i
DETEKSI SERANGAN PENYAKIT
Citrus Vein Phloem
Degeneration
(CVPD), DENGAN METODE
Polymerase
Chain Reaction
(PCR) PADA TANAMAN JERUK
BESAR (
Citrus grandis
) DI DESA PEDAWA DAN DESA
MUNDUK KECAMATAN BANJAR,KABUPATEN
BULELENG
SKRIPSI
Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian pada Fakultas Pertanian Universitas Udayana
Oleh
MADE ARYA SUJANA PUTRA NIM. 1105105025
KONSENTRASI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS UDAYANA
ii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA SKRIPSI
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi ini tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka. Saya bersedia dikenakan sanksi sebagaimana diatur dalam aturan yang berlaku apabila terbukti bahwa skripsi ini bukan hasil karya saya sendiri atau mengandung tindakan plagiarism.
Demikian pernyataan ini dibuat dengan sebenarnya untuk dapat dipergunakan seperlunya.
Denpasar, 14 Maret 2016 Yang menyatakan,
iii
ABSTRACT
Made Arya Sujana Putra. NIM 1105105025. Detection of Ocurrence Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD) with Polymerase Chain Reaction (PCR) Technique from Big Orange Trees (Citrus grandis) in Pedawa Village and Munduk Village, Banjar District, Buleleng Regency. Supervised by Prof. Dr. Dra. Made Sritamin, MS. and : Prof. Dr. Ir. I Gede Putu Wirawan, M.Sc )
The aim of this study is to investigate whether Citrus grandis plants in Pedawa Village and Munduk Village have been infected by CVPD disease or not.
CPVD disease’s symptoms were detected visually by observing all Citrus grandis plants in Pedawa Village and Munduk village using total DNA isolation method, total DNA amplification method and visualization method. The result of the study showed that Citrus Grandis plants in Pedawa Village and Munduk Village were positively infected by CPVD disease according to DNA amplification method from their leave by using spesific primer fowards 16S rDNA. Moreover, Liberobacter asiaticum were found in samples express DNA 1160 bp in size.
iv
ABSTRAK
Made Arya Sujana Putra. NIM 1105105025. Deteksi Serangan Penyakit Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD), Dengan MetodePolymerase Chain Reaction (PCR) Pada Tanaman Jeruk Besar (Citrus Grandis) Di Desa Pedawa Dan Desa Munduk Kecamatan Banjar,Kabupaten Buleleng. Dibimbing oleh : Prof. Dr. Dra. Made Sritamin, MS. dan Prof. Dr. Ir. I Gede Putu Wirawan, M.Sc)
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui tanaman jeruk besar ( Citrus grandis ) di Desa Pedawa dan Desa Munduk terinfeksi oleh penyakit Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD). Pengamatan gejala serangan penyakit CVPD dilakukan secara visual dengan mengamati seluruh tanaman jeruk besar yang terdapat di Desa Pedawa dan Desa Munduk. Untuk mengetahui keberadaan bakteri CVPD yaitu dengan cara mengisolasi daun yang bergejala, dilanjutkan dengan mengamplifikasi dengan metode PCR menggunakan primer 16S rDNA dan hasil amplifikasi di visualisasi dengan UV-transmilator, maka ditemukannya pita DNA dengan berukuran 1160 bp
v
RINGKASAN
Penyakit Citrus Vein Phloem Degeneration ( (CVPD ) merupakan salah satu penyakit penting pada tanaman jeruk besar. Pada awalnya penyakit CVPD dilaporkan disebabkan oleh Virus (Tirtawijaya, 1983). Penyakit yang dikenal dengan nama "Citrus Greening" atau "Huanglongbing" (China) yang berasal dari China sejak tahun 1919 disebabkan oleh tristeza (Graca, 1991). Sedangkan pada daerah Afrika Selatan diketahui bahwa penyakit tristeza dan penyakit CVPD dapat dibedakan melalui vektornya yaitu vektor aphid Toxoptera citricidus yang menularkan triteza sedangkan vektor Diaphorina citri yang menularkan penyakit CVPD ( Graca., 1991).Sampai saat ini bakteri tersebut tidak bisa ditumbuhkan secara in vitro akan tetapi bakteri tersebut bisa dapat dideteksi dengan menggunakan PCR (Polyamerase Chain Recation) pada 16 S rDNA yang diamati dengan mikroskop elektron
