1009 HUBUNGAN POLIMORFISME GEN PSA 252 DENGAN NILAI PSA PADA
PASIEN DENGAN KELAINAN PROSTAT Wiwin Mailana1
1) PTKMR Batan Pasar Jumat
ABSTRAK
HUBUNGAN POLIMORFISME GEN PSA 252 DENGAN NILAI PROSTATE SPESIFIC ANTIGEN (PSA) PADA PASIEN DENGAN KELAINAN PROSTAT. Penyakit pada prostat seperti Benign Prostatic Hyperplasia (BPH) dan kanker prostat (PCa) merupakan penyakit umum yang diderita oleh pria. Deteksi pada penyakit prostat seperti kanker prostat umumnya menggunakan serum prostate spesific antigen (PSA). Polimorfisme PSA yang berkaitan dengan serum PSA yaitu polimorfisme -252. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk melihat adanya hubungan polimorfisme atau SNP pada PSA -252 dengan nilai serum PSA dan resiko kanker prostat. Identifikasi polimorfisme PSA menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphisms (PCR-RFLP). Sedangkan pemeriksaan nilai PSA menggunakan metode radioimmunoassay. DNA diisolasi dari pasien BPH dan kanker prostat sebanyak 30 sampel.
Berdasarkan analisis gel. polimorfisme PSA 252 menghasilkan 3 genotipe. Polimorfisme - 252 memiliki tiga genotipe yaitu GG (163 bp). AA (126 bp) dan AG (163 bp & 126 bp).
Genotipe pada kanker prostat untuk polimorfisme -252 menghasilkan genotipe GG (80%).
AG (10%) dan AA (10%) dan untuk BPH yaitu GG (75%). AG (15%) dan AA (10%).
Berdasarkan hasil analisis statistik tidak ada hubungan yang signifikan antara polimorfisme - 252 terhadap nilai serum PSA dan resiko kanker prostat.
Kata kunci: Kelaiann prostat, Polimorfisme, Prostate Spesific Antigen (PSA), PCR-RFLP radioimmunoassay
.
ABSTRACT
RELATIONSHIP PROSTATE SPESIFIC ANTIGEN (PSA) POLYMORPHISM WITH PSA LEVEL IN PATIENTS WITH PROSTATE DISEASES. Prostate diseases such as Benign Prostatic Hyperplasia (BPH) and Prostate Cancer (PCa) were common disease in men. Detection of prostate cancer was generally using PSA serum. PSA gene polymorphism might be associated with PSA serum level at position -252. Therefore, this study was conducted to verify the relation between PSA polymorphism or SNP and the risk of prostate cancer. PSA polymorphism identification was examined by Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphisms (PCR-RFLP) method. While PSA level using radioimmunoassay method. DNA was isolated from blood of 30 BPH and prostate cancer patients. Based on gel analysis. there were 3 genotypes for each polymorphisme position. Polymorphism -252 resulted GG genotype (163 bp). AA (126 bp) and AG (163 bp and 126 bp). Polymorphism -252 resulted GG genotype (80%). AG (10%) and AA (10%) for prostate cancer and for BPH were GG genotype (75%). AG (15%) and AA (10%). This study showed that there is no significant relationship between polymorphism at position -252 with PSA level and prostate cancer risk.
Keyword : Prostate diseases, Polymorphism, Prostate Spesific Antigen (PSA), PCR-RFLP, radioimmunoassay
1010
PENDAHULUAN
Prostat adalah kelenjar seks pada pria. terletak di bawah kandung kemih dan mengelilingi saluran kencing. Kanker prostat adalah penyakit kanker yang menyerang kelenjar prostat. dimana sel-sel kelenjar prostat tumbuh secara abnormal tak terkendali sehingga mendesak dan merusak jaringan sekitarnya [1]. Tumor ganas ini bertahun tahun.
tanpa memberikan gejala yang jelas atau tidak terdapat gejala sama sekali terhadap penderitaannya. dan pada pemeriksaan fisik dengan cara colok dubur juga tidak teraba [2].
Kanker prostat adalah kanker yang paling sering didiagnosis pada pria di Amerika Serikat dengan perkiraan 232.000 kasus baru pada tahun 2005[3].
Penyebab spesifik dari kanker prostat secara pasti belum diketahui. Seorang pria yang berisiko terkena kanker prostat berhubungan dengan usia. genetik. ras. pola makan.
gaya hidup. paparan logan cadmium. dan obat obatan serta tingkat stress yang tinggi.
Faktor risiko utama adalah usia. Angka kejadian kanker prostat sedikit pada pria berusia kurang dari 45 tahun. tetapi akan bertambah dengan bertambahnya usia. yang mana rerata usia yang didiagnosis dengan kanker prostat adalah 70 tahun [2]. lebih dari 65% pria yang didiagnosis kanker prostat berusia 65 tahun keatas dan 90% kematian yang diakibatkan oleh kanker prostat berusia 65.4 tahun [4].
