Metoda dalam Biologi
Molekuler
2005-Biologi ITB
Tahap isolasi gen
Isolasi DNA total Memotong DNA ke dalam vektor
(misal: plasmid/bacteriophage)
Transfer vektor ke dalam sel inang (transformasi) Seleksi sel inang yang mempunyai vektor+ insert
1. Seleksi dengan antibiotik 2. Seleksi putih-biru 3. Analisis dengan enzim restriksi Fragmen hasil PCR à
klon ke dalam plasmid Isolasi DNA total
Perbanyakan dg metoda PCR
Identifikasi gen tertentu dg
“Southern blotting”
Isolasi RNA total
Reverse Transcriptase (RT) PCR
Potongan DNAà ligasi (kloning)
Sekuensing urutan DNA
1. Isolasi DNA/RNA
2. PCR
3. Elektroforesis
4. Memotong & Menyambung DNA
5. Vektor, kloning ke dalam plasmid
6. Transformasi & seleksi
7. Southern/Northern blotting
Istilah klon
Greek: Klon = twig (ranting) à
stek
Kultur jaringan merupakan teknik kloning
tumbuhan/hewan
1973 : Stanley Cohen dkk berhasil
memperbanyak satu potong DNA dalam sel
bakteri
DNA dapat bereplikasi sama seperti aslinya
dalam sel bakteri untuk kemudian dapat
1. Isolasi genomik DNA/RNA
Penghancuran membran dalam bufer ekstraksi+detergen
Jaringan hewan/bakteri /tumbuhan
Ekstraksi fenol-kloroform
Pencucian pelet DNA dengan etanol 75%
Jaringan hewan/bakteri / tumbuhan
Penghancuran membran dalam bufer ekstraksi+detergen
Ekstraksi fenol-kloroform
Tambahkan oligo dT
RNA & oligo dT ditransfer ke kolom
Elusi RNA dgn bufer elusi
Ekstraksi fenol-kloroform dan pencucian pelet mRNA dgn etanol 75%
As. Nukleat terutama RNA dr organisma dapat dgn mudah terdegradasi selama isolasi à perlu
mencegah degradasi oleh nuklease selama isolasi u/ RNA , misalnya dengan penambahan:
Bufer mgdng protease u/ menghlgkan nuklease Inhibitor RNAse
PVP
u/ DNA digunakan 2-mercaptoetanol, SDS, DTT Menghilangkan RNA dr DNA hasil isolasi dgn
Isolasi RNA spesifik dg metoda afinitas
Populasi RNA dapat difraksionasi menjadi spesifik RNA
misal :
isolasi mRNA dengan adanya ujung poly A
Penambahan nukleotida analog sbg marker spesifik sblm ekstraksi: RNA disintesis in vitro
dengan penambahan nukleotida analog (memiliki grup sulfidril dan biotin yg berikatan ke mercuri dan streptavidin pd kolom matrik/butiran magnet) utk membedakannya dg RNA lain
Biologi Molekuler 2005-Biologi ITB
3. Elektroforesis
Pemisahan DNA
Pemisahan DNA untuk isolasi dan analisis dgn metoda elektroforesis
DNA fragmen yang linier dipisahkan berdasarkan ukuran lewat gel agar agarorosa atau poliakrilamida
Agarosa adalah polisakarida dari rumput laut dg konsentrasi 0.5% to 2% (mass/volume i.e. 0.5 to 2.0 g agarose/100 ml of
aqueous buffer) biasa dipakai utk memisahkan DNA berbagai ukuran
Pemisahan DNA dilakukan dari kutub positif à kutub negatif dengan voltage tertentu karena DNA bermuatan negatif
DNA yg telah dielektroforesis dapat diwarnai dg metoda kimia ethidium bromide yang berikatan pada DNA (DNA chelator)
Sinar UV yang berflouresence dpt digunakan utk deteksi DNA
4. Memotong DNA
Endonuklease ditemukan pertama kali
1960, Stewart Linn dan Aber Werner pada
E. coli.
Berasal dari bakteri yang resisten terhadap
bacteriophage
Endonuclease :
memotong di bagian
dalam DNA
Sayangnya penemuan Linn & Arber tidak
memenuhi harapan: endonuklease yang
ditemukan tidak spesifik memotong DNA
pada sekuense tertentu.
