Oleh Tubuh
Kemampuan untuk merasakan adanya mikroorganisme yang dapat menimbulkan infeksi yang berpotensi bahaya adalah sifat sel, jaringan dan cairan tubuh pada seluruh organisme multiselular. Proses pengenalan ini disebut pengenalan imun bawaan dan merupakan langkah krusial pertama yang memicu serangkaian kejadian rumit, di mana tubuh melindungi diri dari infeksi. Reseptor biasanya mengenali komponen mikroorganisme yang tidak ditemukan pada sel pejamu, misalnya komponen dinding sel bakteri, flagella bakteri atau asam nukleat virus. Molekul sasaran ini diberi nama Pathogen Associated Molecular
Pattern (PAMP), dan reseptor yang mengenali molekul ini disebut reseptor
pengenal pola (Pattern Reconition Receptor/ PRR). Ikatan PRR dan PAMP menimbulkan aktivasi jalur sinyal intraselular, menghasilkan perubahan transkripsi gen dalam nucleus dan akhirnya seluruh respons selular (Schnare et al.
2001; Vasselon dan Detmers 2002; Wibawan dan Soejoedono 2013).
Mekanisme molekul DNA bakteri mengaktifkan sel-sel kekebalan terungkap dengan penemuan Toll-Like Receptors (TLR). TLR disebut demikian karena memiliki kesamaan dengan gen bernama Toll, pertama kali diidentifikasi pada Drosophilla. TLR memainkan peranan penting dalam pengenalan patogen dan berperan terhadap sistem kekebalan tubuh bawaan. TLR adalah PRR yang pertama kali ditemukan dan mewakili contoh umum reseptor pengenal imun bawaan, merupakan trans membran protein yang diekspresikan pada permukaan sel dan mengenali patogen terkait pola molekul (PAMPs) yang disajikan pada agen infeksi dan memulai sinyal untuk menginduksi produksi sitokin yang diperlukan untuk kekebalan bawaan dan kekebalan adaptif berikutnya. TLR berhubungan dengan berbagai molekul adaptor yang membantu mengubah pengenalan mikroba menjadi sinyal, yang mengaktivasi gen transkripsi spesifik dalam sel. Studi pada tikus dan manusia menunjukkan bahwa reseptor ini menengahi respon seluler untuk dinucleotides CpG unmethylated dalam DNA bakteri untuk merangsang respon imun bawaan.
TLRs merupakan kelas protein yang memainkan peran kunci dalam sistem kekebalaan bawaan. Mereka adalah tunggal, membran-spanning, non-katalitik reseptor yang mengenali molekul struktural yang berasal dari mikroba. Setelah mikroba ini telah melewati hambatan fisik seperti kulit atau mukosa saluran usus, mereka diakui oleh TLRs, yang mengaktifkan respon sel kekebalan tubuh. Berbagai TLRs (TLR1–TLR10) menunjukkan pola ekspresi yang berbeda (Gambar 4). Gen ini secara istimewa disajikan dalam jaringan sel kaya kekebalan, seperti limpa, kelenjar getah bening, sumsum tulang dan leukosit darah perifel. Perbedaan ekspresi TLRs dalam mengenal CpG sangat tergantung pada pola molekul patogen terkait (PAMPs) yang disajikan pada frekuensi tinggi oleh mikroorganisme menular tapi jarang oleh sel inang (Underhill dan Ozinsky 2002). Sebagai contoh, lipopolysaccaride (LPS) hadir dalam membran permukaan bakteri Gram-negatif melibatkan kompleks TLR4/MD-2, sementara peptidoglikan (PGN) dan lipoprotein bakteri (BLPs) hadir dalam dinding sel bakteri Gram-positif terlibat TLR2, sedangkan reseptor transmembran yang mampu mengenali
unmethylated CpG oligonukleotida dalam DNA bakteri adalah TLR9 (Akira et al.
10
Fungsi semua sinyal TLRs ditandai melalui jalur umum yang melibatkan diferensiasi myeloid penanda 88 (MyD88), IL-1R-terkait kinase (Irak), TNFR terkait faktor 6 (TRAF6), TGFb-diaktifkan kinase1 (TAK1) dan kinase dari IKB (IKK), IKB, dan NF-kB. Jadi, TLRs dianggap sebagai reseptor pengenalan pola (PRR) (Underhill dan Ozinsky 2002).
