i
DETEKSI KEBERADAAN PENYAKIT CVPD
(Citrus Vein Phloem Degeneration) DENGAN TEKNIK PCR
(Polymerase Chain Reaction) DI DUSUN UNTALAN
DESA JUNGUTAN KECAMATAN BEBANDEM
KABUPATEN KARANGASEM
SKRIPSI
Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian pada Fakultas Pertanian Universitas Udayana
Oleh
I Kadek Purnawirawan Putra NIM. 1205105010
KONSENTRASI PERLINDUNGAN TANAMAN PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS UDAYANA
ii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA SKRIPSI
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi ini tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka. Saya bersedia dikenakan sanksi sebagaimana diatur dalam aturan yang berlaku apabila terbukti bahwa skripsi ini bukan hasil karya saya sendiri atau mengandung tindakan plagiarism.
Demikian pernyataan ini dibuat dengan sebenarnya untuk dapat dipergunakan seperlunya.
Denpasar, 06 Juni 2016 Yang menyatakan,
iii ABSTRAK
I Kadek Purnawirawan Putra. NIM 1205105028. Deteksi Keberadaan Penyakit CVPD (Citrus Vein Phloem Degeneration) dengan Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) di Dusun Untalan Desa Jungutan Kecamatan Bebandem Kabupaten Karangasem. Dibimbing oleh: Ir. Wayan Adiartayasa, M.Si., dan Ir. I Made Mega Adnyana, M.P.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui persentase tanaman yang menunjukkan gejala penyakit CVPD dan mendeteksi patogen penyebab penyakit CVPD secara molekuler dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) dengan primer 16S rDNA. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Sumber Daya Genetika dan Biologi Molekuler, Universitas Udayana. Hasil pengamatan secara visual didapatkan persentase tanaman yang menunjukkan gejala penyakit CVPD di empat lokasi yaitu 25%, 37%, 27%, dan 19% dengan rata-rata sebesar 27%. Hasil persentase pucuk tanaman per pohon yang menunjukkan gejala penyakit CVPD di empat lokasi yaitu berturut-turut 7.9%, 15.73%, 8.9%, dan 7.07%. Hasil isolasi total DNA sampel daun jeruk pada elektroforesis gel agarose 1% didapatkan adanya pita total DNA yang menandakan bahwa DNA sudah terisolasi dengan baik. Hasil visualisasi DNA teramplifikasi pada gel agarose 1% menunjukkan adanya pita DNA 1160 bp pada lokasi 2, 3 dan 4. Oleh karena bakteri Liberobacter asiaticum memiliki pita DNA 1160 bp, maka sampel bereaksi positif terhadap bakteri L. asiaticum. Oleh karena sampel tersebut positif terhadap bakteri Liberobacter asiaticum maka dapat dipastikan bahwa, tanaman jeruk di Dusun Untalan terserang penyakit CVPD.
iv ABSTRACT
I Kadek Purnawirawan Putra. NIM 1205105010. Detection of CVPD (Citrus Vein Phloem Degeneration) Disease Using PCR Technique of Citrus from Untalan Sub Village, Jungutan Village, Bebandem District, Karangasem Regency. Supervised by: Ir. Wayan Adiartayasa, M.Si., and Ir. I Made Mega Adnyana, M.P.
This research aims to know about presentation of CVPD disease on citrus plants and detect CVPD disease using PCR technique with specific primer called 16S rDNA. This research was conducted at Laboratory of Genetics Resource and Biology Moleculer, Udayana University. Result for visual monitoring of presentation in CVPD symptom in four locations is 25%, 37%, 27%, 19%, and the average is 27%. The result for average the presentation of CVPD symptom in the shoot of citrus in each locations is 7.9%, 15.73%, 8.9%, and 7.07%. The isolation of leaves citrus DNA were appeared on 1% agarose in electrophoresis showed DNA band. The result of DNA amplified that were appeared on 1% agarose in electrophoresis showed DNA bands 1160 bp. 3 samples from 4 with specific symptom of CVPD gave positive PCR reaction. DNA Bands 1160 bp is expression by Liberobacter asiaticum, than the sample from Untalan Sub Village were detected positive for the Liberobacter asiaticum and the samples were infected by CVPD disease.
v RINGKASAN
Penyakit CVPD (Citrus Vein Phloem Degeneration) disebabkan oleh Bakteri gram negatif Liberobacter asiaticum (Sandrine, et al., 1996). Penularan penyakit CVPD dilakukan oleh serangga vektor Diaphorina citri Kuw. (Homoptera: Psyllidae) (Tirtawidjaja & Suharsojo, 1990; Wirawan, 2000). Wirawan et al (2003) mengatakan bahwa, penyebaran penyakit CVPD di perkebunan jeruk di Bali mencapai 83% karena menggunakan bibit dengan mata tempel atau dengan batang bawah yang telah terinfeksi penyakit CVPD.