Gunting molekuler pertama ditemukan
adalah
Hind
diisolasi dari
Haemophilus
influenzae
strain R
d. Hind endonuklease
dapat terdiri dari 3 macam masing masing
memiliki spesifikasi pengenalan terhadap
sekuens tertentu
Macam-macam endonuklease
HindII (Py =TC;
Pu=AG)
HindIII
MboI (frekuensi
tinggi)
SmaI dan XmaI
(Isoschizomers)
GTPy PuAC
A AGCTT
GATC
5. Menyambung DNA
Ligase
Berasal dari
Bacteriophage (T4)
Membentuk 2 ikatan
kovalen antara ujung 3’ OH satu nukleotida dengan
ujung 5’ fosfat dari nukleotida lain
6. Vector
Ciri-ciri:
• DNA
• Dapat bereplikasi sendiri
• Dapat disisipi DNA asing
• Ada marker: • mendeteksi adanya vektor • mendeteksi adanya DNA asing Macam-macam vektor • Plasmid • Virus
• Kombinasi plasmid dan
virus Macam-macam marker • gen resistensi antibiotik • gen lacZ (β- galaktosidase)
• gen untuk sintesis
Vector
λ
phage
Charon phage
λ
phage dapat melakukan klon DNA ukuran
12 Kb s/d 20 Kb (20.000 pb), bandingkan
dengan plasmid hanya 0.5-5 Kb.
Cosmid
DNA insert dimasukkan pada Cos site dari
λ
phage DNA
Dapat mengklon DNA dengan ukuran
40- 50 kb
21
Northern & Southern
Blotting
Pendahuluan
22
Blot/Blo'ng Teknik memindahkan atau mentransfer DNA,
RNA, protein ke lembaran tipis atau matriks
membran. Teknik ini berupa lanjutan dari penggunaan elektroforesis gel.
Pengertian
Berdasarkan Tipenya, terdiri atas :
Southern Blo'ng
(DNA) Blo'ng (RNA) Northern
1
2
Western Blo'ng (Protein)
Southern Blotting (DNA)
23
Southern Blo'ng (DNA)
Keuntungan teknik blot :
a) Akses yang lebih besar kepada molekul yang telah terikat
ke permukaan lembaran dibandingkan kepada molekul yang masih berada di dalam gel atau matriks.
b) Lebih sedikit reagen yang dibutuhkan.
c) Waktu untuk melakukan staining dna destaining, inkubasi,
mencuci, dll dapat lebih singkat.
d) Pola yang terbentuk dapat dikeringkan dan disimpan
berbulan-bulan sebelum dianalisis.
e) Dapat dibuat banyak replika pola tersebut untuk
memungkinkan banyak metode analisis yang dipakai
Pengertian dan Sejarah Southern Blotting
(DNA)
25
Southern Blo'ng (DNA) Pengertian
Sejarah
Metode ini ditemukan oleh seorang ahli biologi d a r i I n g g r i s y a n g bernama Edward M.
S o u t h e r n , y a n g
m e n g e m b a n g k a n prosedur ini pada tahun 1975 di Universitas Edinburgh
Sebuah metode yang sering digunakan dalam bidang Biologi Molekular untuk menguji keberadaan dari suatu sekuen DNA dalam suatu sampel DNA.
Komponen-Komponen utama pada Southern
Blotting (DNA)
26 Membran Nitroselulosa DNA probeMembran Nitroselulosa digunakan sebagai tempat hasil jiplakan fragmen DNA dari gel agarosa
Ø Merupakan sutau fragmen dna yang berfungsi
sebagai pelacak target gen
Ø Harus bersifat spesifik dan komplemen terhadap
Lanjutan...