Bukti bahwa pengakuan CpG dimediasi oleh TLR9 disajikan dalam penelitian yang melibatkan tikus KO TLR9 (Hemmi etal, 2000). Bukti lain pada manusia juga menunjukkan bahwa TLR9 khusus mengakui DNA CpG (Takeshita
et al. 2004). TLR9 dinyatakan dalam sel B dan CD123 + sel dendritik (sel dendritik plasmacytoid), sedangkan pada tikus TLR9 dinyatakan dalam garis keturunan myeloid termasuk sel dendritik myeloid, monosit, dan makrofag. TLR9 hadir pada membran endosome dan tidak seperti reseptor TLR lainnya yang hadir pada membran sel (Takeshita et al. 2001). CpG DNA diambil oleh sel-sel imun melalui reseptor-dimediasi endositosis dan berinteraksi dengan TLR9 hadir dalam vesikel endocytic (Hemmi et al. 2000). Pengikatan antara CpG DNA dengan reseptor membran spesifik memicu sinyal-sinyal yang terkait yang terjadi di dalam endosome. Pembentukan dan pematangan CpG DNA di dalam endosome di atur oleh PI3K dan Rab5. Setelah endosome mengalami maturasi atau kematangan maka ligan akan mengikat CpG lalu protein-protein adaptor seperti Myd88, IRAK dan TRAF6 akan menarik atau merekrut sinyal mediator intraselular yaitu TAK1, yang pada gilirannya akan mengaktifkan faktor transkripsi seperti NF-kB dan AP-1. NF-kB (Nuclear Factor Kappa B) adalah kunci faktor transkripsi untuk mengatur respon gen-gen sitokin maupun gen-gen yang terlibat dengan sitokin. Biasanya, faktor transkripsi ini berada di sitoplasma dan tidak aktif karena berikatan pada inhibitor IkB. Namun demikian, aktivasi berbagai PRR (Reseptor Pengenal Pola) menyebabkan penghancuran IkB oleh proteosom dan NF-kB kemudian masuk ke dalam nukleus dan menghidupkan berbagai komponen antibakteri, antivirus serta respon inflamasi (Playfair and
11 Chain 2012). Faktor transkripsi ini yang akan menginduksi terjadinya ekspresi sitokin (Gambar 3). Sampai saat ini, TLR 9 adalah satu-satunya yang diketahui sebagai reseptor dari CpG DNA. Menurut Kerkmann et al. 2003 menunjukkan bahwa kelas yang berbeda dari tiap CpG DNA memanfaatkan jalur sinyal yang berbeda serta masih adanya jalur sinyal yang belum diketahui pasti jalur kaskadenya.
12
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan mulai bulan Maret 2014 hingga November 2014 di Laboratorium Bioteknologi Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Payau (BPPBAP) Maros Makassar.
Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kerapu macan, larutan
Phospat Buffer Saline (PBS), imunostimulan berupa CpG-ODN 2133
(TCGTCGTTGGTTGTCTTTTGGT) (Krieg 2000) yang diperoleh dari PT. Genetika Science Indonesia. Ekstraksi RNA menggunakan kit RNeasy mini Qiagen, ethanol 70%, kit Pure Taq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healtheare), kit
Ready-To-Go You-Prime Fisrt Strand Beads (GE Healthcare). Primer IL-1β F 5‟
-CGACATGGTGCGGTTTCTCT-3‟ IL-1β R 5‟-CTCTGCTGTGCTGATGTACC AGTT-3‟, COX-2 F 5‟-TTCCCAGCACTTCACCCACC-3‟ COX-2 R 5‟-AACG GTCAGAGTCGGGAACA-3‟, TNF-α1 F 5‟-GACGCAATCAGGCCAAAGA GAA -3‟ TNF-α1 R 5‟-GATGAAGCAGATGTCGGTCCGCAG-3‟ dan β-actin F 5‟-CCATCCAGGCCGTGTTGTCC-3‟ β-actin R 5‟-AGGAGGAGGGCTGGAA GAA-3‟.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah akuarium, suntik, mortar, pipet mikro, tabung mikro, timbangan, gunting bedah, pinset, syringe, gelas ukur,
Labu Erlenmeyer, spatula, oven, microwave, mesin Polymerase Chain Reaction GenAmp 2700 (Applied Biosystem)), toolbox, water bath, alat elektroforesis,
genequan, sentrifus dan dokumentasi gel biometra.
Prosedur Analisis Data Hewan Uji
Hewan uji yang digunakan adalah ikan kerapu macan sebanyak 40 ekor dengan berat rata-rata 7-10 gr. Sebelumnya hewan uji di tampung pada bak fiber volume 1 ton untuk proses adaptasi. Ikan kerapu macan ini dipelihara dalam aquarium berkapasitas 50 L yang sebelumnya disucihamakan dengan klorin 5 ppm, kemudiaan diisi air laut 20 L. Pakan yang diberikan adalah pakan komersil dengan kandungan protein 36%. Dosis pemberian pakan adalah 5% dari berat biomas dengan frekuensi pemberian pakan 2 kali yaitu pagi dan sore.
Preparasi CpG Oligodeoxynucleotides (CpG-ODN) 2133
13
Pemberian CpG-ODN pada hewan uji dilakukan melalui injeksi yaitu disuntikkan ke ikan kerapu macan dengan dosis 10 µg/ml (Kani et al. 2012). Ikan kerapu macan kontrol diinjeksi dengan PBS dengan volume yang sama. Penyuntikan dilakukan pada bagian intramuscular dengan menggunakan spoit 1 mL (needle 26 gauge x ½”). Untuk pengamatan hasil ekspresi gen imun yang terdiri dari IL-1β, COX-2 dan TNF-α1 dilakukan pada hari ke -7 setelah injeksi.