Dusun Untalan merupakan salah satu Dusun yang terletak di Desa Jungutan, Kecamatan Bebandem, Kabupaten Karangasem. Tahun 2013, produksi jeruk di Desa Jungutan adalah 78 ton, 80% diantaranya disumbangkan oleh Dusun Untalan yaitu sebesar 60 ton (BPS Kab. Karangasem, 2014). Berdasarkan hasil pengamatan pendahuluan secara visual pada pertanaman jeruk di Dusun Untalan, didapatkan gejala klorosis pada lamina daun dan tulang daun berwarna hijau tua, gejala tersebut diduga gejala penyakit CVPD. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui persentase tanaman yang menunjukkan gejala penyakit CVPD dan mendeteksi patogen penyebab penyakit CVPD secara molekuler dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) dengan primer 16S rDNA.
Penelitian di lapangan dilaksanakan dengan menghitung persentase tanaman per pohon dan persentase pucuk tanaman per pohon yang menunjukkan gejala penyakit CVPD.
Berdasarkan hasil pengamatan secara visual didapatkan persentase tanaman yang menunjukkan gejala penyakit CVPD di empat lokasi yaitu 25%, 37%, 27%, dan 19% dengan rata-rata sebesar 27%. Hasil persentase pucuk tanaman per pohon yang menunjukkan gejala penyakit CVPD di empat lokasi yaitu berturut-turut 7.9%, 15.73%, 8.9%, dan 7.07%.
vi
vii
DETEKSI KEBERADAAN PENYAKIT CVPD
(Citrus Vein Phloem Degeneration) DENGAN TEKNIK PCR
(Polymerase Chain Reaction) DI DUSUN UNTALAN
DESA JUNGUTAN KECAMATAN BEBANDEM
KABUPATEN KARANGASEM
I KADEK PURNAWIRAWAN PUTRA NIM. 1205105010
Menyetujui,
Pembimbing I Pembimbing II
Ir. Wayan Adiartayasa, M.Si. Ir. I Made Mega Adnyana, M.P. NIP 19560703 198601 1 001 NIP. 19590922 198803 1 001
Mengesahkan, Dekan Fakultas Pertanian
Universitas Udayana
Prof. Dr. Ir. I Nyoman Rai, M.S. NIP. 19630515 1988 1 001
viii
DETEKSI KEBERADAAN PENYAKIT CVPD
(Citrus Vein Phloem Degeneration) DENGAN TEKNIK PCR
(Polymerase Chain Reaction) DI DUSUN UNTALAN
DESA JUNGUTAN KECAMATAN BEBANDEM
KABUPATEN KARANGASEM
dipersiapkan dan diajukan oleh I Kadek Purnawirawan Putra
NIM. 1205105010
telah diuji dan dinilai oleh Tim Penguji pada tanggal 06 Juni 2016
Berdasarkan SK Dekan Fakultas Pertanian Universitas Udayana No : 106/UN14.1.23/DL/2016
Tanggal : 07 Juni 2016 Tim Penguji Skripsi adalah:
Ketua : Prof. Dr. Ir. I Gede Putu Wirawan, M.Sc. Anggota : 1. Ir. Ni Wayan Suniti, M.S.
ix
RIWAYAT HIDUP
I Kadek Purnawirawan Putra lahir di Desa Macang, Kecamatan Bebandem, Kabupaten Karangasem Bali pada tanggal 19 September 1994.