27
Larutan Buffer
DNA
Larutan buffer berfungsi untuk membawa DNA dari gel dan
mengimobilisasi DNA pada membran (Larutan akan bergerak dari konsentrasi tinggi ke konsentrasi rendah)
Merupakan materi atau molekul yang akan diidentifikasi pada tekhnik Southern Blotting
Berfungsi untuk memotong DNA menjadi suatu fragmen tertentu
Tahap- tahap Southern Blotting (DNA)
28 Isolasi DNA dan
Pemotongan DNA 1 Fragmentasi DNA dengan Elektroforesis 2 Hibridisasi DNA 4 Transfer DNA ke Membran (Blot) 3 Deteksi DNA 5
Tahap 1
29
Tahap untuk memperoleh
DNA yang akan dideteksi.
Pemotongan DNA yang
ingin diperoleh dilakukan
dengan menggunakan
e n z i m r e t r i k s i
(endonuklease retriksi)
yang bersifat spesifik
terhadap DNA
Isolasi DNA dan Pemotongan DNA
Tahap 2
30
Ø Merupakan tahap dimana
Fragmen-fragmen dari DNA akan terpisah berdasarkan ukuran berat molekulnya.
Ø B e r d a s a r k a n p r i n s i p
elektroforesis, Fragmen DNA yang ukuran berat molekulnya lebih kecil akan lebih cepat bergerak dari kutub negatif kekutub positif d i b a n d i n g k a n d e n g a n fragmen DNA dengan berat molekul lebih besar.
Fragmentasi DNA dengan Elektroforesis gel
31
Denaturasi DNA
Ø dengan merendam gel dalam larutan Proses denaturasi DNA dilakukandenaturan (NaOH )
Ø NaOH bersifat basa sehingga dapat
menyebabkan rusaknya ikatan hidrogen antar untai DNA
Ø Ikatan hidrogen antar untai DNA
yang putus menyebabkan struktur
DNA yang semula double heliks
Tahap 3
32
DNA yang telah diperoleh kemudian ditransfer ke membran nitroseluloasa, tahap inilah yang disebut dengan
blotting.
Transfer DNA ke Membran nitroselulosa
Tahap ini dapat dilakukan dengan 2 pilihan metode, yaitu:
33 Gel agarosa dijiplak pada
membran nitroselulosa
Ø Merupakan salah satu metode
tahapan transfer DNA ke
membran nitroselulosa yang berdasarkan pada prinsip
Kapilaritas
Ø Kapilaritas adalah peristiwa
naiknya zat cair pada pembuluh, celah atau pori-pori kecil
Tahap 4
34
Ø Hibridisasi DNA adalah
proses pembentukan
molekul double helix dari
single strand DNA probe dan
single strand DNA target
Ø Tahap ini terjadi ketika
membran nitroselulosa
direndam dalam larutan yang berisi probe DNA Ss* (diberi radioisotop)
Hibridisasi DNA
Tahap 5
35
Ø Merupakan tahap lanjutan dari proses hibridisasi DNA yang
menggunakan pelacak/probe
Ø Probe biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa
ditandai dengan aktifitas spesifik radionukletida.
Ø Pada tahap deteksi DNA digunakan Autoradiogram untuk
melihat lokasi sinyal DNA
Deteksi DNA
Southern Blotting (DNA)
36
Northern Blo'ng (RNA)
Pengertian dan Sejarah Northern
Blotting (RNA)
Northern Blo'ng (RNA) Pengertian SejarahNorthern Blot atau
RNA Blot dikenalkan
pertama kali oleh
Alwin pada tahun
1977
Ø Secara umum teknik ini mirip dengan
Southern Blot, akan tetapi sampel yang digunakan, yaitu RNA.