Pengamatan Ekspresi Gen Ekstraksi RNA
RNA total diekstraksi dari head kidney ikan kerapu macan dengan menggunakan RNeasy Mini Kit (Qiagen), sesuai instruksi perusahaan. Sebanyak 30 mg organ ginjal ikan kerapu macan dihaluskan menggunakan mortar dan ditambahkan dengan 350 µl buffer RLT. Larutan dimasukkan ke dalam tabung mikro 1.5 ml bebas RNase kemudian dihomogenisasi dengan syringe dan needle
20 gauge sebanyak 5 kali dan selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10.000
rpm selama 3 menit pada suhu 20°C. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung mikro 1.5 ml yang baru dan ditambahkan 1 kali volume ethanol 70% yaitu sebanyak 350 µl, kemudian dihomogenkan perlahan dengan menggunakan pipet. 500 µl sampel dipindahkan ke dalam spin column volume 2 ml bebas RNase, kemudian disentrifugasi 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Proses pencucian menggunakan 500 µl buffer RW 1, sentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Larutan pencuci pada tabung dibuang dan dengan tabung mikro yang sama, ditambahkan 500 µl buffer RPE ke dalam spin column kemudian disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Pencucian dengan buffer RPE dilakukan sebanyak 2 kali dan selanjutnya spin column disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 10.000 rpm untuk memastikan tidak ada buffer RPE yang tersisa di spin column. Spin column RNeasy dipindahkan ke dalam tabung mikro bebas RNase volume 1.5 µl kemudian ditambahkan 80 µl air bebas
14
RNase ke dalam spin column lalu didiamkan selama 2 menit kemudian disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 10.000 rpm. Cairan yang tertampung pada tabung mikro merupakan hasil ekstraksi RNA yang akan digunakan untuk tahap selanjutnya.
Uji Kualitas RNA Hasil Ekstraksi
Kualitas hasil ekstraksi RNA diuji secara kualitatif untuk mengetahui tingkat kemurniannya dengan genequan 1000 pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. RNA dengan tingkat kemurnian baik ditunjukkan oleh rasio A260/280 lebih dari 2.0 (Sambrook et al. 1989). Selain itu RNA juga diuji secara kualitatif dengan PCR menggunakan primer β-actin.
Sintesis cDNA dengan RT-PCR
Sintesis DNA komplementer (complementary DNA, cDNA). Konsentrasi RNA dibuat 3 µg dalam 30 µl DEPC 0,1 % kemudian dihomogenkan dengan vortex dengan kecepatan rendah. Tabung mikro berisi RNA dimasukkan dalam inkubator dengan suhu 65oC selama 10 menit. Selanjutnya tabung mikro dimasukkan ke dalam es selama 2 menit, kemudian RNA dimasukkan ke dalam tabung first strand reaction mix beads (GE Healthcare) yang telah berisi 2 butir bola putih. Primer oligo (dT) 5‟-GTA ATA CGA ATA ACT ATA GGG CAC GCG TGG TCG ACG GCC CGG GCT GGT TTT TTT TTT TTT TTT T-3‟ dengan konsentrasi 1 µg/3 µl ditambahkan sebanyak 3 µl ke dalam reaksi, kemudian dibiarkan selama 1 menit. Tabung mikro diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam, kemudian cDNA ditambahkan SDW sebanyak 50 µl.
Semi-Quantitative Analysis
15
Elektroforesis
Untuk melihat keberhasilan amplifikasi fragmen DNA target, hasil PCR dielektroforesis dengan menggunakan gel agarose 2,0 % serta marker VC 100 bp Plus DNA Ladder (Vivantis) kemudian didokumentasikan dengan Gel
Documentation System (Biometra).
Analisis Data
16
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Ekstraksi RNA Head Kidney Ikan Kerapu Macan (E. fuscoguttatus)
Ekspresi konstitutif dari gen-gen imun kerapu ditemukan di hampir semua sampel yang diperiksa termasuk jaringan perifer dan daerah yang berbeda dari otak. Pada jaringan perifer kerapu, ekspresi tinggi ditemukan dalam limpa, hati, ginjal dan head kidney serta ekspresi rendah terdeteksi pada trunk kidney, red muscle, insang, usus posterior, timus dan perut (Dan-Qi L et al. 2007).
Untuk memastikan bahwa hasil ektraksi yang dilakukan berhasil mengisolasi RNA head kidney ikan kerapu macan, dilakukan ampilifikasi PCR dengan menggunakan primer spesifik gen penyandi β-aktin ikan kerapu. β-aktin digunakan untuk memastikan keberadaan RNA maupun DNA hasil ekstraksi karena gen β-aktin disebut juga sebagai House keeping gene yang artinya gen ini diekspresikan secara terus menerus pada semua sel. Pendaran pita gen β-aktin yang muncul pada gel agarosa yang divisualisasi dengan sinar uv menandakan bahwa proses ekstraksi yang dilakukan berhasil mengisolasi RNA ikan kerapu macan.
Berdasarkan hasil amplifikasi dengan primer β-aktin menggunakan PCR, diperoleh amplikon gen β-aktin ikan kerapu berukuran sekitar 500 bp yang jelas terlihat pada semua sampel baik pada perlakuan CpG maupun pada perlakuan PBS sebagai kontrol (Gambar 5).
Gambar 5. Amplifikasi PCR β-aktin cDNA HK E. fuscoguttatus. Sumur 1 (M); marker 100 bp, sumur 2-6 (C1-C5); perlakuan CpG, sumur 7-11 (P1-P5); perlakuan PBS sebagai kontrol.
Selain uji secara kualitatif untuk β-actin, dilakukan juga uji secara kuantitatif dengan menggunakan Genequant 1000 pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Panjang gelombang 260 nm merupakan serapan maksimum untuk asam nukleat sedangkan panjang gelombang 280 nm merupakan serapan
M C1 C2 C3 C4 C5 P1 P2 P3 P4 P5
17 maksimum untuk protein. Kemurnian DNA ditentukan melalui perbandingan nilai absorbansi 260 nm dengan 280 nm.