Penulis merupakan anak keenam dari enam bersaudara dari pasangan I Made Merta dan Ni Nyoman Sukreni. Penulis memulai pendidikan di TK Bintang Kejora pada tahun 1999-2000, selanjutnya penulis menempuh pendidikan dasar di SDN 7 Subagan, Kecamatan Karangasem Kabupaten Karangasem pada tahun 2000-2006, pendidikan menengah pertama di SMP Negeri 2 Amlapura pada tahun 2006-2009, pendidikan menengah atas di SMA Negeri 1 Amlapura pada tahun 2009-2012. Penulis melanjutkan pendidikan di program studi Agroekoteknologi, Konsentrasi Perlindungan Tanaman, Fakultas Pertanian, Universitas Udayana pada tahun 2012 melalui jalur SNMPTN Undangan.
x
KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas segala rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi penelitian yang berjudul “Deteksi Keberadaan Penyakit CVPD (Citrus Vein Phloem Degeneration) dengan Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) di Dusun Untalan Desa Jungutan Kecamatan Bebandem Kabupaten Karangasem”.
Pada kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih kepada:
1. Presiden Republik Indonesia melalui Menteri Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi yang telah memberikan Beasiswa Bidikmisi kepada penulis.
2. Dekan Fakultas Pertanian Universitas Udayana yang telah memberikan berbagai fasilitas kepada penulis selama menjadi mahasiswa
3. Ketua Jurusan/ Program Studi Agroekoteknologi yang telah memberikan izin, fasilitas, bimbingan kepada penulis untuk melaksanakan penelitian ini.
4. Ketua, Sekretaris, beserta Staf UPT Laboratorium Sumber Daya Genetika dan Biologi Molekuler Universitas Udayana yang telah memfasilitasi penulis dalam melaksanakan penelitian ini.
5. Ir. Wayan Adiartayasa, M.Si. selaku dosen Pembimbing I yang telah mendampingi, membimbing, semangat serta memberikan masukan dan saran kepada penulis sepanjang penulisan skripsi penelitian ini.
6. Ir. I Made Mega Adnyana, M.P. selaku pembimbing II atas nasehat dan kesabaran dalam membimbing serta meluangkan waktu untuk memberikan masukan-masukan serta motivasi sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi penelitian ini.
xi
8. Ir. I Nyoman Sutedja, M.S. selaku pembimbing akademis yang banyak memberikan dukungan, saran dan pendapat selama penulis menjadi mahasiswa.
9. Orang Tua saya tercinta Bapak I Made Merta dan Ibu Ni Nyoman Sukreni terima kasih atas dorongan moral, bantuan material, kasih sayang, dan doa yang tak henti-hentinya, yang diberikan sehingga studi penulis dapat terselesaikan dengan baik.
10. Kakak saya Ni Luh Suparwati, Ni Made Midiani, Ni Nyoman Noviasih, Ni Ketut Erawati, dan Ni Wayan Sulistyawati, terima kasih banyak atas dukungan dan doanya yang tak henti-hentinya.
11. Sahabat se-perjuangan dalam penelitian CVPD, Vani Silvana, S.P., Ika Nurhayati, S.P., Octa Fransiska Sitorus, S.P., sahabat dekat Djordi, Alit, Nonik, Ayu Wida, Gek Mirah, Octa Ubud, Risma, Eka .H., Irna, Ana, Ani, Dharma, Maya, Domi, Beni, dan Ibu Diah Yuniti yang telah banyak membantu dan memberikan dukungan, motivasi dan masukan dalam menyelesaikan skripsi penelitian ini.
12. Teman teman Konsentrasi Perlindungan Tanaman, Agroekoteknologi 2012, dan teman KKN XI Desa Sibetan, yang selalu memberikan semangat, motivasi kepada penulis sehingga skripsi penelitian ini dapat selesai.