vi
DETEKSI SERANGAN PENYAKIT Citrus Vein Phloem
Degeneration (CVPD), DENGAN METODE
Polymerase Chain
Reaction (PCR) PADA TANAMAN JERUK BESAR (Citrus grandis)
DI DESA PEDAWA DAN DESA MUNDUK KECAMATAN
BANJAR,KABUPATEN BULELENG
Made Arya Sujana Putra NIM. 1105105025
Menyetujui,
Pembimbing I Pembimbing II
Prof.Dr.Dra.Made Sritamin, MS. Prof.Dr.Ir. I Gede Putu Wirawan, M.Sc. NIP. 19521021 197903 2 002 NIP. 19580627 198503 1 005
Mengesahkan, Dekan Fakultas Pertanian
Universitas Udayana
Prof. Dr. Ir. I Nyoman Rai, MS. NIP. 19630515 198803 1 001
vii
DETEKSI SERANGAN PENYAKIT Citrus Vein Phloem
Degeneration (CVPD), DENGAN METODE
Polymerase Chain
Reaction (PCR) PADA TANAMAN JERUK BESAR (Citrus grandis)
DI DESA PEDAWA DAN DESA MUNDUK KECAMATAN
BANJAR,KABUPATEN BULELENG
dipersiapkan dan diajukan oleh
MADE ARYA SUJANA PUTRA
NIM. 1105105025
telah diuji dan dinilai oleh Tim Penguji pada tanggal 15 Maret 2016
Berdasarkan SK Dekan Fakultas Pertanian Universitas Udayana No : 1305/UN14.1.23/PP.05.02/2015
Tanggal 6 Juli 2015
Tim Penguji Skripsi adalah :
Ketua : Prof.Dr.Ir. I Nyoman Wijaya, M.S Anggota :
viii
RIWAYAT HIDUP
Penulis, Made Arya Sujana Putra lahir di Mataram pada tanggal 28 Mei 1993, sebagai anak kedua dari pasangan I Ketut Karuna (ayah) dan Mulyaning Rezeki (ibu). Pendidikan dasar dimulai di TK Adhiaksa Ampenan, Kecamatan Ampenan, Kabupaten Lombok Barat, Nusa Tenggara Barat, pada tahun 1998, kemudian dilanjutkan ke SD Negeri 13 Ampenan pada tahun 2000 sampai lulus tahun 2006.
ix
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa, atas Kasih dan Ke-Maha-Bijaksana-anNya, penulis dapat menyelesaikan skripsi yang
berjudul “Deteksi Serangan Penyakit Citrus Vein Phloem Degeneration (Cvpd), Dengan Metode Polymerase Chain Reaction (Pcr) Pada Tanaman Jeruk Besar (Citrus Grandis) Di Desa Pedawa, Kecamatan Banjar,Kabupaten Buleleng”. Penulisan skripsi ini didasarkan atas perlunya informasi tentang penyebaran penyakit CVPD pada semua tanaman jeruk yang ada diBali.
Dalam penyusunan dan penulisan skripsi ini tidak terlepas dari bantuan, bimbingan serta dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu dalam kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih kepada yang terhormat:
1. Kepada Dekan Fakultas Pertanian Universitas Udayana yang telah memberikan izin untuk menyusun skripsi ini.
2. Kepada Program Studi Agroekoteknologi yang telah memberikan semangat, sehingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik dan benar. 3. Prof.Dr.Dra. Made Sritamin, MS. selaku pembimbing I yang memberikan
bimbingan, nasehat serta waktunya selama penelitian dan penulisan skripsi ini.
4. Prof.Dr.Ir. I Gede Putu Wirawan, M.Sc. selaku pembimbing II yang memberikan bimbingan, nasehat serta waktunya selama penelitian dan penulisan skripsi ini.
5. Prof.Dr.Ir. I Nyoman Wijaya, M.S., Ir. Wayan Adiartayasa, M.Si dan Ir. I Gusti Ngurah Bagus, MP selaku tim penguji yang telah bersedia memberi masukan demi kesempurnaan skripsi ini.
6. Staf Dosen PS Agroekoteknologi yang telah membekali penulis dengan memberikan pengetahuan dan dukungannya selama mengikuti perkuliahan sampai akhir penulisan skripsi.
x
8. Rekan-rekan di laboratorium Sumber Daya Genetika dan Biologi Molekuler (Pak Agung, Pak Putu, Kak Manik, dan Kak Wisnu) yang telah memberikan dukungan, doa serta partisipasinya selama penulis menyelesaikan skripsi sehingga penulisan skripsi ini berjalan dengan lancar.
