Kajian Pertumubuhan Akar Rambut Cinchona sp dari Inokulasi beberapa Galur Agrobacterium rhizogenes

KAJIAN

PERTUMBITHAN AKAR RAMBUT

Cinchona sp

D A N

INOKULASI

BEBERAPA

I

GALUR

Agrobacterium rhizogenes

PROGRAM

PASCASARlANA

INSTITUT PERTAMAN

BOGOR

Reflini. Study of haixy ruat growth of t'imhonu sp by inoculation af several Agrobaeterium rhizogenes strains. Under the guidance of Dr. Hj,

Anna

Prkgani

Roswiem, klS and Dr. Nucita Toruan-Mathius,

MS.

APU.

Problem encountered in bcukation of Cinchona species by A, rhizogenes is iow percentage of transformed root initiation and slow growth of hairy root. Strains

of A, rhizugenes and the growth medium

has

a sign&cant effect to the formation of

!miry roots. The aim of

tkis

research was to evaluate the potmtia1 of several A. rhizogenes strains far initiation of hairy roots of C. mrccirubru

d

C. ledgeriano, and to obtain the opthum composition of the medium for hairy roat culture of Cinchona species. Axenic stem and leaf explants of six to eight-week-old from

C, succirubra and C. ledgeriunca

~~

were inoculated with A. rhizogenes strains

15834, 8196, l2-20001, 07-20001, A4,

R

MAFFA, TTSm 509, TISTR 510 rtnd LBA 9453. Inoculatd explants were cugured in solid MS medium. Subculture of the

havy root was performed by transfer of root pieces into fresh liquid basal medium MS,

B5,

White and HeIler. Hairy roots from the best of b a d medium were subcu1tured an the xime medium with addition of 50 mglf and 100 mg/I

L-Triptaphane; three (MSJV) and five (M55V) times concentratien of MS vitamins. Thc integration of T-DNA in hairy roat was c o r n e d by using, spesific primer for

TL

and TR-DN A of A. rhizogenes

in

Polymerase Chin Reaction (PCR) analysis. The results showed that only A. rhizogeraes LBA 9457 were effective to the ~ e c t i o n of explants from both Cinchona species. The h a q roots showed the fastest growth h

MS

medium, while growth irz. others medium was poor. Hairy roots of

C,

ledgeriana

has vigor and growth better

than

hairy r m s of C. su~cl'rubra. MSJV is the best medium for the improvement of hairy rout grawth and vigor. Transformed roots of

C. succi'rubra and C. ledgeriana uscd in this experiment were canfirmed t b t fialry

roots examined contained b t b TI, and TR-DNA region of Ri plasmid by PCR

amplificcttion d y s i s of DNA. The results obtained

in

this study indicate b t the

SURAT PERNYATAAN

Dengan ini saya m e n y a ~ a n bahwa tesis yanl; berjudul :

Kajian Pertumbuhan Akar Rambut Cinchofla sp dari Inokulasi

Beberapa Gal ur AgrolZacteriu r#iizogeptes

addah benw mmup&an h a i l kmya say8 sendiri dm Mum panah dipublikasikan,

Semua s w b e r data dm informasi ymg digunakan telafi dinyat- secara jelas dm

dapat. diperikszt kebenxannya.

KAJIIAN

PERTUMBIJHAN

AKAR

RAMBUT

Cinchona

sp

DARI INOKULASI

BEBERAPA

GALUR

Agrobacterium

rhizogenes

. I-

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk rnemperoleh gelar

Magiszer Sains p d a P r o p m Studi Bioteknologi

PROGRAM

PASCASARJANA

'

INSTTTW PERTANTAN BOGOR

Judul Tesis : Kajian prkurnbuhan rambut Cinchona sp dari inokulasi beberapa g l u r Aphucteriunr rhizogenes

Nama : Iieflini

MRP : 99650

Program Studi : Bioteknologi

Dr. Hj. Anna Priangani Roswiem, MS Ketua

Penufis dilahirkan di Payakurnbuh pada tmgga! 1 Februari 1976 sebstgai an& bungsu dari pasangan Yulizar (Alrn) dm Maridas. Penulis menyelesaikm Pendidikan Dasar tahun 1988, Sekolah hnjutan Pertma tahun 1991 dm Sekolah Lanjutan Atas tahun 1994. Pendidikm sarjana ditempuh di Jurusm Pendidikan Biologi, Fakultas Pendidikan Maternatika dan Ilmu Pengetahan Alam IKIP Padmg, lulus pa& t d u n

1999. P d a tahun<, 1989, penulis rnelanjutkan studi Strata dua (Sz) Program Seudi

Biotehologi, Program Pascasarjma IPB dm mmendapat gelar Magister Sains pada bulm

Puji d m syukur ke hadirat All& SWT atas limpahan &mat dsut h i d a y m y % sehingga tesis yang berjudul Kajian Pertumbuhsln Akar Rambut Cinchona sp dari Inokulasi Beberapst Grr lur Agrobact~rium rhizogmes, dapat diselesaikm.

Terirna kasitz diucapkan kepada Dr, Hj. Anna Priangani Roswiem,

MS

dm Dr. Nurita Toman-Mathius, MS. APU sel&u pembimbing, atas birnbingan, arabn dm dorongan moriel rnelalui diskusi ymg sangat berguna d a l m menmbab serta

memperluas w a w m untuk, menyelesaikm penelitian serta penuiisan tesis ini. Penulis mengucapkm terima kasih kepada kepda Unit Penelitian Biutehoiogi X)erkebunm, Bogar beserta staf yang telah rnernberikan izin serta penggunam failitas

peneiitim, 'Keberhasilan dalam xnenyelesaikan tesis ini tidak terlepas dari bmtuan

dma penelitim dari Dr. Nuritst Torum-Mathius, MS. APU, mtuk itu p w l i s

mengucapkan terima kasih yang sebanywk-banyaknya. Terima kasih juga diucapkan kepacla Katua Program Studi Biotehologi beserta staf, Direktw Program Pascasarjana TPB kserta staf ymg telah mernberikan ilmu dm p l a y a a n selamst penulis menempuh pendidikm.

Terim kasih juga pendis samgaikm kepada Bap& Tolhas Hutabarat, BSc- Dipl.Kim yang tel* memberikan bimbingan dm arahan ymg berhmga, Bapalc Suhartono, Dra. Nurhaimi-Hwis MSi, Mb& Nani dm selunrh s t d Laboratorium

Biarnalekul dip Imunologi atas bantuan dm kerjasama y m g sangat berawti, serta ternan-ternan Program Studi Biotehlogi angkatan 99.

Terirnst kasih ymg sebesar-besmya penulis ucapkan kepada Abak (alm), bu dm k&&-kakalrku y m g selma ini selalu memberikan perhatian, durongm rnoriel, kasih sayang dm da'a. Semuga Allah SWT melimpfiari batasan atas k e b a i h yang telah diberikm.

AXcbimya pexlulis bedlarap sernoga tdisan ini dapat bemanfaat dm

2. Respon Cinchona sp setelah diinokulasi dengm beberapa

gdur A, rhizogcnes ,

.

,

. .

,

.

, ,

. . .

.

.

.

. . .

.

. .

. .

, ,

. .

,

.

+ .

.