Pengukuran kemurnian RNA pada nisbah A260/A280 seharusnya memberikan nilai 2.0 untuk menunjukkan bahwa sampel RNA yang diekstrak telah murni dari protein (Aranda et al. 2009). Konsentrasi total RNA hasil ekstraksi dengan Genequant 1000 cukup berfluktuasi pada masing-masing sampel. Konsentrasi total RNA hasil ekstraksi tertinggi terlihat pada perlakuan PBS sampel 5 yaitu sebesar 261.6 µg/µl dan terendah pada perlakuan PBS sampel 1 sebesar 53.2 µg/ µl dengan tingkat kemurnian 260/280 yaitu pada nilai terendah 1.74 dan nilai kemurnian tertinggi yaitu 1.98 (Lampiran 2). Menurut Adipura et al. 2012 menyatakan bahwa ekstraksi RNA dengan menggunakan kit komersial mengandalkan kerja membran silika untuk mengikat RNA total dan kemudian mencuci inhibitor-inhibitor melalui membran tersebut sehingga dihasilkan RNA dengan kemurnian yang tinggi. Kemurnian DNA atau RNA dan keutuhannya sangat berpengaruh terhadap keberhasilan amplifikasi PCR. DNA cetakan yang banyak mengalami fragmentasi dapat menghilangkan situs penempelan primer (Runtunuwu et al. 2004). Salah satu penyebab tidak menempelnya primer adalah karena kualitas DNA kurang baik yang mengandung kontaminan dan metabolit lain seperti fenol maupun protein. Kontaminan dalam jumlah yang signifikan dapat mempengaruhi penempelan primer pada DNA cetakan (Waldron dan Doherty 2010).
Ekspresi Gen Imun Interleukin 1β (IL-1β)
Untuk mendapatkan informasi mengenai tingkat ekspresi gen IL-1β, digunakan sepasang primer IL-1β. Visualisasi gel elektroforesis memperlihatkan pendaran pita cDNA pada ukuran sekitar 400 bp.
Gambar 6. Amplifikasi cDNA gen IL-1β E. fuscoguttatus. Sumur 1 (M); marker 100 bp, sumur 2-6 (C1-C5); perlakuan CpG, sumur 7-11 (P1-P5); perlakuan PBS sebagai kontrol.
1000 bp
500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp
18
Pada hasil gambar di atas, jelas diperoleh pita hasil ekspresi gen yang lebih tebal pada sumur C1-C5 yaitu perlakuan CpG dibandingkan pada sumur P1-P5 perlakuan PBS sebagai kontrol. Adanya pita yang lebih tebal yang diperoleh dari perlakuan CpG menunjukkan hasil yang bagus dibandingkan perlakuan PBS sebagai kontrol dikarenakan CpG mampu merangsang peningkatan ekspresi gen dari IL-1β. IL-1β merupakan mediator kunci dalam menanggapi adanya serangan mikroba dan adanya jaringan yang terluka serta dapat merangsang respon sistem kekebalan tubuh dengan mengaktifkan limfosit atau dengan menginduksi pelepasan sitokin lain yang dapat mengaktifkan makrofag, sel NK dan limfosit serta menyusun berbagai respon imun dengan memulai ekspresi gen (Low et al. 2003).
Ekspresi Gen Imun Cyclooxygenase 2 (COX-2)
Untuk mendapatkan informasi mengenai tingkat ekspresi gen COX-2, digunakan sepasang primer COX-2. Visualisasi gel elektroforesis memperlihatkan pendaran pita cDNA pada ukuran sekitar 300 bp.
Gambar 7. Amplifikasi cDNA gen COX-2 E. fuscoguttatus. Sumur 1 (M); marker 100 bp, sumur 2-6 (C1-C5); perlakuan CpG, sumur 7-11 (P1-P5); perlakuan PBS sebagai kontrol.
Pada hasil gambar di atas, jelas diperoleh pita hasil ekspresi gen yang lebih tebal atau jelas pada sumur C1-C5 yaitu perlakuan CpG dibandingkan dengan sumur P1-P5 perlakuan PBS sebagai kontrol. Adanya pita yang lebih tebal yang diperoleh dari perlakuan CpG menunjukkan hasil yang bagus dibandingkan perlakuan PBS sebagai kontrol dikarenakan CpG mampu merangsang peningkatan ekspresi gen dari COX-2. COX-2 merupakan enzim dalam bentuk indusibel dan tidak terdeteksi dalam semua jaringan normal, akan tetapi COX-2 dapat terinduksi oleh berbagai macam inflamasi dan stimulus mitogenik (Nilanjan
et al. 2010).
M C1 C2 C3 C4 C5 P1 P2 P3 P4 P5
19
Ekspresi Gen Imun Tumor Necrosis Factorα1 (TNF-α1)
Tumor Necrosis Factor (TNF-α1) merupakan sitokin yang disekresikan oleh
makrofag sehingga memiliki peranan penting dalam terjadinya inflamasi (peradangan).
Untuk mendapatkan informasi mengenai tingkat ekspresi gen TNF-α1, digunakan sepasang primer TNF-α1. Visualisasi gel elektroforesis memperlihatkan pendaran pita cDNA pada ukuran sekitar 100 bp.
Menurut Grimble et al. (2002) menyatakan bahwa tumor necrosis factor adalah salah satu dari kelompok sitokin proinflamasi yang memiliki efek luas yaitu dapat menyebabkan hilangnya jaringan adiposa, meningkatkan suhu tubuh, mengurangi nafsu makan, dan dapat merangsang produksi beragam sitokin imunomodulator dan molekul oksidan. Efek ini menciptakan lingkungan yang tidak bersahabat untuk menyerang patogen, memberikan substrat untuk sistem kekebalan tubuh dari sumber endogen, serta meningkatkan dan memodifikasi aktivitas sistem kekebalan tubuh.