9. Terima Kasih kepada teman-teman Bioteknologi 2011 (Mey-Mey,Cece, Eka,Mini,Adit dan W-Can. Yang telah memberikan semangat untuk penulis untuk menyelesaikan skripsi dengan benar, penulis tidak akan pernah melupakan persahabat dan perjuangan yang kita lewati bersama. 10.Terima kasih kepada teman-teman KKN Bunutin yang telah memberikan
dukungan dan semangat kepada penulis, untuk menyelesaian penulisan skripsi.
11.Teman-teman mahasiswa Agroekoteknologi 2011 yang telah memberikan dorongan, semangat dan bantuan baik secara moril maupun materil demi lancarnya penyusunan skripsi ini.
Akhirnya, dengan penuh kesadaran bahwa penulisan skripsi ini masih banyak kekurangan dan masih jauh dari sempurna. Untuk itu, saran dan kritik yang bersifat membangun sangat diharapkan. Semoga hasil penelitian ini dapat memberikan manfaat bagi semua pihak yang memerlukan.
Denpasar, Maret 2016
xi
DAFTAR ISI
Halaman
SAMPUL DALAM ... i
PERNYATAAN KEASLIAN PENELITIAN ... ii
ABSTRACT ... iii
2.1 Taksonomi dan Morfologi Tanaman Jeruk Besar ... 5
2.2Klasifikasi Tanaman Jeruk Besar ( C. grandis)... 5
2.3 Morfologi Tanaman Jeruk Besar (C. grandis) ... 6
2.3.1 Daun ... 6
2.3.2 Batang dan Akar ... 6
2.3.3 Buah ... 7
2.3.4 Bunga... 7
2.4 Varietas Tanamana Jeruk Besar ( C.grandis ) ... 7
2.5 Penyakit CVPD (Citrus Vein Phloem Degeneration)... 8
2.6 Gejala Serangan Penyakit CVPD... 9
2.7 Kerusakan Yang Disebabkan oleh Penyakit CVPD... 11
2.7.1 Penyebab Penyakit CVPD... 12
2.8 Morfologi Bakteri CVPD... 15
2.8.1 Infeksi Penyakit CVPD... 16
2.8.2 Cara Pengendalian CVPD... 17
xii
III. METODE PENELITIAN ... 21
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ... 21
3.2 Alat Dan Bahan Penelitian ... 21
3.3 Pelaksanaan Penelitian ... 21
3.4 Metode Deteksi Penyakit CVPD ( C. grandis )... 22
3.4.1 Isolasi Total DNA ... 22
3.4.2 Amplifikasi DNA Total Dengan PCR ... 23
3.4.3 Visualisasi hasil PCR ... 23
3.5 Parameter penelitian ... 24
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 25
4.1 Gejala serangan CVPD tanaman Jeruk Besar (Citrus grandis).... 25
4.2 Hasil Isolasi Total DNA Tanaman Jeruk Besar... 28
4.3 Hasil Amplifikasi PCR Tanaman Jeruk Besar... 30
V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 34
5.1 Kesimpulan ... 34
5.2 Saran ... 34
DAFTAR PUSTAKA ... 35
xiii
DAFTAR GAMBAR
Nomor Teks Halaman
2.1 Tanaman jeruk yang menunjukkan penyakit CVPD... 10
2.2 Morfologi Bakteri ... 15
2.3 Struktur DNA ... 20
2.4 Proses amplifikasi DNA... 20
4.1 Daun tanamnan jeruk besar yang terinfeksi CVPD ... 27
4.2 Hasil Isolasi Total DNA... 29
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor Teks Halaman
1
I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Jeruk merupakan tanaman komoditi hortikultura yang dikenal oleh seluruh lapisan masyarakat. Jeruk memiliki tingkat rasa yang diminati oleh sebagian besar masyarakat, hal ini karena tanaman jeruk mengandung zat gizi yang cukup tinggi yang dapat menunjang kebutuhan gizi keluarga. Jeruk besar ( Citrus grandis ) mengandung vitamin C dan vitamin A, diketahui bahwa setiap 100 g jeruk mengandung vitamin C sebanyak 43 mg dan vitamin A sebanyak 20 mg. Jeruk besar mempunyai nilai ekonomis yang cukup tinggi sehingga mempunyai prospek yang sangat baik untuk dikembangkan (Ramda, 2005). Pada enam tahun terakhir (1998-2004), luas panen/hektar dan produksi buah jeruk di Indonesia mengalami peningkatan yang cukup pesat yaitu masing-masing 17,9% dan 22,4%. (Victoria, 2005).