38

3, Respan awal C. succirubra dm C, ledgerianu setelah 3 rninggu

diinokulasi dengm A. rhizogenes galur LBA 9457

. . .

4 1

4. Respu? C. Succirubra dm C. ledgeriana pada ekplan &m dm

batmg sek1al-i diinalculzisi selama 7 rninggu ,

.

,

. .

,

.

,

.

.

,

.

,

. . .

,

. . . ..

41

5. A k a rambut Qnmm kina..

. . .

,

.

,

. .

,

. . .

,

. ..

43

6 . Kultur aka ramhut C. Iedgeuiants umur 8 minggu

. .

,

. . .

,

.

, ,

. .

, 46

7. K u l ~ akar m b u t C. ledgevianu pada medium MS modifikasi.. 47

8, K u l m rarribut C ledgerianu pa& medium MS modifikasi 47

9, Rerata panjmg aka rambut C. Ledgerianu ymg dikultur s e l m

7 minggu pada medium MS dm MS rnadifikasi

. . .

,

. . .

. .

.

.

.

,

. . .

49

10. Rerata jurnlah cabmg &ar rmbut C. ledgerianu yang dikultur

selama 7 Ginggu pada medium MS dm MS modifikasi

. . .

. .

.

.

. .

.

..

49

1 I . Rerata babat basah akar rambut C. ledgerianu yang dikultur

selama 7 minggu pada medium MS dm MS modifikasi

. . .

,

.

,

.

₅₀

12. Hasif fraksinasi DNA setelah PCR..

. . . .

,

. .

,

. .

,

. . .

, ,

.

, ,

.

.

.

,

No Teks Halaman

1 . Kompasisi beberapa medium dasar untuk pertumt7uhstn &ar rambut

tanaman kina

...

61

Sebagim besar senyawa kimia yang digmakm pada indutri abat-abatan,

,*

makanm dm rninyak wmgi

Ire&

dari tumbuRm. Senyawa-senyawa tersebut

biasanya dixlmaicm rnetabolit sekunder atau produk sekunder

.

Senyawa-senyawa

metabulit s e k d e r ini merupakan h a i l metabulisme Xmjutan druri kxbohidrat, lernak

dan protein. Dalam tumbuhan, metabulit sekunder dapat: dijumpai dalm bentuk

alkaloid, terpenoid, steroid, mtrztsianin dm polifenul,

Tanamm kina (Cinchona sp) mengandung senyawa rnetabolit sekunder dalm

bentuk alkaloid kuinalin yang antara lain terdiri, dari kuinin, kuinidin, sinkonin dm

sinkonidin (Stiiba dm Chung 1981). Kuinin dm kuinidin GI& l m a digunakm

sebak;ai abat-abatan. Kuinin digunakan sebagai obat anti malaria, sedangkan kuinidin

selain digunakm sebagai obat anti malaria juga dapat dig&an sebagai obat unt&

menormalkan denyut jmtung yang tidak teratw (cardiac atyhtzic) (Verstrijden

1975). Pada industri minuman r i n ~ a n , kuinin biasanya digunakm set>@ pmberi

cita rasa (flavoring #gent) kaxena rasanya pakit (Anderson et al. 1986).

kuinolin yang meningbt. Tetapi tmmm kina rnemerlukan w&tu paling sedikit

tujuh tahun untuk &pat dipmen d m produksi alkaloid tertinggi banr dapat dipperoleh

setelah t m m a n berumur 20 tahun. Kendala tersebut rnenyebabkm obat

anti

mdwia

sangat mahat dipasam, Untuk mengatttasi hd tersebut- tel& merangsang

obat anti malaria sintetik mengakibatkan kebutuhan alkaloid kuinulin kembali

mengalami peningkatan.

Pmspek pas& kina duniit pada kberapa eahun terakhir ini rnenunjukkm

kecendemgan y m g menggembir&m Permintam alkaloid kuinolin di psar d d a

diperkirdcan &an tcrus meningkat karma pengguamyrt yang semakin meluas

di krbagai bidang industri m t m 1&n industri famzstsi, industri minuman, incfustri

kasrndik dm industri biapestisida. Setiap t&un terjadi peningkatan permin-

alkaloid kuinolin sebsar 20 persen. Pada tahun 2001 kebuhrhan alldoid kuinulin

rnencapai 175 ton &an diperkirakan pada tahm 2005 mendatang a i m rneningkat

rnenjadi 275-300 ton dengm nilai sekitar US $9.9OQ.000 (SIL 2000).

Usaha-rr~aha y m g telah dil&ukm untuk memproduksi dkdoid kuinoIin

antara lain dengan memarifaatkan teknik kdtw jaringan. Menmt Fowler (1983)

salah satu keuntungm teknik kultur jztringan dibmdingkm dengm cara kunvensiond

addah kernampurn dalam menghasilkan senyawa kirnia d a l m wak-.tu ymg relatif

singkat dm kemampuan untuk rnernproduksi senyawa yang sulrar diperoleh seem

alami.

Staba dm Ckung (1 98 1) telah herhasit memproduksi kuinolin pada kultur

daun C, ledgerima sebsar 0,45% dari bobot kcringnya. Sedangkan Mdder-Krieger

er al. (1982) juga berhasil mendapatkan kuinin sebesar 95 pg/g bobat kering dmi

kdus C. pubmeens. Kuinin dan tiinidin juga berfrztsil diperuleh d a i kdtur aka

C. ledgerianu sebesar 0,010 mglg bobut kering dm 0,001 mg/g bubot kering oleb

Anderson el ui. (1982). Scragg (1986) berhasil memprolch kuinidin sebessu 0,053%

Sedangkan Hay (1986) mendapatkan peningkatan lima kali lipat kuinin dm kuinidin

pada kultur akai C ledgerianu dengan pemberian 500 mgll prekmur L-triptofm.

Produksi alkaloid kin# melalui kulhxr jaringan m a i h menunjukkan p r o d h i

y m g rendah. Hal ini diduga karma pertumtruhm sel yang lambat dm d~prlukannya

sejumlah hamon pertumbuhm dengan kunsentrasi yang tepat. modes (1986)

menerangkan bahwa banyak persenyawam tidak ekonamis dipruduksi meidui kultur

suspensi dm tingkat heterugenitasnya jugst tinggi. Kultur cenderung tidak: stabil dari

masa ke masa, Adslnya kcndala-kendala ymg dihadapi tersebut telah rnembuka suatu

pengembangan t e h i k baru mtuk menghasil kstn senyawa rnehbolit sekunder yang

lebih tinggi, yakni dengan memanfaatkm transfumasi Agrobacterium utuk:

merighasilkan &a rambut.

Agrobacteriokm merupakan bakteri tanah gram-negatif yang temasuk pada

kelompok Rhizobiaceae, mempunysti kernampurn untuk mentransfer sebagian bahan

genetiknya (DNA) pada sel tanaman melaiui gelukaan (Nilson dm Qlsson 1997).