Gambar 8. Amplifikasi cDNA gen TNF-α1 E. fuscoguttatus. Sumur 1 (M); marker 100 bp, sumur 2-6 (C1-C5); perlakuan CpG, sumur 7-11 (P1-P5); perlakuan PBS sebagai kontrol.
Pada hasil gambar di atas, diperoleh pita hasil ekspresi gen yang hampir sama antara sumur C1-C5 yaitu perlakuan CpG dibandingkan dengan sumur P1-P5 perlakuan PBS sebagai kontrol.
Untuk melihat adanya perbedaan nilai hasil ekspresi gennya, hasil gambar-gambar diatas dimasukkan ke dalam software UN SCAN IT.
M C1 C2 C3 C4 C5 P1 P2 P3 P4 P5
1000 bp
20
Analisis Ekspresi Gen Imun dengan Menggunakan Uji T Student
Nilai luminescence photostimulated yang diperoleh setelah memasukkan gambar hasil ekspresi gen IL-1β, COX-2 dan TNF-α1 (yang sudah disuntikkan CpG DNA) menggunakan software UN SCAN IT berdasarkan pola ketebalan fragmen dapat dilihat secara lengkap pada lampiran 4. Nilai total pada gen β-aktin
setelah penyuntikan CpG DNA yaitu 62202 sedangkan total nilai yang hanya disuntikkan PBS yaitu 61689, nilai total pada gen IL-1β setelah penyuntikan CpG DNA yaitu 107592 sedangkan total nilai yang hanya disuntikkan PBS 89207, nilai total pada gen COX-2 setelah penyuntikan CpG DNA yaitu 113684 sedangkan total nilai yang hanya disuntikkan PBS 95610 dan nilai total pada gen TNF-α1 setelah penyuntikan CpG DNA yaitu 54818 sedangkan total nilai yang hanya disuntikkan PBS yaitu 52062. Berdasarkan nilai total diatas, terjadi peningkatan tingkat ekspresi gen-gen imun antara sampel yang disuntikkan larutan PBS dengan yang disuntikkan CpG.
Untuk melihat perbedaan antara sampel yang disuntikkan larutan PBS dan yang disuntikkan CpG DNA, angka-angka yang diperoleh diatas dimasukkan ke dalam uji SPSS untuk di uji T student (Lampiran 6.) kemudian dibuat diagram
Berdasarkan gambar di atas, diketahui bahwa hasil dengan perlakuan CpG mempunyai nilai rata-rata lebih tinggi yaitu 1.73666 dengan nilai standar eror 0.03785 dibandingkan dengan perlakuan PBS sebagai kontrol yaitu 1.45592 dengan standar nilai eror 0.06105. Kemudian dilihat dari uji T nya yaitu pemberian imunostimulan berupa penyuntikan CpG DNA memberikan pengaruh
21
yang nyata dibandingkan penyuntikan dengan PBS sebagai kontrol (*P<0.05) dengan nilai yang diperoleh 0.008<0.05.
Siklooksigenase 2 (COX-2) adalah induksi sintasan prostaglandin endoperoxide H yang memberikan kontribusi untuk mengubah asam arakidonat untuk prostaglandin H2 (PGH2), PGH2 memainkan peran penting dalam berbagai proses biologis seperti modulasi respon imun pada mamalia (Harris et al. 2002). Baru-baru ini, Buchmann et al. (2004) mengatakan bahwa fungsi prostaglandin dalam regulasi imun pada kulit rainbow trout setelah terjadi infeksi Gyrodactylus
salaries. Fast et al. (2005) juga melaporkan bahwa prostaglandin E2 menghambat
ekspresi beberapa gen kekebalan terkait salmonid termasuk IL-1β, COX-2 dan MHC I dan II, ini menunjukkan sel inang yang mampu mengontrol produk dari PG oleh mekanisme umpan balik negatif mediasi PGE2 melalui down-regulasi COX-2 pada ikan. Tidak ada perubahan ekspresi COX-2 yang diamati setelah Gyrodactylus, sementara tidak di infeksi sekunder.
Gambar 10. Diagram rasio ekspresi gen IL-1β dibandingkan dengan β-aktin pada
head kidney ikan kerapu macan yang disuntik dengan CpG-ODN
2133 dan PBS. Head kidney diisolasi pada hari ke 7 setelah injeksi (*P<0.05).