13. Juga semua pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu.
Penulis menyadari bahwa skripsi penelitian ini masih jauh dari sempurna, sehingga penulis sangat mengharapkan saran dan petunjuk yang mengarah pada penyempurnaan skripsi penelitian ini. Selanjutnya besar harapan penulis semoga skripsi ini ada manfaatnya khususnya bagi pembaca yang memerlukan informasi terkait penyakit CVPD
Denpasar, 06 Juni 2016
xii
DAFTAR ISI
Halaman
SAMPUL DALAM... i
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA SKRIPSI ... ii
ABSTRAK ... iii
ABSTRACT ... iv
RINGKASAN... v
HALAMAN PERSETUJUAN ... vii
TIM PENGUJI ... viii
1.3 Vektor Diaphorina citri Kuwayama ... 10
1.4 Deteksi Penyakit CVPD dengan PCR ... 12
3.3.2 Deteksi secara Molekuler Penyebab Penyakit CVPD pada Tanaman Jeruk ... 17
3.4 Variabel Penelitian ... 19
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 20
xiii
4.2 Gejala Penyakit CVPD pada Tanaman Jeruk ... 23
4.3 Persentase Tanaman Jeruk yang Menunjukkan Gejala CVPD ... 25
4.4 Persentase Pucuk Tanaman Jeruk yang Menunjukkan Gejala CVPD Per Tanaman ... 25
4.5 Deteksi secara Molekuler Penyebab Penyakit CVPD pada Tanaman Jeruk ... 26
V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 29
5.1 Kesimpulan ... 29
5.2 Saran ... 29
DAFTAR PUSTAKA ... 30
xiv
DAFTAR TABEL
Nomor Teks Halaman
4.1 Rataan Persentase Tanaman Jeruk Terserang CVPD
di Dusun Untalan ... 25 4.2 Persentase pucuk tanaman yang menunjukkan gejala
xv
DAFTAR GAMBAR
Nomor Teks Halaman
2.1 Gejala Klorosis pada Daun dan Tanaman Jeruk ... 6
2.2 Bakteri Liberobacter asiaticum ... 9
4.1 Peta Lokasi Kecamatan Bebandem ... 20
4.2 Hasil Pengamatan Lokasi Pertanaman Jeruk ... 22
4.3 Gejala Klorosis pada Tanaman Jeruk di Dusun Untalan ... 24
4.4 Hasil Elektroforesis Isolasi Total DNA ... 27
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1. Jumlah Pucuk Terserang per Tanaman dan Jumlah Pucuk
1
I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Penyakit Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD) disebabkan oleh
Bakteri gram negatif Liberobacter asiaticum (Sandrine, et al., 1996). Penularan
penyakit CVPD dilakukan oleh serangga vektor Diaphorina citri Kuw.
(Homoptera: Psyllidae) (Tirtawidjaja & Suharsojo, 1990; Wirawan, 2000). Selain
melalui vektor D. citri, penyakit CVPD dapat menyebar melalui bibit terinfeksi.
Bibit jeruk yang tampak sehat dapat mengandung patogen CVPD, karena masa
inkubasi patogen CVPD dalam tanaman inang berkisar tiga sampai lima bulan
(Tirtawidjaja & Suharsodjo, 1990), sehingga diperlukan cara yang tepat dan cepat
untuk mendeteksi keberadaan patogen CVPD pada bibit jeruk. Penyakit ini
diketahui berasal dari China sejak tahun 1919 (Jaqoueix et al. 1994; 1996).
Penyakit CVPD saat ini secara internasional namanya telah dibakukan menjadi
huang lung bin (HLB) (Jaqoueix et al. 1994; 1996).
Penyebaran penyakit CVPD pada pertanaman jeruk di Bali mencapai 83%
karena menggunakan bibit dengan mata tempel atau dengan batang bawah yang
telah terinfeksi penyakit CVPD. Upaya penanggulangan penyakit CVPD telah
banyak dilakukan, walaupun demikian penyakit CVPD masih ditemukan di
berbagai sentra pertanaman jeruk dan sampai saat ini belum ditemukan cara
pengendalian yang tepat (Wirawan et al., 2003).
Produksi jeruk di Kabupaten Karangasem dalam lima tahun terakhir
(2006-2010) adalah berturut-turut 756, 279, 13, 209, 207 ton dari luas panen
berturut-turut 80.026, 26.655, 850, 14.295, 10.466 pohon. BPS Kabupaten
2
Karangasem, Abang, Bebandem, dan Selat memproduksi buah jeruk dengan
produksi berturut-turut adalah 95 ton, 44 ton, 25 ton, 2 ton, 78 ton, dan 1 ton.
Desa jungutan merupakan salah satu Desa yang berada di Kecamatan Bebandem
yang memproduksi buah jeruk. Desa Jungutan mempunyai lahan perkebunan
seluas 623 Ha. Jenis tanaman yang ditanaman adalah tanaman jeruk, salak, durian,
pepaya, pisang, rambutan. Luas panen pertanaman jeruk di Desa Jungutan dari
tahun 2009 sampai tahun 2013 terus meningkat yaitu berturut turut 2906, 4460,
4590, 4039, dan 5759 pohon. Dusun Untalan merupakan salah satu penghasil
jeruk di Desa Jungutan. Dusun Untalan merupakan salah satu Dusun yang terletak
di Desa Jungutan, Kecamatan Bebandem Kabupaten Karangasem. Berada pada
ketinggian 700 m dpl (BPS Kab. Karangasem, 2014). Pada tahun 2013, produksi
jeruk di Desa Jungutan adalah 78 ton, 80% diantaranya disumbangkan oleh Dusun
Untalan yaitu sebesar 60 ton. (BPS Kab. Karangasem, 2014).