DNA ymg ditransfex: disebut dengan T-DNA, yang rnerniliki gen-gen penyandi

enzirn untuk produksi opine (suatu kelompok konjugasi assun amino dm kabbidrat)

(Machstdo 1995). T-DNA rnenrpakan potongan beberapa rcttus kilo basa drtri plasmid

ymg dikenttl dengan Ri plasmid (root inducing plasmid') atau Ti plasmid (tumor

inducing plasmid), fii plasmid terdagat pada A, rhizogenes wdmgkan Ti plasmid

terdapat pada A. tumefascieras, T-DNA aka terintepsi pada kromosom tmamm dm

&an mengekspksikan gen-gen untuk mensintesis senyawa win. Selain gea unt&

rnensintesis senyawa apin, T-DNA juga mengandung onkagen, yaitu gen-gen ymg

terekspresi maka akan terjadi pertwnbuhan cepat dari sel. Ekspresi onkogen pada

plasmid

Ri

rnencirikan pembentukan aka adventif secara besar-besaran pada

ternpat ymg diinfeksi dm dikenal dengan 'hairy root' (akw rambut)

(Nilson dm OTsson 1 997).

Pemmfagtan kultur aka rambut untuk merighasilkan senyawa mekbolit

sekundcr telah banyak dil&ukm, antara lain lobelin dmi Lobeliu injlanra L.

(Yonemitsu et

QI.

199O), katarantin d m ajmalin dari Cutharc~nthus roseus (Vazquez-

Flota ef 01. 18941, saponin dari Solmum aculeatr'ssurn (Ikenaga et al. 19951,

glukotropaeolin dari Tropaeolum majus (Wielmek dan Urbmek 19991, hiosimin

d m

skapalamin dari Atropa beliardonna (Kmada et al, 1986 ; Aoki ee6 al, 1997)

d m

Dutwra innoxia (Boitel-Conti et a!. 2000).

Kultur akar m b u t pada tanaman kina untuk mernproduksi kuinulin juga tel&

dilalrukan oieh Hamifi et al. (1 989) pada C. ledgerianu dengm A. rhizogenes gdur

LBA 9402 dm'R1000, dm Cieerling et al. (1999) pada C, oficinalis dengan galur

I,BA 9402. Narnun produksi kuinolinnya rnasih rendah dm diperoleh dalm periode

waktu lebih dari satu tahun, Hal ini discbabkan istju pcrturnbuhan akar rambut yang

ssuzgat lambat. Namun sistem produksi ini jauh lebih rnenguntmgkan dibandingkan

dengan vanamannya yang baru dapat dipmen setelah berumur lebih d a i 7 tahun.

Adanya kendda dalam kultur &ar rambut tanman kina disebabkan b l u m

ditemukan komposisi medium yank tepat untuk perturnbuh. akax rambut. Menurut

Gixi dm N a a s y (2000) medium tumbuh mcmberikm pengaruh yang nyata terhadap

p e ~ u m b u h m akar rambut yang optimal, kondisi kultur haws diatw padst

tingkat optimum.

Bercfasarkan hasil yang telab dlperoleh d m dalm upaya rri~ndstpatkan

alkaloid kuinoin yang lebih tinggi dilakukw penelitian terhadap kemampuan

A. rhizogenes untuk mengirrfeksi dm rnenghasilkan respon pada tanaman kina,

Penelitian ini rnerupakan pahap awal dari serangkaian penelitian yang d:lrencim&an

untuk menghasilkan teknulogi kultur &ar rmbut C, succirubra dm C. ledgerianu

yang mernproduksi alkaloid kuinolin. T&;tpm penelitian yang dildcuk-nuz

rnencangkup pengujian trmsformasi genetik behrapa galur A. rhizogenes terhadap

C succirubru dan C. ledgerima d m dilmjutkm dengm uji konfrrmasi T-DNA ymg

terintegrasi di "ddarn akar rambut C. succirubra dm C. Jedgeraiana dengan

rnenggunakan primer spesifik dari TL dm TR-DNA A. rhizogenes rnelalui tehik

Poly~ne~ase C h i n Reaction (PCR).

1,2 Tujuan Penelitian

Penelitian ihi krtujuan untuk (1) menyeleksi beberapa galur A. rhizogenes yang

dapat menginokulasi C', succiru bra dm C. ledgerianu, (2) mendapatlcan medium

yang optimum untuk gertumbuhan &a rambut: C, succir:rubra dm C. ledgeriana, dan

(3) mendapatkan akar rambut tanaman kina y m g telah terintegrasi T-DNA.

1.3 Hipatesis

Hipatesis ymg digunalcm d d m penelitim ini addah :

I . A. rhizogenes &pat rnenginduksi pernbentukan akar rambut pada sel jaringan

2, Komposisi medium kuItur d q a r rnempengaruhi pertumbuhan akar rambut

tanaman kin# C. succiuubra dm C. ledgeriana.

3. T-DNA dari A, rhizugenes dapat te~integasi pada &a rambut &~aman kina

C succr'rubra dan C ledgerr'una,

l,4 Kegunaan PeneXitian

Penelitfan ini diharapkan dapat, menglxasilkan teknik trmsformasi pada

tanaman kina dengan rnenggunakan gdur A. rhizogenes yang kumpatibel terhdap

genarn C. succr'rubru dan C. ledgerianu dan m e n d a p a t h medium terbaik ymg &pat

menghasilkm pertumbuhan akw rambut ymg optimal. Teknik y m g d i h a s i l h

2.1 Tinjauan Umum Tanaman Kina

Tanaman kina (Cinchona sp) menrpakan tanaman tropis yang b e r a d dari

benua Amerika Selatan d m termasuk suku Rubisceae (Croraquist 1981 ; Aerts el ai.

1991). Ada berbagai spesies tanaman kina, di mtaranya C, lanc$ulila,

C.

triameI

C, cordifdid, C, succirubva, C, oflcinalis, C. micralathu, C. calopdera, C. josephiana

dan C, culisuya (Kerbosch 193 1). Di Indonesia, tanaman kina dibudidayakan

di drierah pegunungan pada ketinggian 800-1625 m di atas permukaan laut atau

kusmg dari 1950 rn di atas permukaan Iaut. Ada dua spesies kina y m g

dibudidaydcan, yaitu C. ledger iana dm C. succkubra,

Pohor- C ledgeriano kurmg kuku!i~, tetapi pertumbuhamya ceprtt, mmpunyai

percabangan ymg banyak dm tidak beratwan. Dam C, ledgeriana tebal, berwarna

~ j a u muda, berbentuk jorong, Xmset, dengm alur ymg kecil pacia tulang-tulmg dam

& p e m h atas dam. Bunga kuning pucat, bakd bbu& berbentuk telur sku tomb&

dengm panjang 8

-

15 mm. Kulit teba1 dengan warna cukeXat (Astika 19751,

C, Szdccjrubra rnerniliki puhon ymg besar dm batang luws. Perhunbuhannya

cepat namun percabmgm sedikit, cabang-=bang muda berbulu. D a m y a besar,

tipis, b e n v m a hijau muda, berbentuk jorong & (40

-

50) X (30

-

40) ern dengan

lapisan bulu sepanjang tulmg daun pada permukaan bawah, Bmga b e w m a me&

muda dm perrnukaan atas rnahkota berwma putib. B&al buah rnemanjang

2.2 Alkaloid Tanaman Kina

Tanman kina telah lama dikenal sebagai penghasil metabulit sekunder, yrtitu

alkaloid kuinolin. Kuinolin banyak ditemukan di ddam kulie batang tanaman kina,

sedangkan pada bagian lain seperti kayu, buah dm daun hmya dikmukan d d m

kadar yang relatif sedikit (Musalam er al. 1980). Kurang lebih 35 macam alkaloid

kuinolin telah ditemukan pada tanaman kina, n m u n hmya terdapEtt empat macam

kuinolin u m a yaitu kuinin, kuinidin, sinkonin dm sinkunidin (Urdang 19451,

Kuinin dan kuinidin mempaksm turunan dari 6-metoksi-kuinolin, dm

mempunyai m u s empiris yang sama, yaitu C ~ ~ H 2 4 N 2 0 2 dengan bemt rnolekul 232