22
pemberian imunostimulan berupa penyuntikan CpG DNA memberikan pengaruh yang nyata dibandingkan penyuntikan dengan PBS sebagai kontrol (*P<0.05) dengan nilai yang diperoleh 0.048<0.05. Hal ini sudah diketahui bahwa peningkatan ekspresi IL-1β pada ikan Atlantic salmon dan Rainbow trout diatur oleh leukosit atau makrofag yang di injeksi CpG DNA (Jorgensen et al. 2001a, b). Kono et al. (2001) juga mengungkapkan bahwa injeksi peptidoglikan merangsang produksi IL-1β pada ikan mas (Cyprinus carpio). Low et al. (2003) mengungkapkan bahwa peningkatan aktivitas fagosit mungkin hasil dari peningkatan produksi IL-1β. Kedua respon imun spesifik dan nonspesifik dapat dipengaruhi oleh peningkatan yang ditandai pada transkripsi IL-1β. Menurut penelitian yang telah dilakukan oleh Tassakka 2005 bahwa terjadi peningkatan gen IL-1β setelah di injeksi dengan CpG DNA 1668 pada ikan mas (Cyprinus carpio) serta Sakai et al. (1996) menyatakan bahwa pada ikan terjadi peningkatan ekspresi gen imun pada organ limfoid ikan, seperti pada gen sitokin serta lisosim. Menurut Buonocore et al. 2004, 2005; Hong et al. 2001 mengatakan bahwa IL-1β merupakan salah satu sitokin yang memberikan respon awal yang cukup penting dan memungkinkan organisme untuk merespon invasi mikroba dan peradangan pada ikan rainbow trout dan sea bass dengan mengaktifkan rekombinan IL-1β pada beberapa tahun terakhir. Secara keseluruhan, penelitian ini menunjukkan bahwa ikan kerapu IL-1β memiliki peran penting dalam sistem kekebalan tubuh
23 pemberian imunostimulan berupa penyuntikan CpG DNA tidak memberikan pengaruh yang nyata dibandingkan penyuntikan dengan PBS sebagai kontrol (P>0.05) dengan nilai yang diperoleh 0.185>0.05. Dalam penelitian ini, CpG-ODN 2133 tidak secara signifikan meningkatkan ekspresi gen TNF-α1. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh lama waktu yang dilakukan setelah di injeksi. Menurut penelitian Tassakka 2005 mengatakan bahwa peningkatan ekspresi gen TNF-α1 pada ikan mas terjadi sangat cepat dalam hitungan jam yaitu pada jam ke 2 dan ke 4 setelah injeksi dengan CpG DNA tipe B dan pada jam ke 2 setelah injeksi dengan CpG DNA tipe C.
TNF memiliki peran penting dalam menahan invasi patogen. Namun, TNF berlebihan atau terlalu cepat dapat menyebabkan terjadinya mortalitas pada spesies tersebut. Salah satu kemungkinan sehingga gen TNF ini tidak terekspresi dengan baik dikarenakan gen TNF yang dihasilkan terlalu banyak dan berlebihan, hal ini sesuai dengan pendapat Mandella et al. (2013) bahwa Keberadaan TNF-α disebabkan karena injeksi CFA (sejenis adjuvant) memicu terjadinya kerusakan membran synovial yang menyebabkan vaskularisasi dan infiltrasi sel-sel meningkat pada sel T CD4+. Pada kadar rendah, TNF bekerja terhadap leukosit dan endotel, menginduksi inflamasi akut. Pada kadar sedang, TNF berperan dalam inflamasi sistemik. Pada kadar tinggi, TNF menimbulkan kelainan patologik syok septik. Menurut Nurdiansyah et al. (2013) mengatakan di dalam laporan penelitiannya bahwa TNFα telah diketahui dapat mengaktifkan beberapa cellular
signalling pathways yang akan memediasi ekspresi dari COX-2 dengan
memfasilitasi perekrutan berbagai macam faktor transkripsi ke dalam promoter dari COX-2, di mana promoter COX-2 mengandung urutan (sequences) untuk mengikat kompleks transkripsi NF-kB, PEA3 dan AP-1. Kegiatan TNF juga telah dilaporkan pada ikan. Ada laporan yang menunjukkan bahwa terjadi peningkatan leukosit dan aktivitas fagositosis makrofag pada ikan Rainbow trout ketika diinkubasi dengan menggunakan protein TNF rekombinan (rTNF) (Zou et al. 2002). Ekspresi pro-inflamasi juga meningkat secara signifikan dengan protein rTNF.
Ada berbagai macam interaksi antar sitokin menurut Ishartadiati 2011 yaitu : (1) bersifat sinergistik (sejalan) atau antagonistik (berlawanan), beberapa sitokin bekerja secara sinergistik atau secara antagoniatik terhadap suatu aktifitas tertentu; (2) induksi atau inhibisi, beberapa sitokin dapat menginduksi atau menghambat produksi sitokin yang lain, dalam suatu bentuk sinergi atau antagonisme berurutan (efek kaskade); (3) regulasi ekspresi reseptor, beberapa sitokin meregulasi ekspresi reseptornya sendiri maupun reseptor sitokin yang lain. Berdasarkan pendapat Ishartadiati 2011 diatas kemungkinan tidak signifikannya peningkatan ekspresi gen TNF-α1 pada penelitian ini dikarenakan oleh interaksi yang terjadi antar sitokin.
24
SIMPULAN
Penggunaan CpG DNA 2133 mampu meningkatkan ekspresi gen imun IL1β dan COX-2 pada ikan kerapu macan namun tidak mampu meningkatkan ekspresi gen imun TNF-α1 pada ikan kerapu macan, dengan demikian penggunaan CpG DNA 2133 memiliki potensi yang baik sebagai imunostimulan maupun adjuvan vaksin pada ikan kerapu macan.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lanjutan mengenai kemampuan CpG ODN 2133 dalam meningkatkan ketahanan tubuh ikan kerapu macan terhadap serangan penyakit yaitu dengan melakukan uji tantang menggunakan bakteri, virus maupun patogen lainnya.
DAFTAR PUSTAKA
Adipura J, Hidayat SH, Damayanti TA. 2012. Evaluasi tiga metode preparasi RNA total untuk deteksi Turnip mosaic potyvirus dari Benih Brassica rappa
dengan Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction. Jurnal Patologi Indonesia. 8(2): 44-49.