Ø Prinsip northern blot adalah
memisahkan RNA berdasarkan ukuran dan terdeteksi pada membran
menggunakan probe hibridisasi dengan urutan basa komplementer untuk
semua, atau sebagian, dari urutan mRNA target
Komponen-Komponen utama
Ø Membran digunakan sebagai tempat hasil jiplakan
fragmen RNA dari gel agarosa formaldehid
Ø Membran yang digunakan pada Northern blooting adalah
nilon
Ø Probe atau RNA probe adalah fragmen
yang digunakan untuk hibridisasi asam nukleat
Ø Probe dilengkapi semua, atau sebagian, urutan
basa komplementer dari urutan mRNA target. Formaldehid
Membran
Probe
Tahap- tahap Northern Blotting
Isolasi RNA Elektroforesis
Prehibridisasi dan hibridisasi dengan probe Pencucian 1 2 5 Transfer ke membran dan imobilisasi 3 Deteksi 6 4
Isolasi RNA
1Isolasi RNA dapat dilakukan dengan beberapa tahap berikut, yaitu :
Penghancuran dinding sel
Penghilangan protein
dan DNA Pemurnian RNA
Ø Lisis dilakukan
menggunakan
detergen
Ø Pengotor akibat lisis
sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi
Ø Kemudian molekul
nukleotida (DNA dan RNA) dipisahkan dari protein menggunakan
fenol
Enzim DNAase
digunakan untuk menghancurkan
DNA sehingga RNA diisolasi secara utuh
Purifikasi RNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan tersebut dengan PCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan RNA dari larutan, dan mengendapkan.
Elektroforesis
2
Gel dapat diwarnai dengan
ethidium bromide (EtBr)
dan dilihat di bawah sinar UV untuk mengamati
kualitas dan kuantitas RNA sebelum blotting.
Merupakan tahap dimana RNA dielektroforesis menggunakan gel agarosa formaldehida
Transfer ke membran dan imobilisasi
3
q Tahap dimana RNA yang sebelumnya telah
berhasil diisolasi kemudian ditransfer ke membran nilon
q Membran nilon dengan muatan positif paling
efektif untuk digunakan dalam northern blot karena asam nukleat bermuatan negatif sehingga memiliki afinitas tinggi.
q Transfer buffer yang digunakan mengandung
formamida karena menurunkan suhu dari i n t e r a k s i p r o b e - R N A y a n g d a p a t menyebabkan degradasi RNA.
S e t e l a h R N A d i t r a n s f e r k e membran, maka membran harus segera disiapkan untuk crosslink
RNA dengan sinar UV Tujuan
crosslink RNA adalah untuk
membuat RNA terikat kuat di membran
Prehibridisasi dan
hibridisasi dengan probe
4
T u j u a n d i l a k u k a n n y a prehibridisasi sebelum hibridisasi adalah memblok bagian
nonspecific untuk mencegah probe yang single strand dari mengikat sembarang bagian pada membran.
q Hibridisasi asam nukleat
mensyaratkan bahwa probe ini melengkapi semua atau sebagian, dari urutan mRNA target
q Probe harus diberi label baik
dengan isotop radioaktif (32P)
atau dengan chemiluminescence di mana alkali fosfatase atau
horseradish peroxidase (HRP)
memecah chemiluminescent substrat menghasilkan emisi terdeteksi cahaya
Pencucian
5
q Tujuan dari pencucian membran adalah untuk memastikan bahwa
probe telah terikat secara khusus dan untuk mencegah sinyal balik yang timbul
q Hal ini juga dilakukan untuk menghilangkan unhibridisasi probe,
Deteksi
6
Tahapan deteksi dalam Northern Blot dapat dilakukan dengan 2 cara yaitu :
RadioakMvi tas Non-radioakMf Probe ditandai dengan 32P (atau 33p) Deteksi dilakukan dengan pewarnaan, misalnya dengan teknik chemiluminescence
Jika probe radiolabeled
selesai digunakan, blot disimpan dalam bungkus pastik agar tidak kering k e m u d i a n m e m b r a n d i autoradiografi dengan X-ray
Perbedaan Tekhnik Southern dan Northern Blotting
Southern Blo'ng Northern Blo'ngDeteksi molekul DNA (ds) mRNA (ss) Membran Nitroselulosa Nilon
Elektroforesis gel Gel agarosa Gel agarosa formaldehid Perawatan gel Pemurnian, denaturasi
dan netralisasi
-Metode bloFng Transfer melalui kapiler Transfer melalui kapiler Probes DNA (radioak&f dan
nonradioak&f) cDNA, cRNA (radioak&f dan nonradioak&f) Sistem deteksi Autoradiography,
Chemiluminescent Colorimetric
Autoradiography Chemiluminescent Colorimetric