Berdasarkan hasil pengamatan secara visual di Dusun Untalan, terdapat
gejala yang mirip dengan gejala penyakit CVPD yaitu klorosis pada bagian daun
namun tulang daun masih tetap berwarna hijau. Untuk memastikan tanaman
tersebut terserang penyakit CVPD, maka perlu dilakukan deteksi secara molekuler
dengan menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction).
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan di atas, maka dapat
dirumuskan suatu masalah yaitu :
1.2.1 Apakah penyakit CVPD telah menyerang tanaman jeruk di Dusun
3
1.2.2 Berapa Persentase serangan CVPD pada tanaman Jeruk di Dusun
Untalan ?
1.3 Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk :
1.3.1 Mengetahui keberadaan penyakit CVPD pada pertanaman jeruk di
Dusun Untalan
1.3.2 Mengetahui persentase serangan penyakit CVPD pada pertanaman
jeruk di Dusun Untalan
1.4 Manfaat
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada para
pemegang kebijakan dan petani pada khususnya mengenai keberadaan Penyakit
CVPD pada pertanaman jeruk di Dusun Untalan.
1.5 Hipotesis
Gejala klorosis pada daun tanaman jeruk di Dusun Untalan disebabkan
4
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Tanaman Jeruk
Jeruk merupakan famili Rutaceae, jenis ini hampir selalu berupa semak atau pohon, dengan daun tunggal atau majemuk yang duduknya tersebar atau berhadapan, tanpa daun penumpu. Dalam daun dan kulit batang terdapat kelenjar minyak yang terjadi secara skizolisigen (Tjitrosoepomo, 2002).
Tinggi tanaman jeruk berkisar antara 2-8 m dengan tajuk yang tidak beraturan, banyak bercabang, rindang, berdahan pendek, permukaan atas daun berwarna hijau mengkilat dan bagian bawahnya hijau muda. Tangkai daun bersayap sangat sempit sampai boleh dikatakan tidak bersayap, panjang 0,5-1,5 cm. Helaian daun tanaman jeruk berbentuk bulat telur memanjang, elliptis, atau berbentuk lanset, dengan ujung tumpul, melekuk ke dalam. Tepi bergerigi beringgit sangat lemah, panjang 3,5-8 cm (Tjitrosoepomo, 2002). Bunga tanaman jeruk berdiameter 1,5-2,5 cm. daun mahkota berwarna putih. Buah berbentuk bola. Sedangkan buah jeruk keprok memiliki panjang 4-7 cm, diameter 5-8 cm, tebal kulit 0,2-0,3 cm. Kebanyakan daging buah tanaman jeruk berwarna orange, yang diluputi jaringan seperti reticulatum (Tjitrosoepomo, 2002)
Menurut Tjitrosoepomo (2002) sistematika tanaman jeruk diklasifikasikan sebagai berikut :
Kingdom : Plantae
Divisio : Spermatophyta (tumbuhan berbiji)
Sub divisio : Angiospermae (berbiji tertutup)
5
Ordo : Rutales
Famili : Rutaceae
Genus : Citrus
Spesies : Citrus maxima (Burn.) Merr. atau C. grandis L, atau C. decumana L.
: C. sinensis (L) Osbeck. atau C. aurantium L. var. sinensis L : C. hystrix
: C. nobilis Lous : C. aurantifolia : C. medica
Varietas : C. nobilis microcarpa Holsk. : C. nobilis chysocarpa
2.2 Penyakit CVPD pada tanaman jeruk 2.2.1 Gejala serangan penyakit CVPD
6
Gambar 2.1.