Akira S, Takeda K, Kaisho T. 2001. Toll-like Receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity. Nature Immunology. 2: 675.
Almendras JME, Catap ES. 2002. Immunity and biological methods of disease prevention and control. Tighbauan Iloilo Philiphine: SEAFDEC/SQD. 30 ps. Anderson, DP, Siwicky AK. 1993. Basic haematology and serology for fish health
program. Paper presented in second symposium on disease in Asian Aquaculture Acuatic Animal Health and Enviroment Phuket Thailand. hlm 25-29.
Apdhaliah. 2009. Polimorfisme DNA ikan kerapu macan (Epinephelus
fuscoguttatus) asal gondol (Bali) yang tahan dan rentan terhadap bakteri
Vibrio parahaemoliticus serta salinitas tinggi [Skripsi]. Makassar (ID). Universitas Muslim Indonesia.
Aranda IVR, Dineen S, Craig RL, Guerrieri RA, Robertson JM. 2009. Comparison and evaluation of RNA quantification methods using viral, prokaryotic, and eukaryotic RNA over a 104 concentration range. Anal Biochem. 387(1): 122-127.
Baratawidjaja KG. 2006. Imunologi dasar. Ed ke-7. Jakarta (ID). Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. 572 hal.
25 Bellanti JA. 1993. Immunology III, Teknis budidaya ikan kerapu (ikan kerapu
bebek dan kerapu macan). Yogyakarta (ID). Universitas Gajah Mada Press. Bridle AR, Butler R, Nowak BF. 2003. Immunostimulatory CpG
oligodeoxynucleotides increase resistance against amoebic gill disease in atlantik salmon (Salmon salar L). J Fish Dis. 26: 367-371.
Bridle AR, Morrison RN & Nowak BF. 2006. The expression of immune-regulatory genes in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, during amoebic gill disease (AGD). Fish and Shellfish Immunol. 20: 346–364.
Brown J. 1998. Antibiotics: Their use and abuse in aquaculture. J World Aquaculture. 20: 34-43.
Brown TKM. 2000. Applied Fish Pharmacology. Kluwer Academic Publisher. London. P 251-259.
Buchmann K, Lindenstrom T, Bresciani J. 2004. Interactive associations between fish hosts and monogeneans. Symp Soc Exp Biol. 55: 161–184.
Buonocore F, Prugnoli D, Falasca C, Secombes CJ, Scapigliati G. 2003. Peculiar gene organisation and incomplete splicing of sea bass (Dicentrarchus labrax
L.) interleukin-1β. Cytokine. 21(6): 257–264.
Buonocore F, Mazzini M, Forlenza M, Randelli E, Secombes CJ, Zou J, Scapigliati G. 2004. Expression in Escherchia coli and purification of sea bass
(Dicentrarchus labrax) interleukin-1β, a possible immunoadjuvant in
aquaculture. Journal of marine biotechnology (NY). 6: 53–59.
Chen Y, Xiang LX, Shao JZ. 2007. Construction of a recombinan plasmid containing multi-copy CpG motifs and its effects on the innate immune responses of aquatic animals. Fish and Shell. Immunol. 23: 589-600.
Dan-Qi L, Jin-Xin B, Li-Na F, Zhang Y, Xiao-Chun L, Wang L, Jie-Lin C, Hao-Ran L. 2007. Interleukin-1β gene in orange-spotted grouper, Epinephelus coioides: Molecular cloning, expression, biological activities and signal transduction. Molecular Immunology. 45: 857–867.
Dugger DM, Jory DE. 1999. Bio-modulation of the non-spesific immune response in marine shrimp with beta-glucan. Aquacultur Magazine. 25:81-89.
Ellis AE. 2001. Innate host defense mechanism of fish against viruses and bacteria.
J Development and Comparative Immunology. 25: 827-839.
Fast MD, Ross NW, Johnson SC. 2005. Prostaglandin E(2) modulation of gene expression in an atlantic salmon (Salmon salar) macrophage like cell line (SHK-1). Dev Comp Immunol. 29: 951–963.
Grimble RF, Howell WM, O'Reilly G, Turner SJ, Markovic O, Hirrell S, East JM, Calder PC. 2002. The ability of fish oil to suppress tumor necrosis factor alpha production by peripheral blood mononuclear cells in healthy men is associated with polymorphisms in genes that influence tumor necrosis factor alpha production. J of clinical nutrition. 76: 454–9.
Hamka. 1998. Patogenitas beberapa bakteri vibrio yang diisolasi dari sedimen tambak terhadap nener ikan bandeng (Chanos chanos Forsskal) dalam wadah terkontrol [Skripsi]. Makassar (ID). Universitas Hasanuddin.
26
Harris SG, Padilla J, Koumas L, Ray D, Phi RP. 2002. Prostaglandins as modulators of immunity. Trends Immunol. 23: 144–150.
Hartmann G and Krieg AM. 2000. Mechanism and function of a newly identified CpG DNA motif in human primary B cells. J Immunol. 164: 944-953.
Hartmann G, Weeratna RD, Ballas ZK, Payette P, Blackwell S, Suparto I, Rasmussen WL, Waldschmidt M, Sajuthi D, Purcell RH, Davis HL, Krieg AM. 2000. Delineation of a CpG phosphorothioate oligodeoxynucleotide for activating primate immune responses in vitro and in vivo. J Immunol. 164: 1617-1624.