Luas panen tanaman jeruk pada tahun 2004, mencapai 70.000 ha dengan total produksi sebesar 1.600.000 ton, sekaligus menempatkan posisi Indonesia sebagai negara penghasil utama tanaman jeruk dunia ke 13 setelah Vietnam. Produktivitas usahatani jeruk cukup tinggi, yaitu berkisar 17-25 ton/ha dari potensi 25-40 ton per ha. (Victoria, 2005).
2
makin hari terasa semakin penting bagi petani karena nilai ekonominya yang tinggi.Buah jeruk merupakan bahan pelengkap utama dalam menunjang gizi keluarga sehari-hari karena banyak mengandung vitamin C, vitamin A dan zat-zat mineral lainnya dalam jumlah yang cukup banyak (Sarwono, 1982).
Pertumbuhan dan perkembangan tanaman jeruk besar (C. grandis) masih terdapatnya hambatan seperti serangan hama dan penyakit,antara lain penyakit Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD). Penyakit ini tergolong salah satu
penyakit penting pada tanaman jeruk yang telah berkembang luas dan menjadi kendala utama usaha pengembangan yang dapat menyebabkan penurunan hasil/produksi/tanaman jeruk besar.Penyebaran penyakit CVPD yang sangat cepat terjadi di sektor penanaman jeruk besar (C.grandis) walaupun tidak pernah menjumpai serangga vektornya yang menyerang tanaman.Hal ini disebabkan karenabibit yang di gunakan telah mengandung patogen CVPD walaupun belum menunjukkan gejala serangan penyakit CVPD (Wirawan dkk,2004).
Penularan penyakit CVPD dilakukan oleh serangga vektor Diaphotina citri KUW. (Homoptera: Psyllidae) (Tirtawidjaja & Suharsojo 1990, Wirawan 2000). Penularan penyakit CVPD di alam bergantung pada kepadatan populasi D.citri sebagai serangga vektor dan keberadaan sumber inokulum (Chen, 1998).
3
belum ditemukan cara pengendalian penyakit CVPD yang tepat (Wirawan dkk, 2003)
Berdasarkan hasil pengamatan secara visual di lapang pada berbagai lokasi tanaman jeruk besar di Desa Pedawa dan Desa Munduk ditemukan adanya variasi gejala klorosis pada masing-masing jenis tanaman jeruk besar.Berdasarkan hasil pengamatan tersebut maka perlu dicari apa penyebab gejala tersebut , oleh sebab perlu melakukan suatu cara untuk mendeteksi gejala tersebut menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk mengetahui apakah tanaman tersebut terinfeksi oleh penyakit CVPD. Penyakit CVPD disebabkan oleh bakteri L.asiaticum yang ditularkan oleh serangga D. citri dimana serangga tersebut selain, merusak secara langsung dan tidak kalah pentingnya serangga tersebut juga sebagai vektor penyakit yang membawa bakteri tersebut sebagai patogen CVPD (Astuti,1988). Hama pucuk D.citri Kuw (Homoptera : Psyllidae) merupakan vector penyakit CVPD di Indonesia, Leaf Mottling di Philipina dan Greening di India (Kalshoven, 1981). Akibat adanya serangan penyakit CVPD hasil, hasil produksi jeruk besar tidak bisa dipergunakan untuk mencukupi kebutuhan dalam negeri. Penyakit CVPD telah mengakibatkan kemuduran produksi dan bahkan punahnya tanaman jeruk besar di Desa pedawa dan Desa Munduk yang merupakan lahan produksi jeruk besar (C. grandis). Penyakit ini merupakan salah satu penyabab rusaknya tanaman dan turunnya produksi jeruk besar baik kualitas maupun kuantitasnya ( Wigenasantana, 1994 ).
4
didaerah yang diamati di Desa Pedawa dan Desa Munduk Kecamatan Banjar.Penelitian ini bertujuannya untuk mengetahui atau mendeteksi tanaman jeruk besar terinfeksi CVPD yaitu dengan metode PCR, dengan bahan yang diamati dari gejala klorosis ringan sampai dengan gejala klorosis berat.
1.2. Rumusan Masalah
Berdasarkan uraian di atas maka permasalahan dari penelitian ini adalah: Apakah gejala serangan penyakit CVPD pada tanaman jeruk besar di Desa Pedawa dan Desa Munduk, yang disebabkan oleh L.asiaticum
1.3.Tujuan
Untuk mengetahui bahwa tanaman Jeruk besar (Citrus grandis) di Desa Pedawa dan Desa Munduk, terinfeksi oleh penyakit CVPD.