(Verstridjen 1975). Keduanya menrpakan stereoisomer yang dibedakm d a m

karakteristik kikia dm fisikanya, sehingga mempunyai sifat yang berbeda. Perbedm

bentuk ruang kedua molekul ini berasal d x i orientasi yang berlainan dari

atom C pusat ymg tidak rnempwyai simefri dm dapat terikat ppada atom-af0In

dengan dua macam susunan, ywg satu merupakan baymgan cemin yang I&

(Verstrijden 19751,

Biasilltesis alkaloid kuinolin dapat dilihat pada gmbar 2.2. P=mbntukan

alkaloid kuinolin diawali dengan perubahan triptofan membentuk triptamin dengm

banturn enzim triptofan dekarbksilase. Selanj utnya terj adi kondensasi ezimatik dari

triptamin dm sekolagmin untuk membcntuk striktosidin, terw rnembenluk sejunlah

turunan dkdoid berikutnya termasuk alkaloid kuinolin (Aerts et al. 199 3).

Setiap jenis Cinchona mempunyai kandungm alkaloid kuinolin yang berbeda.

C. Eedgeriana diketahui memiliki kadar kuinin ymg tinggi (4

-

13 %), sedmgkan

kadar sinkanidin C, succirtib~.~ lebih tinggi yaitu 3,2 - 5,1 a/o dari pada C Itdgeriunn

R=l.l Sinkonidinon l<=H

R=OCH, tl-OCl,lr K u i ~ ~ i d i n o n

R-1.l Sinkonidin 8-M Sinkonin

[image:101.611.72.484.190.737.2]

R=QCI~I Kitirliu R=OCHj Kuinidin

Gambar 2.2 Biosintesis Alkaloid KuinaIin.

2,3 Karakteri~tik Agrubacterilrm rltizoge~les,

Genus Agrobacferium merupakan bakteri gram-llegatif, temasuk kelomgok

Rhizobiweae dm bersifaf aerobik. Ada dua spesies Agrobacterium y ~ , g diketahui

sebagai patugen pada tanaman, yaitu A. tumefusciens

cfan

A. rhizogenes. Kedua

spesies tersebut dapat menginfeksi tanaman dikotil dm sebagim kecil monokotil

rneldui pelukaan. hfeksi yang disebabkm oleh A. fumefusciem dapat menyebabkan

terbentuknya tumor pacia tempat infeksi yang disebut dengan crown gall. S e h g k a n

infeksi oleh A. rhizogenes dapat membentuk sernacam akw adventif secara besar-

besaran yang l z i m disebut dengan hairy root (aka rambut). Menurut KIee es ab.

(1987) tumor dm aka r m b u t yang terbentuk dapat tern tumbuh secma alrsenik

wdaupun Agmbacterr'um-nya telah mati, Pertumbufxm tersebut dapat hrianj ut pada

medium tmpa rat pengatw tumbuh,

hduksi tumor dm akar rmbut terjadi karena sebagim DNA atau yang

disebut dengan T-DNA dari Agrobacferiwm ditransfer ke ddam sel tanaman. T-DNA

tersebut memiliki gen-gen untuk mensintesis auksin dm sitokinin, sehingga apabila

terekspresi &an rnengakibatkan terjadiny~l over produksi hormun tersebut di dalm

sel tanaman (Klee et al. 19871,

T-DNA merupakan bagian dari megaplasmid yang ada dalam Ag~.obacierium

. J,

yaitu Ti-plasmid (tumor inducing) pada A. tumefasciens atau =-plasmid (root

inducing) pa& A. rhizuge~zes (Winans 1992). Ti-plasmid h a t : d i b e d a h

berdasarkan tipe opine yang dihasilkan, yaitu nopalin dm oktopin. Sedangkan

Ri-plasmid dibedakan rnenjadi Ri-plasmid kelompok manopin dm kelompok agropin

Pada A, rhizogenes, Ri-plasmid mernpunyai satu atau

dua

macam T-DNA,

yaitu Iefr T-DNA (TL-DNA) dm right T-DNA (TR-DNA). Berbeda dengan

TL-DNA, TR-DNA mernpunyai persamactn dengm T-DNA A. tunaefasciem.

TR-DNA mengmdung gen-gen iaaM dm iuuN yang berfungsi unhxk. biosintesis

auksin, dm juga mernbawa gen-gen untuk menyandi sintesis senyawa apin (Giri dm

Narstsu 2000). Sedangkan TL-DNA mengandung gen-gen rul. Slightom et al. (1986)

rnengidentifikctsi 18 open reading frames (OWs) pada TL-DNA pRi A4. Pengujian

yang dil&ukan pada daun dm ba-g lcalanchoe menunjukkan bahwst dari 18 lokus

yang krpatensi pada TL-DNA, hanya empat Iakus ymg tamp& mempengaruhi

morfologi &ar rambut ymg djhmsiih, y h i lokus A-D (ralA-a), Lukus-Iokus

tersebut berupa ORF 10 (rol A), ORF 1 1 (uolB), ORF 12 (ro2 C) dm

O W

I5

(rul D). Produk gen rol ini drtpat: mengakibatkan terjadiiya pembentukan akar

rambut. White et rrl. (1985) nzelakukaxl pengujian terhadap plasmid agi- pin pRi A4

yang mernbawa d m dapat melztransfer dua T-DNA (TL dm TR) pada sel tmamm,

TL-DNA pRi A4 rnenunjukkan prsamaan dengan T-DNA gdur 8196 yang

menyandi sembiian gen tranship.

2,4 Mekanisme Infeki Agrobakterium rhizugmes terhadap Sei Twnaman

Secara umum proses infeksi A. rhizogenes mirip dibmdingkan dengan

A. tumefasciens, Ada dua daerah yang terlibat dalam proses transfer DNA yaitu

T-DNA dm daerah vir ((virulence). T-DNA rnerupakm DNA yang ditransfer

ke dalam genom sel tanman, sedmgkan &aerah vir merupaXcan daerah penyandi y m g

%-plasmid mempunyai satu atau bebentpa T-DNA yang berbeda, dibatasi oleh

25 pasany basa susunan berulang (Nilsson dm O l s m 1997).

lnteraksi awal .$grobacterium dengan sel tanamm didrrhului dewm

pengadan Agrobacieriurn terhadap sel yang Iuka. Interaksi ini tmjadi secara kimiawi

dimma sel tanaman yang luka akan mengeluarkan suatu metabalit berupa senyawa

guia, asam amino atau senyawa fen01 (Winms 1992). Dengan admya mebbolit ini,

Agrobacrerium akan bergcrak &if (kemotaksis) menuju sel &arnan. Selanjuhlya

ferjadi kuntak: antara Agro bacterium dengm sel tanaman. Untuk memperkuat kuntak

sel tersebut Agrobacferium mengeluarlcrtn metabulit

P-

I ,2-glukan. Glukm diperlukan

untuk pengikatan sei tanaman bagi Agrobacterium. Behrapa gen &am krumosum

Agrobacierr'um y m g diketahui rnerupakm penyandi enzim yang berperan ddm

sintesis berbsgai senyawa glukan, yaitu chv A (merighasilkan protein yang berfungsi

untuk mentransportasikan

P-

1,2-glukan) dm chv B (mensintesis

P-

1,2-gluk:m], Gen

lain yang ikut bcrperan adalah cel, yaitu beyeranan dalam sintesis senyawa seldom

fibril (Douglas tsef ul. 1985).