Gejala Klorosis pada Daun dan Tanaman Jeruk (Litbang Kalbar, 2007)
Pada tanaman muda gejala yang nampak yaitu adanya kuncup yang berkembang lambat, pertumbuhan mencuat ke atas seperti sikat, lebih kecil dan berbecak. Pada tanaman dewasa, gejalanya bervariasi. Pada gejala sektoral, diawali dengan blotching pada cabang-cabang tertentu, diiringi pertumbuhan tunas air lebih banyak dari tanaman normal di luar musim pertunasan (Dwiastuti, 2001). Pada gejala berat, daun menjadi lebih kaku, kecil, menebal, tulang daun primer dan sekunder mengeras (vein corking), dan dapat menguning pada keseluruhan kanopi, letaknya tersebar dan mengalami dieback yang parah (Planck, 1999).
7
buah biasanya muncul warna orange yang berlawanan dengan buah-buah sehat. Buah-buah yang terserang rasanya masam dan bijinya kempes, tidak berkembang dan berwarna hitam (Tirtawidjaja, 1964).
Gejala penyakit CVPD juga ada dalam tanaman. Pada irisan melintang tulang tengah daun jeruk berturut-turut dari luar hingga ketengah daun akan terlihat jaringan-jaringan epidermis, kolenkim, sklerenkim dan floem. Gejala dalam pada tanaman jeruk yang terkena CVPD adalah floem tulang daun tanaman sakit lebih tebal dari floem tulang daun tanaman sehat. Pada floem tulang daun tanaman sakit terdapat sel-sel berdinding tebal yang merupakan jalur-jalur mulai dari dekat sklerenkim sampai dekat xilem. Dinding tebal tersebut adalah beberapa lapis dinding sel yang berdesak-desakan. Didalam berbagai jaringan dalam daun terjadi pengumpulan secara berlebihan butir- butir halus zat pati (Tirtawidjaja, 1964).
Sistem tanaman yang terinfeksi berkembang jelek, akar serabut relatif sedikit karena mungkin terjadi defisiensi unsur hara. Pertumbuhan akar baru tertekan dan sering mengalami pembusukan, dimulai dari akar-akar kecil (rootless) (da Graca, 1991).
2.2.2 Penyebab Penyakit CVPD
Pada awalnya, penyakit CVPD disebabkan oleh virus (Tirtawidjadja, et al., 1964), kemudian karena pengembangan penelitian pada penyakit ini, dikatakan disebabkan oleh mykoplasma-like organism (MLO). Selanjutnya penyakit CVPD dikatakan disebabkan oleh BLO (bacterium like organism) (Sandrine, et al., 1994)
8
BLO yang diisolasi dari tanaman jeruk (varietas poona) yang terserang penyakit CVPD bahwa mereka telah berhasil mengembangkan satu primer yang spesifik dari 16S rDNA tersebut untuk mendeteksi patogen penyebab penyakit CVPD dan sejak itu disimpulkan bahwa penyebab penyakit CVPD adalah bakteri yang mereka beri nama Liberobacter (Sandrine, et al., 1996). Ditemukan dua spesies bakteri terbebut yaitu l. asiaticum yang tersebar di kawasan Asia termasuk Indonesia, dan L. africanum yang tersebar di kawasan Africa.
Bakteri L. asiaticum tergolong Kingdom Proteobacteria, Kelas Rhodospirilli, Ordo Rhizobiales, Famili Rhizobiaceae, Genus Liberobacter (Direktorat Perlindungan Tanaman Hortikultura). Bakteri Penyebab penyakit CVPD ini merupakan bakteri gram negatif, memiliki selubung dinding sel 25 nm (Jagoueix et al., 1994). Bakteri L. asiaticum belum bisa dikultur secara invitro sehingga informasi mengenai morfologi, fisiologi, biokimia dan genetik bakteri L. asiaticum terbatas (Nakashima et al., 1996). Pengamatan dengan mikroskop
9
Bakteri L. asiaticum tumbuh secara maksimum dan konstan pada daun dewasa. Pergerakan bakteri dalam tanaman jeruk cukup lambat yaitu 30-50 cm kearah bawah dalam waktu 12 bulan (da Graca, 1991)., dan pada tahap awal infeksi cenderung tetap berada pada cabang yang diinfeksi vektor (Su dan Hung, 2001).
Bakteri penyebab penyakit CVPD terdapat pada floem tanaman dan endoseluler (Garnier dan Bove, 1993). Bakteri dalam floem daun pada berbagai tingkat kematangan atau pada berbagai varietas jeruk, mempunyai kecenderungan berbiak melimpah pada musim panas dan berkurang pada musim dingin, tetapi dapat dideteksi dalam jumlah tertentu di sepanjang tahun (Su dan Huang, 1990). Pertumbuhan bakteri akan konstan dilihat pada daun tanaman jeruk yang yang sudah dewasa.