1.4. Hipotesis
5
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Taksonomi Dan Morfologi Tanaman Jeruk Besar
Tanaman jeruk besar merupakan jenis jeruk yang memiliki tinggi tanaman sampai lebih dari 5 meter dengan cabang-cabangnya banyak dan letak daun tersebar (folia sparsa). Daunnya merupakan daun tunggal, dengan tangkai daun bersayap sempit. Letak bunga terdapat pada ketiak daun, memiliki bau yang harum,jumlah bunga untuk setiap tandannya antara 5-15 buah, serta tajuk bunga 5 sampai 7 lembar berwarna putih. Jenis buah buni, berbentuk bulat, dengan diameter 10-20 cm, berkulit tipis, berwarna hijau yang akan menjadi kuning jika matang, rasanya manis sedikit asam dan kelat. Bentuk bijinya agak pipih, bulat telur sungsang ( Niyomdham, 1992 ).
2.2. Klasifikasi Jeruk Bali
Divisio : Spermatophyta Sub divisio : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida
Ordo : Sapindales
Familia : Rutaceae
Genus : Citrus
6
2.3. Morfologi Tanaman Jeruk Besar ( Citrus grandis)
2.3.1. Daun
Daun tanaman berbentuk bulat telur dan berukuran besar, dengan bagian puncak atau ujung tumpul dan bagian tepi hampir rata, serta bagian dekat ujung agak berombak. Letak daun terpencar dengan tangkai daun bersayap lebar, warna kekuningan, dan berbulu ( Ahsofyan, 2013 ).
2.3.2. Batang dan Akar
7
2.3.3. Buah
Buah berukuran besar dan berkulit tebal, Buahnya berbentuk bulat atau bola yang tampak tertekan.Warna daging buah merah muda atau merah jambu. Daging buah memiliki tekstur keras sampai lunak, rasa manis sampai sedikit asam, dan berbiji sedikit.( Ahsofyan, 2013 ).
2.3.4. Bunga
Bunga jeruk besar adalah bunga majemuk (inflorescentia), tersusun dalam malai yang keluar dari ketiak daun, bunga berbentuk bintang, diameter 1.5 – 2.5 cm, bunga berwarna putih, dan baunya harum.( Ahsofyan, 2013 ).
2.4. Varietas jeruk besar (Citrus. grandis)
Indonesia terdapat beberapa jenis / varietas tanaman jeruk besar atau varietas yang terdapat didaerah Indonesia yang banyak dikembang biakan dibeberapa daerah di Indonesia.
1. Jeruk Bali. Tanaman jeruk Bali mempunyai karakteristik sebagai berikut: daun dan bentuk buahnya berbulu banyak, buah berukuran sedang, dan tanaman tidak berbuah lebat. Bentuk buah bulat agak cekung dengan kulit tipis dan licin, daging buah jeruk bali berwarna merah muda, banyak mengandung air, dan berwarna merah.
2. Jeruk pandanwangi. Varietas ini mempunyai pohon yang kuat tidak mudah terserang penyakit. Bentuk buah bulat ,tetapi bagian pangkal dan ujungnya datar. Kulit buah tebal dan warna daging buahnya merah bertekstur kasar dan keras, kurang berair.
8
penyakit getah (diploida). Buah berbentuk bundar dan cekung sedikit runcing pada tangkainya. kulit jeruk delima putih lebih tipis dan lebih licin dari pada delima warna merah.
4. Jeruk pangkep. Jeruk ini disebut jeruk pangkep karena berasal dari (Sulawesi Selatan). Buah jeruk pangkep berbentuk bulat atau bundar dengan bobot buah rata-rata 2,8 kg diameter buah adalah 23cm-25 cm . Warna kulit buah berwarna kuning kurang menarik daging buah berwarna putih bertekstur halus, berair, berbiji sedikit.
2.5. Penyakit Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD)
Penyakit CVPD adalah salah satu dari penyakit penting yang menyerang berbagai tanaman jeruk didunia. Nama lain dari penyakit CVPD adalah "Citrus Greening" atau Yellow Shoot (Huanglongbing) dan nama interasionalnya sering
9
2.6. Gejala Serangan Penyakit CVPD
Gejala yang ditimbulkan oleh serang penyakit CVPD pada tanaman jeruk besar yang terinfeksi penyakit dapat digolongkan menjadi 2 yaitu ada gejala luar dan gejala dalam. Untuk mengetahui seerangan penyakit CVPD pada tanaman jeruk besar yang terinfeksi penyakit CVPD maka perlu dilakukan indentifikasi yang mengalami infeksi atau yang menunjukan gejala CVPD pada bagian - bagian tanaman jeruk.Pengamatan secara visual di temukan gejala yang ditimbulkan oleh penyakit CVPD adalah daun tanaman jeruk menguning pada sebagian atau seluruh daun tajuk yang ditandai dengan tulang-tulang daun yang berwarna lebih gelap sehingga kontras dengan daging daun yang berwarna kuning (Semangun, 1994).