Mekanisme selanjutnya addah induksi ftdktor vir ymg &an mengatur

pernotongan dm pernindahan T-DNA ke ddam sel tanaman. Faktor vir terindksi

akibat adanya scnyawa fen01 yang dikeluarkan tanman yang l&a. Beberapa senyawa

fen01 yang dapat rnengindulcsi fkktor vir 'rdaalah asetosiringuri, hidroksiasetosiringon,

koniferil alkohul, koniferin (feniprupunuid g1uHcosida) dm etil ftrulat (Winans 19921,

dapat rnenginduksi faktor vir, apabila asetosiringon tidak diproduksi

(Cangelasi et al, 19891,

Ada enam fakbr virulensi yang diketahui berfungsi dalam proses p e m i n d a h

T-DNA, yaitu vir A, vir B, vir C , vir

D,

vir E dm ~ i r G. Senyawa fenulik yang

dikeluukan tanaman yang luka &an menginduksi vir A unh& memprodulcsi suatu

, .1.

protein Vir A. Protein Vir A mengalami autofosforilasi dm &an menginduksi

fosfurilasi protein Vir

G,

Selanjutnya potein Vir G &an mengaktifkan gen vir Iainnya

(PawelI er a1.. 1989). Praduk berupa protein Vir Dl dm Vir

Dz

&an memotong

T-DNA pa& daerah flanking (daerab y m g susunan DNAnya bedang). Daerah

tersebut sebagai pembatas kiri (lefr border) dan pembatas b a n (~ight border) dari

T-DNA. Karnpanen pembaias kanan rnutlak diperlukm ddam transfer T-DNA

(Klee et al. 1987). Adanya pernotongan oleh gen 17ir D akan rnenyebabkm

terbentuknya rnalekul DNA u h s tunggal (ss-DNA) atau disebut dengan T-strand,

Stmktur T-sirund yang ditransfer dari sel Agrahucferium ke sel tanma*. menrpakan

komplek DNA-protein. Sdanjutnya protein Vir D2 &an mengwahkan patongan

T-DNA tersebut rnenuju nukleus sel ttlnamm. Protein Vir D2 juga diperlukan mtuk

integai T-DNA pada genum tanaman (Mysure e6 a!, 1998). Protein pi-uduk vir I3

akan merneaiasi transfer T-DNA ymg diduga membentuk pri y m g &an dilewati

oteh T-DNA dari sel Agrobacrerium ice sel tanaman. Kemudian proses ligasi dan

sintesis T-DNA utas komplemennya dilakukm oleh topoisomerase dm ligae

tanman. Selma proses transfer, T-DNA dilindwlgi aleh pratein pruduk vir C dm

vir E, Protein Vir C juga dapat berfungsi untuk meningkatkan aktifitas protein Vir

D

berfungsi rneiindunginya dari kerusakan akibat nuklease sel tanama~ Pengikatsn

protein Vir Ez pada T-strand yanp sangat kuat akan menjadikan sWtur T-komplek

stabil dm terjaya selama proses transfer. T-komplek ini diperLr&an panjmgnya

3600 nm dm lebar 3 nm, mzngmdung sekitar. 600 rnolekul Vir E2 dm m u rnalekul

Vir D2 dengm perkiraan berat rnolekdnya 50,000

kD

(Sheng dm Citavshj 1996).

2.5 EIrspresi T-DNA Pada Genom Tanaman

T-DNA yang ditrmsfcr ke dalztm sel tanman bisa lebih

dari

satu maiekul

T-DNA, sehingga di dalam krornosarn tanaman &an terdapat satu atau beberapa utas

T-DNA. Situs integrasi T-DNA pada kromosom tanaman bersifrtt ac& (Armitage

1 987). T-DNA &an terintegrasi dengan stabiI pada komasom tamm (Peterman

1997 ; Giri d m Narasu 2000). Gen-gen pada T-DNA &an diekspresikan aleh

Canaman untuk keperluan Agmbucterium.

T-DNA mengandung gen-gen yang beperan untuk biasintesis senyawa opin

(opine cufubolism), yaitu merupakan turunan guia dm a r m amino. Opin ti&

dimetabolisme o1eh tanaman tctapi dieksre-esikan ke lingkungan, dm dimetabaiisasi

aleh Agrobacterr'um, Upin dirnwfaatkan aiek Agrobscterium sebrtgai s u b karbon

dm nitrogen, Dengsm demikian t u j w Agrobacferium menginfeksi sel tanaman

adalah wtuk mensintesis senyawa apin (Nillsan dm Olsson 1997).

Di samping gcn-gen untuk rnensintesis apin, T-DNA juga rlrengandung

onkagen, yaitu gen-gen yang rnenyandi pembentukm hornon pertumbuhm auksin

dm sitakinin. Integrasi T-DNA di &lam krumosom tanaman mengakibatkan

homan. Hal tersebut rnenyebablcan perturnbuhan scl yang tidak terkuntroi. Ekspresi

dari gen inilah yang rnengakibatkan terbentuknya a h rambut.

Pada TR-DNA, gen yang b.:rfungsi untuk pemkntukan auksin addah iaaM

(gen 1, ims 1, avx 1, shi) dm iaaH fgen 2, tms 2, avx 2, shr). iaaM rnenyandi

pembentulcan triptafm 2-monoaksigenase yang &an mengkatdisis perubahan

L-tripto fm menj adi senyztwa indole-3 -asetamida. Sedmgkan iaaH rnenyandi enzim

amino hidrolase yang merigubah indale-3-asetamida menjp-di asam indole-3-asetat

(IAA) (Thomashaw et al. 1986). Gen i p f (gan 4, tmr, mi) mempstaan penyandi

enzim iso-penteniltrmsferase yang &an mengkatdisis sintesis sitokinin (sitoknin

iso-penteniladenosine 5'-monofosfat) dari dimetildil-pirofosf dan S'AMP

(Akiyoshi et al. 1 984).

Pada TL-DNA terdapat onkogen yang disebut dengm gen rol (root locus).

Gen yo1 rnenyandi pembentukstn protein, termstsuk protein yang terlibat d d m

regulasi rnetabdisrne hormon tanaman, White et al. (1985;) rnelalcukm pengujian

genet% pada Ri piasmid dari A. rhizogenes dm ditemukan adanya empat gen rol

yaitu rul A, r01 B, rot C dm rub D. Hwil pengujian rnenunjukh bahwa protein

prod& dari hrbagk gen ral beperan dalam meningkatkan sensitivitas sel tanaman

terhadap adanya auksin. Selain itu produk gen rol juga diduga mendorang

tanaman inang untuk mensintesis auksin sehingga mengakibatkan terjadinya

pembentukm &are

Vilaine er al. (1 987) menjelaskan bahwa ixduksi stkar y m g disebabkm oleh

rol A mernberikan suatu perubahan fenotip dm rnenmbah efek pelukaan pada

pembentukan akar rambut. Selain ilu juga terdapat rol C dm rul

D

yang fungshya

didupa juga bzrhubungm dengan pertumbuhan

akar rambut.