Hemmi H, Takeuchi O, Kawai T, Kaisho T, Sato S, Sanjo H, Matsumoto M, Hoshino K, Wagner H, Takeda K, Akira S. 2000. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. 408: 740-745.
Ishartadiati K. 2011. Peranan TNF, IL-1 dan IL-6 pada respon imun terhadap protozoa. laporan penelitian. Dosen Fakultas Kedokteran Universitas Wijaya Kusuma Surabaya.
Jorgensen JB, Johansen A, Stenersen B, Sommer AI. 2001a. CpG oligodeoxynucleotides and plasmid DNA stimulate atlantic salmon (Salmon salar L.) Leucocytes to produce supernatants with antiviral activity. Dev
Comp Immunol. 25: 313-321.
Jorgensen JB, Zou J, Johansen A, Secombes CJ. 2001b. Immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotides stimulate expression of IL-1β and interferon-like cytokines in rainbow trout macrophages via a chloroquine-sensitive mechanism.
Fish and Shellfish Immunol. 1: 673-682.
Jorgensen JB, Johansen LH, Steiro K, Johansen A. 2003. CpG DNA induces protective antiviral immune responses in atlantic salmon (Salmon salar L.). J Virol. 77: 11471-11479.
Kanellos TS, Sylvester ID, Butler VL, Ambali AG, Partidos CD, Hamblin AS, Russel PH. 1999. Mammalian granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and some CpG Motifs have an effect on the immunogenicity of DNA and subunit vaccines in fish. Immunology. 96: 507-510.
Kani RA, Rantetondok A, Malina AC. 2012. Pengaruh pemberian CpG-ODN terhadap sistem kekebalan tubuh ikan kerapu macan (Epinephelus
fuscoguttatus FORSSKAL, 1775) [Tesis]. Makassar (ID): Universitas
Hasanuddin.
Kaun-Yu L, Yen-Tung H, Hsiu-Hua L Hung-Hung S. 2005. Cloning the prophenoloxidase cDNA and monitoring the expression of proPO mRNA in prawns (Macrobrachium resenbergii) stimulated in vivo by CpG oligodeoxynucleotides. Fish & Shellfish Immunology. 20 (2006): 274-284. Kerkmann M, Rothenfusser S, Hornung V, Towarowski A, Wagner M, Sarris A,
Giese T, Endres S, Hartmann G. 2003. Activation with CpG-A and CpG-B oligonucleotides reveals two distinct regulatory pathways of type I IFN synthesis in human plasmacytoid dendritic cells. J Immunol. 170: 4465-4474. Krieg AM, Yi AK, Matson S, Waldschmidt TJ, Bishop GA, Teasdale R, Koretzky
GA, Klinman DM. 1995. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature. (Lond.). 374: 546.
Krieg AM, Hartmann G, Yi AK. 2000. Mechanism of action of CpG DNA.
27 Krieg AM. 2002. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects. Annual
Review of Immunology. 20: 709-760.
Kollner B, Wasserab B, Kotterba G, Fischer U. 2002. Evaluation of immune functions of rainbow trout (Onchorinchus mykiss)- how can environmental influences be detected?. J Toxicol Lett. 131: 83-95.
Kono T, Sakai M. 2001. The analysis of expressed genes in the kidney of Japanese flounder, Paralichthys olivaceus, injected with the immunostimulant peptidoglycan. Fish Shellfish Immunol. 11: 357-366.
Kresno SB. 2001. Imunologi diagnosis dan prosedur laboratorium. Ed ke-3. Jakarta (ID). Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Lavilla-Pitogo CR, Baticados MCL, Cruz-Lacierda ER, De La Pena LD. 1990. Occurrence of Luminous bacterial disease of Penaeus monodon larvae in the Philiphines. Aquaculture. 91: 1-13.
Lindenstrom T, Secombes CJ, Buchmann K. 2004. Expression of immune response genes in rainbow trout skin induced by Gyrodactylus derjavini
infections. Immunopathol. 97: 137–148.
Lindenstrom T, Sigh J, Dalgaard MB, Buchmann K. 2006. Skin expression of IL-1b in east atlantic salmon, Salmon salar L., highly susceptible to Gyrodactylus salaris infection is enhanced compared to a low susceptibility baltic stock. (TNF-α) dan gambaran histopatologi sendi tikus arthtritis (Rattus norvegicus) yang Mendapatkan terapi ekstrak buah kesemek junggo (Diospyroskaki L.f). Laporan Penelitian. Surabaya (ID). Program Studi Pendidikan Dokter Hewan, Program Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya.
Nilanjan GRC, Vivekananda M, Subhash C, Mandal. 2010. Cox-2 as a target for Cancer Chemotherapy. Hlm 233-244. sebagai mediator cancer-related inflamation pada Karsinoma nasofaring. Laporan Penelitian. Departemen Telinga Hidung Tenggorok-Bedah Kepala Leher. Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara/RSUP H. Adam Malik Medan.
Ortuno J, Cuesta A, Rodrigues A, Esteban MA, Meseguer J. 2002. Oral administration of yeast, Saccharomyces cerevisiae, enhances the celluler innate immune respone of gilthead seabream (Sparus aurata L.). Immunopathol. 85: 41-50.
Parenrengi A dkk. 2010. Analisis ekspresi gen antivirus PmAV pada udang windu
(Penaeus monodon) yang ditantang dengan WSSV. Balai Riset Perikanan
Budidaya Air Payau. Maros (ID). Sulawesi Selatan.