10
A
B
Gambar 2.1.(A)Gejala penyakit CVPD,(B) kanopi tanaman jeruk yang terserang penyakit CVPD(Mudita dan Natonis., 2010)
Sering kali ditemukan ujung stylar tetap berwarna hijau atau keseluruhan buah tetap berwarna hijau pucat, oleh sebab itu dikatakannya penyakit greening (Gottwald dan Garnsey,1999). Pada sistem perakaran tanaman yang terinfeksi, ekosistemnya akan rusak, akar-akar serabut relatif lebih sedikit karena mungkin terjadi "kelaparan"(Aubert,1979 dalam da Graca,1991). Pertumbuhan akar baru sering mengalami pembusukan karena tertekan ,dimulai dari akar-akar yang kecil(rootlets) (Zhao,1981 dalam da Graca, 1991).
11
corking.yang telah diamati terbentuknya membran-membran sitoplasma dan
invaginasi plasma-lemma, penyimpang tilakoid, kloroplas dan rusaknya mitokondria (Graca, 1991).
2.7. Kerusakan Yang Disebabkan oleh Penyakit CVPD
Serangan yang di timbulkan oleh penyakit CVPD pada tanaman dapat dilihat apabila tanaman sudah terinfeksi atau menguning dan daun tanaman sudah mulai berguguran satu demi satu sebelum waktunya serta pola pertumbuhan tanaman tidak teratur karena pada cabang-cabang yang terinfeksi akan muncul tunas dan bunga-bunga diluar musimnya (Sritamin, 2007). Pada tanaman yang terserang penyakit CVPD akan mengalami kerusakan anatomi pada jaringan floem yang bisa menyebabkan fungsi fisiologi tanaman dapat terganggu dan akhirnya tanamanmengalami kematian (Hewindati., 1998). Kerusakan yang diakibatkan oleh penyakit CVPD pada tanaman jeruk di India menyebabkan terjadinya penurunan produksi . Pada daerah Saudi Arabia, jeruk manis dan eruk mandarin mengalami kepunahan, sedangkan pada daerah Filipina mengalami kerugian yang lebih tinggi sebesar 65%, dan pada diThailand mengalami kerugian lebih dari 95% dan serangan terbesar terjadi pada daerah Afrika Selatan sebesar 30-100% (Graca, 1991). Di Indonesia penyakit CVPD mulai menyerang tanaman jeruk pada tahun 1940 (Semangun,1994) menyebutkan bahwa serangan yang ditimbulkan oleh penyakit CVPD pada tanaman jeruk keprok yang dulu bisa mencapai puluhan tahun untuk menghasilkan tetapi sekarang hanya bisa memberikan hasil 2-3 kali selama pertumbuhannya.
12
(Supryanto., 2004). Penyakit CVPD juga dapat mengakibatkan berkurangnya keragaman jeruk,seperti yang dinyatakan oleh ( Wirawan dkk., 1998 ) tanaman jeruk keprok tejakula di Bali Utara merupakan tanaman jeruk yang rasa buahnya manis dan aroma buahnya khas diantara jeruk yang lain serta warna orange yang bersih sehingga pernah menjadi keunggulan komuditas holtikurtura diBali Utara akan tetapi penyakit CVPD menyerang semua jenis tanaman jeruk di Bali maka, tanaman jeruk asli Tejakula menjadi lebih langka lagi dan susah untuk dicari (Sritamin., 2007). Sampai saat ini penyakit CVPD telah memusnahkan jutaan pohon jeruk yang ada di seluruh Indonesia. Semua jenis jeruk yang terdapat di Indonesia sebagian besar sudah terinfeksi serangan penyakit CVPD, tanaman yang kemungkinan tidak terkena serangan penyakit CVPD adalah tanaman jeruk kinkit (Triphasia trifolia) yang tidak bernilai ekonomis (Tjiptono., 1987).
2.7.1 Penyebab Penyakit CVPD
13
(BLO) (Garnier et al., 1976). Selanjutnya diketahui pula bahwa antibiotik Penicilin dapat menghambat timbulnya gejala HLB pada jeruk (Bove et al., 1980; Aubert & Bove, 1980)sehingga lebih memperkuat dugaan bahwa patogen HLB adalah bakteri. Garnier et al. (1984)membuktikan bahwa penyebab HLB adalah bakteri gram negatif dengan melakukan pengujian keberadaan dan hilangnya lapisan peptidoglikan (PG) sebagai lapisan di antara lapisan dinding dan membran sel dengan perlakuan papain untuk memperjelas keberadaan PG dan perlakuan lisozyme untuk mendegradasi PG.