Menurut Nillson dm

Olsson (1 997) ekspresi gen rol secam bersama akan mernberikan efek yang Iebih kuat

dari p d a hmya satu %en.

2,6 Kultur Akar Rambut Dalam Praduksi MetaboXit Sekunder

Kultur In vitro ttlah banyak digunakan untuk tujuan produksi metablit

sekunder. Tehik kultur yang sering digunakan diantaranya addah kultur kdus,

kultur suspensi sel dm kultur organ. Teknik: hi kmrientasi pada tmri totiptensi sel.

Totipotensi sel tersebut disebabkm semua sel Aiciup suatu tamman mmniliki DNA

yang sama. Hal ini berarti bsthwa sel mengandung semua informasi genetik

yang sama.

Pada kultur organ, akar merupakan surnber metabulit sekunder y m g penting,

temtma untuk jenis-jenis persenyawam yang berasasiasi dengan &ar, Kultur aka

yang diisolasi pada umumnya merniliki sifsat-sifat morfologi ywng sama seperti &ar

yang terdapat pada tanaman. Pada ujung &ar juga terdapat quiescent c e m r dm pula

penyebaran, pembuluh yang spesifik dari spesies masih &pertahadcan (Gunawan

1992). Alcar yang sudah diisoiasi bistsanya diturnbuhkm dalam media cair dengm

pengocokan perlahan-lahm. Untuk rnendapatkan kultur &a dengan pertumbuhan

ymg optimal d m dalam w&tu yang lama dapat dilalcukan dengan memberikm

nutrient dm hormon yang tepat. White (1934) ~ U I I I M Gumwan (1992) berhasil

memperlihatk? perturnbuhm akar yang tidak terbatas dalam kultur &a tomat

hrhmil melakukan kultw akar beberapa spesies tertentu dari Nicotiana seperti

N. langsdorfii dan N fabucurn. Pemanfaatan kultur akar untuk produksi metablit

sekunder teIah banyak dilakuksn, misaXnya produhi ginseng dari aka Panax gimeng

dm produksi shikonin dari

akar

Lifhospermurn. Namun karena pertmbuhan

akar

yang relatif lambat, kultur &ar menjadi tidak digunakan Iagi &lam pmduksi

rnetabolit sekunder.

Kdtur akar krkembmg 1agi sejak ditemukan A. rhizogenes yang h a t :

menginduksi pernbentukan akar pada tanaman yang terinfeksi. A h yang terkntuk

dapat tumbuh dengan cepat. dan juga tidak memerlukm human pertumbulnan

eksogen. Akar tersebut sering disebut dengan "Hairy rooff'

(dm

rambut) karena

umumnya mernperlihatkm morfologi ymg bertPeda dengm &ar tamman induknya.

&=-dm

tersebut biasanya rnernbentulc cabang-cabang lateral dm rmbut-mbut

&ar yang lebih banyak.

A k a rambut terbentuk kslfena integasi T-DNA pada genorn sel tanman.

T-DNA merupakan bagian dari DNA piasmid A. rhr'zogenes y m g ditrmsfer ke dalm

sel tanaman yang terinfeksi. T-DNA mengandung gen-gen untulc mensintesis harmon

pertumbuhn, Ekspresi dari gen-gen tersebut daiam sel tanman mcnyebabkm

terbentuknya

akar

adventif pada tempat infeksi.

Kultur aka rambut telah banyak dikembangkm pada berbagai jenis tanaman,

terutama untuk produksi metabolit sekunder. Sejumlah penelitim kultur A m rambut

untuk produksi metabolit sekunder antara lain produksi alkaloid trogane dari kuttur

belladonna dm Calystegia sepium (lung dm Tepfer 1987) dm produksi sapunin dari

Panax gimeng (Yoshi kawa dm h y a 1 987).

Keunggulan kultur a k a rambut dibandingkm dengan kultur lainnya adalah

perturnbuhm sel yang cepat dm tidak rnernerlukm z6lt pengatw tumbuh, sintetik.

Selain itu sifat gendiknya tetap stabil dengan pmduksi metabofit sekundw yang

tinggi. Momciiovic et al. (1997) memmukm

TR

d m TL-DNA dari A. rhizogenes

tetap stabil pada &ar rambut Geritima yang telah b e m u r lebih dari satu tahun.

Sedangkan Ladhi d m Charlwoad (1996) bwhwil mendapatkrtn &umulasi total

mtrakuinan dm alizarin dalam aksr rambut Rtkbiu peregrina L masing-masing dua

kdi dan tiga kali lebib tinggi dari pada &ar biasa yang b e m w 1 tahun. Tm&a

(1999) juga melaporkan b&wa Vinca minor yang ditrmsfomasi dengan gdw

MAFFF03-0 1724 merighasilkan vinkmin dm kali lebih tinggi dari tmmm ymg

ti&& ditransfomasi. Sedangksm Ssluerwein d m Shirnamora (I 999) juga mendapatkan

dkaloid yang , s m a sebmyak 2% dmi &ar Hyoscyapnus albui yang ditrmsform%si

dengan galur yang s m a , dm dikuitw pada medium Garnborg dengan 3% sukrosa.

Keuntungan lain dari akm mmmb hhasil transfarmasi gen dari A, rhizogenes

adalah dapat dilakukan pnyisipiur gen-gen ymg bertujuan untuk nreningkatkm

produksi metabof it sekunder. Boehm et a/. (2000) berhwtsil mendapatkan peningkatan

produksi shikonin sebsar 22% dmi kontlrol pada kultw &m rambut Lithospermum

eryfhrorhizon dengan menyisipkan gen uhi A. Akar rambut juga dapat beregenemi

mmjadi tunas d m tanaman lengkap, Kecepatan pertumbuhm dm frekwensi

Selain itu macam-macam fenotip yang timbul dari regenerasi &ar rambut merupakm

HmiU et al, (1989) rnelakukan kultur akw rmbut p#da tanaman kina

in vilro dengan A. rhizogenw ggalur LBA 9402 dan R1000. Hail y m g diproleh

rnenunjukkan bakwa akar rambut lebih banyak terinduksi oleh LBA 9402, namun

perhrmbuhan aka sangat lambat. Beberapa aka hasil inokulasi LBA 9.:i)2 tersebut

d i k u l t w h di ddm medium

BS

dengan 3 % (w/v) sukrosa. Dari kultur tersebut

hrhasil diperoleh kinin, sinkonin dan kuinidin sebagai kompanen utama sekik

50pg/g babot basah setelah dikuittar 45 h a i , H a i l teabut masik rendah

dibandingkan dengan tanaman secwi alami. Selmjutnya Geerling el al. (1999)

melstkukan kultur akar rambut padst C. oficinalis dengan menyisipkan dua gen kunci

dalam biasintesis alkaIoid kuinolin ymg krasal, d a i Cutharaptrhus ~.oseus, yaia