Penyakit CVPD dapat menular melalui bibit yang terinfeksi penyakit CVPD dan oleh serangga vektor (Wijaya, 2003). Penyebaran penyakit CVPD yang cepat pada pertanaman jeruk dapat terjadi walaupun tidak ditemukannya
Gambar 2.2
10
serangga vektor di lapangan, hal ini diduga karena tanaman yang mengandung bakteri sejak bibit walaupun belum menunjukkan gejala penyakit (Wirawan, 2003). Penyakit CVPD juga dapat menular lewat penempelan mata tunas atau grafting (Su, 2001) tetapi kecepatannya bervariasi karena distribusi bakteri tidak
beraturan pada tanaman (Hung et al, 2000), yang menyebabkan dapat diperoleh tanaman bebas penyakit dari tanaman terinfeksi (Planck, 1999). Walau secara terbatas alat-alat pertanian seperti alat inokulasi dan pemangkasan diduga dapat menularkan penyakit (Semangun, 1994).
2.3 Vektor Diaphorina citri Kuwayama
Bakteri Liberobacter asiaticum diketahui disebarkan oleh serangga sejenis kutu loncat yang bernama Diaphorina citri KUW. D. citri termasuk filum Arthropoda, klas Insecta, ordo Homoptera, family Psyllidae, Genus Diaphorina, spesies D. citri Kuw. (Kalshoven, 1981). Nurhadi (1993) melaporkan bahwa patogen dapat ditularkan oleh serangga vektor dari satu tanaman ke tanaman lain setelah melalui 1) periode makan akuisisi yaitu waktu 140 hari. yang diperlukan vektor untuk makan pada tanaman sakit sampai mendapatkan patogen, 2) periode makan inokulasi yaitu waktu yang diperlukan vektor untuk makan pada tanaman sehat sampai dapat menularkan patogen dan 3) periode retensi yaitu selang waktu vektor masih dapat menularkan patogen. Selanjutnya ditambahkan ketepatan vektor menusukkan stiletnya pada bagian tanaman sakit dan proporsi vektor yang infektif mempengaruhi laju penularan penyakit CVPD.
D. citri menyerang tangkai, kuncup bunga dan daun, tunas serta daun-daun
11
mengeriting dan pertumbuhannya terhambat. Kutu juga menghasilkan sekresi berwarna putih transparan berbentuk spiral, biasanya diletakkan berserak di atas daun atau tunas.
D. citri mempunyai tiga stadium hidup yaitu telur, nimfa, dan dewasa.
Telur berwarna kuning terang berbentuk seperti buah alpukat, diletakkan secara tunggal atau berkelompok di kuncup permukaan daun-daun muda, atau ditancapkan pada tangkai-tangkai daun, setelah 2-3 hari telur menetas menjadi nimfa. Nimfa yang baru menetas hidup berkelompok di tunas-tunas dan kuncup untuk menghisap cairan tanaman. Setelah berumur 2 atau 3 hari, nimfa menyebar dan menyerang daun-daun muda. Nimfa berwana kuning sampai coklat dan mengalami 5 kali pergantian kulit. Nimfa lebih merusak tanaman dari pada kutu dewasanya. Stadium nimfa berlangsung selama 17 hari. Pada kondisi panas siklus hidup dari telur sampai dewasa berlangsung antara 16-18 hari, sedangkan pada kondisi dingin berlangsung selama 45 hari. Perkawinan segera berlangsung setelah kutu menjadi dewasa dan segera bertelur setelah terjadi perkawinan. Seekor betina mampu meletakkan 800 butir telur selama masa hidupnya. D.citri mampu menghasilkan 9-10 generasi dalam 1 tahun. Stadium dewasa
ditandai oleh adanya sayap sehingga mudah meloncat apabila terkena sentuhan. Serangga dewasa berwarna coklat tua, dengan panjang tubuh 2-3 mm. Apabila dalam keadaan menghisap cairan sel tanaman, D. citri memperlihatkan posisi menungging. D. citri lebih aktif pada saat tanaman jeruk dalam fase vegetatif. D. citri dewasa hinggap pada daun tua dan menghisap cairan selnya. Stadium dewasa
12