Selanjutnya Jagoueix et al. (1994) mempublikasikan bahwa bakteri tersebut termasuk anggota dari subdivisi á-Proteobacteria, dan namanya diusulkan sebagai Candidatus Liberobacter asiaticum untuk strain Asia dan ‘Candidatus
Liberobacter africanum’ untuk strain Afrika (Jagoueix et al., 1997). Berdasarkan
peraturan Kode Internasional Tata Nama Bakteri yang baru, maka ‘Candidatus
Liberobacter asiaticum’ diubah namanya menjadi ‘Candidatus Liberibacter
asiaticus’ (LAS). Demikian juga untuk ‘Candidatus Liberobacter africanum’
diubah namanya menjadi ‘Candidatus Liberibacter africanus’ (LAF) (Garnier et
al., 2000). Pada awal tahun 2009, LAS dilaporkan sudah dapat dikulturkan pada
14
1989).Deteksi menggunakan metode ELISA dan imunofluoresen memakai antibodi monoklonal dikembangkan oleh Garnier et al. (1987) dan Hsu et al. (1991). Deteksi yang dikembangkan selanjutnya adalah hibridisasi DNA menggunakan probe DNA spesifik organisme penyebab HLB (Villechanoux et al., 1992; Villechanoux et al., 1993). Metode deteksi secara molekuler
menggunakan PCR untuk HLB dilakukan oleh Jagoueix et al. (1994); Planet et al. (1995); Jagoueix et al. (1997); Subandiyah et al. (2000); Hoy et al. (2001); Hung et al. (2004). Alat deteksi yang masih berdasarkan penggandaan fragment DNA
seperti PCR namun disederhanakan hanya menggunakan water bath dengan satu siklus suhu tunggal saja dan teknik tersebut dikenal dengan LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) dilaporkan mampu mendeteksi LAS (Okuda et al., 2005). Kemajuan deteksi selanjutnya, yaitu menggunakan quantitative
real-time PCR (Li et al., 2007)dalam buku ( Himawan A, Sumardiyono Y.B .,2010). Sedangkan pada daerah Afrika Selatan diketahui bahwa penyakit tristeza dan penyakit CVPD dapat dibedakan melalui vektornya yaitu vektor aphid Toxoptera citricidus yang menularkan triteza sedangkan vektor Diaphorina citri yang menularkan penyakit CVPD ( Graca., 1991).Sampai saat ini bakteri tersebut tidak bisa ditumbulkan secara in vitro akan tetapi bakteri tersebut bisa dapat dideteksi dengan menggunakan PCR (Polyamerase Chain Recation) pada 16 S rDNA yang diamati dengan mikroskop elektron.
Bedasarkan pengaruh suhu, terdapat dua macam spesies bakteri Liberobacter yaitu spesies Afrika dan spesies Asia, masing-masing spesies
15
tolerans) (Sritamin, 2007).Pada suhu berkisar 27-300C spesies dari daerah Afrika tidak menimbulkan gejala yang tidak berat dan tidak aktif pada suhu yang lebih tinggi dari 300C dalam waktu yang lebih lama (Graca, 1991).
2.8. Morfologi Bakteri CVPD
Informasi yang diketahui tentang morfologi, fisiologi, biokimia dan genetik baketri CVPD sangat terbatas karena belum bisa untuk dikultur secara in vitro (Nakashima et al., 1996). Pengamatan yang dilakukan dengan cara mikroskop elektron terhadap irisan ultratipis secara serial dan konfigurasi tiga dimensi menunjukan bahwa bakteri penyakit CVPD bersifat pleomorfik, pada saat tumbuh berbentuk memanjang yang secara fleksibel 100-250 x 500-2500 µm dan untuk saat dewasa berbentuk batang kaku yang berukuran 350-550 x 600-1500 µm yang dikelilingi oleh dua lapisan yaitu dengan tebal µm (Wirawan dkk., 2004). Selubung bakteri memiliki tiga lapisan yang berbeda dengan masing-masing lapisan memiliki ketebalan lebih kurang dari 25 µm.(Wirawan, dkk., 2004).