triptofan dekarboksilase (TDC) dm striktusidin sintase (STR). Untuk rnendapatkm

akar rambut ymg merigandung gen fdc dan srp, inokulasl dClakuZcan pada dam

tanaman hmi1 perkecambdm benih s e w a rnksenik dengm menggunakan

A. rhizogenes galw 9402 ymg teIafr rnembawa kedua gen tersebut. Dengan

penyisipan gen tersebut diperoleh peningkatan kuinin dm kuinidin masing-masing

sampai SOOpg/g dm 100pg/g b b t Irering, n m u n satu tahun setelah andisis, &a

2.7. Folktor-Faktor yang Mempengaruhi Kultur Aksr Rambut.

Pengguwn kultur &a r m b u t hasii transabrmasi genetik A. rltizogenes unt&

rnemperoleh senyawa metabatit sekunder telah banyak dilakukan pada berbagai jenis

tanaman, Pertumbukan akar rambut yang cepctt dan kemmpuam sel untuk mensinksis

senyawa-senyawer kmia &pat dijadikan sebagai swnbr untuk memgroduksi

rnetabolit sekunder secarst terus-menems. Untuk merzdapah pertumbuhm kultur

dengm produlcsi rnetabolit sekunder y m g tinggi kundisi kulm hams diatur pada

tin@& optimal.

KuItur &a m b u t mengikuti pala pertwnbuhan tertentu, a h tetapi prodhi

metabulit sekunder rnungkin tidalc berhubungan dengan pertumbuhm Inrltur. Menurut

Giri dm Narasu (2000) biosintesis metablit sekunder di ddam kultur aka rmbut

dikontrol secara genetik, teapi juga dipengaruhi oleh nutrisi dm faktoi lingkungan,

Komposisi medium kultur bepengaruh pada pertumbuhan dan produksi metablit

sekunder.

Di ddam kultur jaringan, ada tiga jenls medium kultur yang d i g t d a n yaitu

medium padat, semi padat dm a i r . Medium tersebut: tersusun dari gam-garam

mineral atau nutrient marganik yang terdiri atas unswr-unsur m&o dan &o,

sumber karbon yang biasanya berupa gula atau sukrosa, vitamin, asm mino, zat

pengatur tumbuh dm zat-zlat tslmbahan orgmik Xainnya, seperti air kelapa, ekstrak

ragi, ekstrak kentang dan sebagainya.

Sulxosa rnerupakan sumber k w b a paling baik dm dihidrolisis menjadi

glukosa dm fruktosa oleh sel tanaman selama asimiki. Di ddam aka rambut tingkat

produksi metabolit sekunder. Emawati (1 990) melaporkan - bahwa peningkatan

konsentrasi sukrosa sampai 6% meningkatkan produksi senyawa anti jamur pa&

kultur akar rambut P. tinchioriurn Ait. Sebdiknya Granicher el al. (1992)

rnernperoleh praduksi valepatriates dalam kultur akar rambut V. oflcirulis

L

paling

tinggi pada medium setengah Gambarg B5 dengm 2% sukrosa dibandingkm deqan

3% dm 5% sukrosa.

Nutrient anorganik m&o rneliputi unsur-unsur K, N, Mg, P, Ca, S, Na dm

C1, sedangkan nutrient mikra meliputi unsur-unsur I, 3,

Mn,

Zn, Mo, Crr, Co, Al, Ni

dm Fe. Untuk pertumbuhm akar rambut, diperlukan susunan, nutrient dl, dalam

medium yang h a s dicukupi s w a a kualitatif maupun kuantitatif. Hal i;ti sebagian

besar tergmtung kepda keadaan fisiofogi jaringan tersebut. Di samping susunm

nutrient, tekanan osmosis dm kekuatm ion ymg ditimbdkan di dalam sel juga

b e r p e n g d pada perturnbuhztn akar rambut. Menunat Sikuli dan Derneyer (1997)

perbedam kandungan ion-ion di dalam medium

B5

yang digunakan sebagai medium

kultur stlrar rambut Datura srrumoniuwz ternyata b e r p e n g d t a h d a p produlcsi

hiosiamin dm tropin. Produksi hiosimin diperaleh lebih tinggi pada medium

B5

dengan kandungan SO:- dm K' dorninan. Sedangkan produksi tropin lebih tinggi

jika kandungan

ca2'

dan NU3' dominan. Ernawati (1 990) rnemperoleh media terbdk

untuk merangsang pertumbuhan aka rambut

P.

tiachtorium Aif adalah media

MS

yang rnengandung 2mM NH4N03 15g/1. Dernikian jugst b b t kering dm antosianin

ymg dihasi I kan, Di samping iru penghi langm fosfor clari media meningkakan

Sebagai zat tambahan beberapa vitamin yang sering digunakan &lam kultur

jaringan adalah tiamin (vitamin B1), asam nikotinat (niasin) dm piridoksin (Bs).

Vitamin-vitamin tersebut irerhgsi sebagai kaenzim dalam mehbolisme karbokidrat

d m prutein, Menurut Lehninger (1975) tiamin menrpakm koenzim dalam proses

transfer kelornpuk aldehida, sedangkan niasin rnerupakm kaenzim dalam proses

transfer elektron atau sttorn hidragen, dm piridoksin mempakm koenzim dalam

proses transfer kelornpak amino.

Kecudi ,susunm medium buatm, pemilihn pengunam medium padat atau

a i r juga rnexzentukan berhasil ridaknya suatu kultur tumbukan, Pada umumnya

pemilihan medium padat atau cair diiakukan sesuai dengan kebutuhan dm tujuan

penelitim serta fmilitas yang tersedia. Pada kultw &ar rambut m m y a

menggunakm medium cair karem laju perkmbuhm kuItur lebih cepat. Menurut

Gunawan (1992) pertimbuhan ymg lebih: cepat pada medium cair kernungkinm

disebabkan aleh p e m u k a n eksplm ymng kontak langsung dengan media lebih luas

dm penyerapan nutrient Iebih efektif,

Faktur lain yang berpengaruh pada perEumbuhan kulhx akw rambut addah

lingkungm tumbuh, dimtumyil suhu, kelembaban u h ,

pH

dm cafraya,

Lingkungan tluxlbuh yang optimum untuk pertumbuhm kultur bervariasi ctntara

spesies. Toivonen el a/. (1992) memperoleh pertumbuhan d a r rambut Cutharanrhus

roseus paling cepat apabila dikdturkan pada suhu 32°C dib&dingkan pada suhu

Selain itu Ikenaga et a!. (1995) melaporkan bahwa prtumbuhan dm praduksi

dikulturkan d a l h kondisi terany. Steroidal saponin tidak diperoleh pada akar rmbut

yang dikulturkan dalam kandisi ge1ap.

2,s Zat Pengatur Tumbuh

Zat pengatur tumbuh merupakan persenyawam organik selain dari nutrien

yang dalam jumlafi sedikit (ImM) dapat merangsang, menghrunbat abu rnengub*

pola prtumbukm d m perkernbangan tanaman (Gunawm 1992). Zat pengatur

tumbuh terdapat secara alami di dstlam t m a n (endogen), Selain zat pengatur

t u b & alami juga ada zat pengatur tumbuh sintetik (eksogen) yang telah dijual

secara komersil.

Pada saat ini d i k e d enam icelompok zat pengatur twnbuh yaitu auksin,

giberelin, sitokinin, asam absis f k (ABA), etilen dan retardan. Seny awa-senyawa

palimin @utresin, spermidin, spermin), pulifenotilc, dm alkohol bermtai pmjang

(Triakontanof) sering diguiongkan ice dalam zat pengatur tumbuh (Wattimena 1992).