Penelitian Wijaya (2010) mengatakan bahwa, pertambahan luas serangan CVPD berkisar antara 20 – 29% selama 6 bulan. Penelitian dilakukan dengan pengamatan awal di pengamatan di Desa Taro tanaman terserang CVPD sebanyak 51% meningkat menjadi 80% pada akhir pengamatan, sedangkan di Desa Katung berawal dari 39% menjadi 59%. Fenomena ini diperkuat dari hasil deteksi molekuler yang menunjukkan D. citri mengandung patogen CVPD, sehingga berpotensi sebagai vektor penyakit CVPD
2.4 Deteksi Penyakit CVPD dengan PCR
13
memerlukan keahlian khusus dan peralatan yang sangat canggih dan mahal. Deteksi dapat dilakukan untuk mengetahui adanya bakteri dalam floem tanaman dengan mengiris bagian daun secara tipis. Namun apabila konsentrasi bakteri sangat rendah, maka cara ini sangat kurang praktis (Adiartayasa dkk, 2012). DNA probes juga dapat mendeteksi keberadaan bakteri penyebab penyakit CVPD. Cara
tersebut sangat kurang sensitif untuk mendeteksi rutin, karena tanaman terinfeksi secara laten hanya menunjukkan signal yang lemah (Hung et al., 1999) dan kemampuan deteksi strain-strain tergantung dari tinggi rendahnya suhu yang digunakan (da Graca, 1991). Selain itu cara ini juga membutuhkan waktu yang cukup lama (Jaqoueix et al., 1996).
Metode PCR merupakan teknik replikasi reaksi berantai yang ditemukan oleh Kary Mullis pada pertengahan tahun 1980 (Watson et al., 1992). Metode ini dapat menunjukkan secara pasti tentang replikasi DNA. PCR menggunakan DNA utas tunggal sebagai template untuk pembentukan komplemen utas baru. Satu utas DNA yang diproduksi dari utas ganda DNA dengan pemanasan singkat pada suhu mendekati titik didih. PCR juga memerlukan bagian terkecil dari utas ganda DNA (primer) untuk memulai sintesis DNA. Oleh karena itu, titik awal sintesis DNA dapat dispesifikasikan dengan mengaitkan primer oligonukleotida pada titik awal tersebut. Hal ini merupakan rangkain pertama yang penting pada teknik PCR dimana polymerase DNA dapat langsung disintesakan pada daerah DNA yang spesifik.
14
yang diperlukan untuk PCR sangat sedikit, DNA yang digunakan untuk PCR sudah merupakan total DNA dari sel. PCR tidak memerlukan pemurnian DNA. Rangkaian DNA harus diisolasi terlebih dahulu sebelum diamplifikasi oleh PCR karena spesifikasi dari reaksi ditentukan oleh primer (Watson et al., 1992). Primer yang digunakan dalam PCR harus memenuhi syarat yaitu harus bersifat komplementer, pada satu spesifik site pada DNA template, mempunyai kandungan G/C -70%, mengandung 14-40 nukleotida, tidak ada urutan yang komplementer antara ujung 3’ masing-masing primer, sehingga tidak terbentuk primer dimer yang secara signifikan mengurangi sensitifitas dan spesipitas produk
PCR (Boehringer, 1995).
PCR memiliki tiga tahapan reaksi yang berbeda dalam satu siklus. Ketiga tahapan tersebut yaitu de-naturasi, annealing, dan polimerisasi. Tahap de-naturasi bertujuan untuk memutuskan ikatan H asam deoksiribonukleat (DNA) double stranded yang akan diamplifikasi. Hasil yang diperoleh merupakan DNA cetakan
untai tunggal untuk penempelan oligonukleotida primer dalam tahap annealing. Pada tahap kedua yaitu annealing, terbentuk ikatan H baru antara untai tunggal DNA cetakan dengan oligonukleotida primer. Tahap polimerisasi merupakan tahap pemanjangan rantai tunggal oligonukleotida primer dari ujung 3’ ke ujung 5’, dengan katalis enzim DNA polymerase. Ketiga tahap ini merupakan fungsi temperature dengan masing-masing temperatur tahap sebagai berikut : denaturasi ± 95ºC, annealing 45ºC, dan polimerisasi 72ºC.
Deteksi molekuler dengan menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) melalui tahapan : Isolasi Total DNA, Amplifikasi DNA dan Visualisasi