16
2.8.1 Infeksi Penyakit CVPD
Penularan penyakit CVPD melalui teknik penempelan mata tunas (grafting),kecepatan untuk variasi perkembanganya disebabkan oleh distribusi bakteri yang tidak beraturan pada tanaman (Sdoodee et al ., 1999). Bakteri Liberobacter hanya terdapat pada jaringan floem tanaman yang terinfeksi oleh penyakit CVPD (Zubaidah., 2004). Liberobacter hanya dapat di ketahui pada tanaman yang memiliki gejala serangan penyakit CVPD yang dibawa oleh vektor D.citri yang berasosiasi dengan tanaman yang terinfeksi penyakit CVPD (Wirawan, 1997; Sulistyowati,2003). Penyakit CVPD bisa ditularkan oleh serangga D.citri yang menghisap tanaman yang terinfeksi penyakit CVPD lewat bibit yang telah terinfeksi CVPD. Pada bagian mulut vektor (stilet) terdapat bakteri CVPD, ketika vektor yang telah membawa bakteri atau virus CVPD menghinggap ke tanaman yang belum menimbulkan gejala penyakit CVPD ,dan serangga vektor yang telah membawa bakteri CVPD akan menghisap cairan sel-sel dari daun tanaman sehingga tanaman akan terinfeksi oleh bakteri CVPD melalui stiletnya vektornya (Wirawan dkk., 2000 dan Wijaya., 2003).
17
2.8.2. Cara Pengendalian CVPD
Penyakit CVPD adalah penyakit yang paling berbahaya untuk tanaman jeruk, umunya penyakit CVPD menyerang jeruk siam ,jeruk keprok dan yang lainnya ,tetapi untuk tanaman jeruk kinkit dan jeruk nipis tidak bisa terkena karena memiliki Gen yang menolak penyakit CVPD. Apabila ada tanaman jeruk yang terkena penyakit CVPD maka perlu dilakukan pengendalian penyakit CVPD, secara umumpengendalian dilakukan untuk mengurangi vektornya. Menurut Mahfud, 1987menyatakan cara pengendalian penyakit CVPD yaitu dengankarantina ,eradikasi tanaman, pengendalian serangga vektor D. citri dan pemberian tetramycin 26 SP. Selanjutnya menurut (Wigenasantana, 1994) menyatakan cara pengendalian penyakit CVPD adalah sebagai berikut:
1. Penanaman bibit bebas penyakit CVPD pada areal yang ingin ditanamani harus bersih dari penyakit CVPD.
2. Saat melakukan penempelan/grafting harus menggunakan mata tempel yang bebas dari penyakit CVPD.
3. Pengendalian VektorD.citri agar tidak menyebarkan penyakit CVPD lebih luas lagi.
18
2.9. Teknik Polymerase Chain Reaction ( PCR
)
PCR merupakan teknik yang relatif mudah, cepat, efisien, dan lebih senstif daripada dekteksi dengan DNA probe untuk deteksi CVPD ( Hocquellet et al., 1996 ; u dan Hung , 2001 ). Teknik PCR ini mempergunakan sepasang primer
spesifik dari sekuens DNA bakteri CVPD yang telah dikloning (Hung et al., 2000) .PCR adalah suatu metode in vitro untuk menghasilkan sejumlah besar frgamen DNA spesifik dengan panjang dan sekuens yang telah ditentukan dari sejumlah kecil template kompleks. Teknik PCR sebenarnya mengeksploitasi berbagai sifat alami replikasi DNA. (Wirawan, dkk. 2004).
Proses amplifikasi DNA total tersebut dapat dilihat pada Gambar 2.3, polymerase DNA menggunakan DNA utas tunggal sebagai cetakan untuk mensintesis utas baru yang komplementer. Cetakan utas tunggal dapat diperoleh dengan mudah melalui pemanasan dari DNA cetakan utas ganda pada temperatur mendekati titik didih ( 92-95 oC). Polimarase DNA juga memerlukan suatu wilayah berserat ganda pendek untuk memulai proses sintesis. Pada PCR, posisi awal sintesi DNA dapat ditentukan dengan menyediakan suatu oligonukleotida sebagai primer yang menempel secara komplementer pada cetakan sesuai dengan yang diinginkan. ( Wirawan, dkk. 2004),dengan demikian, tempat ikatan primer baru akan dibuat pada utas DNA yang baru disintesis. Campuran reaksi kemudian dipanaskan lagi untuk untuk memisahkan utas awal dengan yang baru, yang kemudian berperan sebegai cetakan untuk siklus selanjutnya meliputi penempelan primer, sintesis DNA dan pemisahan utas. (Wirawan, dkk. 2004).
19
20
( A)
( B )
Gambar 2.3. Struktur DNA (Prentis Steve, 1990) dalam buku Kusuma. (2010 ) Keterangan: a. Struktur primer DNA
b. Struktur sekunder DNA