Di dalm kultur jaringan dua galangan zat pngatur tumbufi yang sangat penting

adalah auksin d m sitokinin. Zat p:ngatur tumbuh ini mempengaruhi perturnbufian

dan morfogenesis sel, jmingan dm organ tanaman,

Auksin digunakm secara has ddam kultur jaringan tamman untulc

merangsang pertumbuhan kdus, suspensi sel dan pertumbuh ak:w atau organ

lainnya. Tindakm auksin yang paling karkteristik adalah rneningkatkan p m b e l k

sel dm mendorung ~"rpanjangan sel (Wilkins 1992).

Pengaruh auksin terhadap perturnbuhan jaringm tanaman diduga kaxena

menyebabkan susunan matrik dinding sel rnerenggang dan ion K' mas& ke dalam sel

sehingga rnengurangi potcnsial air dalam sel

.

Keadaan tersebut menj ibabkan air

masuk ke dalm sel

dan

sel menjadi rnernbesar. Pengaruh lain dari auksin terhadap

trtnman juga diduga h e m dapat m e m g e n g d i metabulime RNA yang b e m i

metahlisme protein. Hal tersebut kemungkinm meldui traylskripsi molekul RldA

(Abidin

X

990 ; Gunawan 1992 ; George dan Sherringtan 1984).

Auksin alamiah pada tanaman adalafx a m indol asetat (TAA). TAA disintesis

dwi triptofan dalam primordia daun, dstun muda dm biji yang sedang berkecmbah.

Transhkasi di ddam tanaman terjadi rnelalui flaern. Sedmgkan auksin sintetik, selain

IAA juga ada asam indol butirat dm herbisida yslng bersifat auksin yaitu asam

2.4-diklorofenoksi asetat (2.4-D), asam 2.4.5 -trikloro asetat (2.4.5-T), asam ndhlin

asetat (NAA), Dikamba, Pikloram dll.

Pada &ar rmbue h i 1 transfomasi genetik bakteri A. rhizogems terdapctt gen

untuk menyandi sintesis auksin endogen. Gen yang berasai dari plasmid baktei

tersebut addah iaaM dan iau1-I. Ekspresi dari gen-gen tersebut &an mensintesis

auksin alamiah, yaitu IAA.

Di samping auksin, sitokinin juga penting dalam pengatman p m b e l h sel

dm morfugenesis. Sitokinirr adztiah kelampok senyawa orgmik ymg menyebabh

pembelahm sel yang dikenal dengan proscs sitokinesis. Pemklahan. xl,;tosis tid&

&an terjadi tanpa sitakinin (Wattirnena 1992).

Sitokinin y m g pextama &Xi ditemukm adalah kinetin (6-furfuril mino purin)

yang diisolasi dari DNA ikan Herring (Gunstwan X992), Sitokinin yang terdapat

adenin dm mtai samping add&* isopenti1 yang berasal

dari

asam mevdonat.

Biusintesis zeatin terntamst diujung &ar dm ddm biji yang sedang berkecambafi.

Translokasi zeatin terutama meldui xilem (WatEimena 1992). Sitalcinin sintetik terdiri

dari -in, bemil adenin purin (BAP), 2-iP, Kinetin dll.

Sama seerti auksin, gen untuk rnenyandikn sirntesis situkirrirr juga terdapat:

di ddam sel akar rambut. Gen tersebut adalah gen ipr yang juga berasal dmi

&ansfomasi b&teri A. rhizogenes. Oleh karena a h y a gen-gen tersebut, zat

pengatur hunbuh eksogen jarmg digunakm untuk menginduksi akar rambut.

Biasanya di dalam kultur akar rambut, penambahan zat penngatur tumbuh ehagen

bertujuan untuk regenemi aka rambut menjadi m a s atau untuk; pembcntukan kalus.

Sedangkan kultur &a rambut mtuk rnemproduksi rnetabolit sekunder tidak selalu

membutuhkan zat pengatur tumbuh eksogen. Bimanya penmbthn zat pengatur

tumbuh eksogen diperlukm untuk meningkatkan laju pertmbuhan aka

tr

produicsi

metabulit sekunder y m g dihasilkm, &an tetapi tergantung pada spesies tanaman d m

jenis zat pengatur tumbuh.

Pengaruh xat pngatur hunbuh eksogen terfradap pertum5uhan dm

pembentukan metabulit sekunder dalam akar r~~llbue sangat beragam antara spesies.

Pada aka rambut Solmum ucatleatissinaum, penmbahan NAA dan EAA 100 pglI

pada medium kultwr dapat rneningkatkan praduksi steroidal saponin walaupun tidak

ternyata naenghambat perturnbuhan &ar d m produlcsi steroidal sapanin (Ikenaga

antara 0,Ul sampai

1,U

mg/l pada medium kultur temyata iidak berpengaruh pada

perturnbuhan akar rambut ledgeriana (Hamill el ul. 1989).

2.8 Polinrerase Chain Reucffon PCR)

Pa& akar rambut terjadi penyisi@inte@sasi DNA

dari

A. rhizage~les pada

genom sel tanaman. Penyisipm ini akan merub& susunsur nuIclwtidEt DNA seI

tanaman dan rndrubah ekspresi gen dari sel tanaman untuk mernbentuk akar rambut.

Integrasi DNA tersebut dapat dideteksi secara PCR. Menurut Dale (1994) dm

Geerlings et al+ (1999) metoda ymg lebih cepat dm &curat yang banyak dila3cukrtn

saat ini untuk menguji keberhasilan irztegrasi DNA bakteri pada sel tanaman adalah

dengan teIrnik PCR,

PCR merupakan

proses sintesis enzimatis untlrlc mengmplikasi unrtm

nukleotida DNA secara in vifro ( h d g r a f dan Wolfes 1993). Amplifikasi DNA

dengan PCR dapat meningkatkm jumlah urutan DNA secaa cepat dm bisa lebih d a i

jutam kopi. Aplikasi PCR antara lain untulc rnendeteksi adanya DNA spesifik,

adisis DNA finger printing dengm rnetode U P D (Random Amplified Polirnorpkic

DNA) dm untuk mendeteksi terjadinya rnutasi (Thomas 1996).

P d a prinsipnya ada tiga proses ymg terjadi ddam reaksi PCR. Proses

pertma adalah denaturasi, mempaketn proses pemisahm rank ganda DNA rnenjadi

utas tunggal. Proses ini memerlukan suhu y m g tinggi, yaitu b l w y a antara

94'C

-

97T. Proses ymg kedua a&l& annealing, merrrpakm proses penempelan

primer sebagai pernula untuk sintesis DNA. Pada proses annealing rnemerlukan suhu

oleh psnjang, banyak G dan C dalam primer dm konsentrasi garam lamtan bufer.

Proses y m g terakhir adalah extention, rnentpakm proses perpanjangm primer. Suhu

extention tergantung pada pmjmg dm konsentrasi dari susunan DNA target.

Urnumnya perganjangm primer tedabi pada suhu 72°C karena pada suhu ini enzirn

Taq palimeruse bekerja optimal untuk. sintesis DNA (Xnnis dm Gel f a d 1990).

Primer addah ranhi DNA