Pengaruh genetik terhadap perkembangan kanker prostat dapat dilihat dari adanya peningkatan insiden kanker prostat pada ras tertentu. juga pada pria kembar identik dan pria dengan gen tertentu. Penelitian di Amerika menunjukkan bahwa kanker prostat lebih sering menyerang pria kulit hitam daripada kulit putih atau pria Spanyol dan lebih mematikan jika menyerang pria kulit hitam. Pria yang mempunyai kakak atau ayah dengan kanker prostat mempunyai kemungkinan dua kali lipat menderita kanker prostat. Dari penelitian di Skandinavia pada pria kembar dilaporkan bahwa 40% risiko kanker prostat dapat dijelaskan dari faktor bawaan [5].Menurut American Cancer Society (ACS). American Urological Association (AUA). The U.S. Preventive Service Task Force (USPSTF) menganjurkan agar semua pria berusia diatas 50 tahun mengikuti Program Deteksi Dini Kanker Prostat dengan melakukan pemeriksaan Prostate Spesific antigen total (PSA) dan perabaan prostat melalui dubur yang disebut Digital Rectal Examination (DRE). Bila ada riwayat kanker dalam keluarga. program deteksi dini dianjurkan sejak usia 40 tahun [6.7].
Masalah utama dengan menggunakan serum PSA dalam memprediksi risiko kanker prostat adalah variabilitas yang cukup besar dari pengukuran tersebut. Cramer et.al.
mengidentifikasi satu set single nucleotide polymorphisms (SNP) pada gen PSA yang terkait dengan serum PSA. sehingga pemeriksaan polimorfisme ini menunjukkan bahwa genotip SNP dapat berguna dalam meningkatkan nilai prediksi skrining PSA [3]. Penelitian ini dapat digunakan untuk mengetahui hubungan antara polimorfisme PSA dengan serum PSA dan risiko kanker prostat. Manfaat penelitian ini yaitu deteksi kanker prostat dengan pemeriksaan serum PSA dan polimorfisme PSA pada pasien terduga kanker prostat. sehingga apabila diketahui adanya risiko kanker prostat. penatalaksanaan terapi dapat dilakukan dengan tepat.
Petanda tumor PSA merupakan glikoprotein yang diproduksi oleh sel-sel prostat.
mempunyai sejarah dalam penggunaanya sebagai serum biomarker kanker prostat. dan dihubungkan dengan adanya kanker prostat atau penyakit prostat[9]. PSA berfungsi untuk mengencerkan cairan ejakulasi untuk memudahkan pergerakan sperma dan berperan penting dalam fertilitas. Jumlah PSA yang tertinggi berada pada cairan ejakulasi. Pada keadaan tidak normal. PSA akan keluar dari prostat dan masuk kedalam aliran darah. Kadar normalnya dalam darah adalah 0-4 ng/ml [10].
Kemajuan teknologi terbaru telah memungkinkan peneliti untuk memeriksa ribuan polymormorphism (SNP) untuk mencari penanda genetik spesifik terkait dengan risiko pengembangan penyakit. Gen-gen yang dapat mempengaruhi proliferasi seluler dari kelenjar prostat. gen untuk PSA menjadi fokus dari beberapa penelitian. Beberapa polimorfisme telah dilaporkan dapat mempengaruhi tingkat serum PSA. Sebuah studi baru- baru ini menyebutkan penggunaan SNP ini sebagai penanda prediktif. Gen PSA mengandung polimorfisme. substitusi dari Guanin (G) oleh Adenin (A). ditemukan pada upstream basa 158 dari situs transkripsi. yang memiliki peran mengkontrol transkripsi dalam pengaturan ekspresi AR (andrgen receptor). Oleh karena itu. SNP ini berkaitan dengan tingkat serum PSA [11]. Karena skrining PSA pada pasien yang menjalani biopsi prostat menemukan banyak hambatan. maka penggunaan polimorfisme genotipe PSA 158 A/G
1011 yang dikombinasikan dengan hasil serum PSA merupakan metode untuk mengurangi biopsi yang tidak perlu [11].
METODOLOGI
Objek penelitian adalah sampel DNA dari sampel darah penderita kanker prostat dan BPH di salah satu Rumah Sakit di Jakarta Selatan. Jumlah sampel darah pasien yang digunakan yaitu 30 sampel.
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Radiobiologi dan Laboratorium Biologi Molekuler bidang Biomedika Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi (PTKMR).
Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN). Pasar Jumat. Jakarta. Penelitian dimulai dari Agustus – Oktober 2015.
SAmpel darah pasien kanker prostat dan BPH diisolasi DNA-nya sesuai dengan prosedur DNA High Pure PCR Template Preparation Kit dari Roche. Reaksi PCR polimorfisme -252 terdiri dari forward primer 0.5 µM (5’-ATC TCC TGA GTG CTG GTG TCT TA-3’) dan reverse primer 0.5 µM (5’-GCA ATT ACT AGA TCA CCC TGG ATG-3’). 5 µl DNA dan Faststart Essential DNA Green Master 10 µl. Water PCR Grade 4 µl [12]. Siklus PCR dimulai dari pre-denaturasi pada suhu 95ºC selama 10 menit. Siklus PCR yaitu 30 siklus yang terdiri dari tahap denaturasi pada 95ºC selama 20 detik. annealing pada 55ºC selama 20 detik dan elongation pada 72ºC selama 20 detik. Selanjutnya hasil PCR dilakukan elektroforesis dan RFLP. Hasil PCR dipotong dengan enzim NlaIII untuk polimorfisme -252 pada suhu 37ºC selama 2-3 jam. Hasil inkubasi dielektroforesis pada agar agarose 2% pada 100 volt selama 35 menit [12].. Setelah itu. gel agarose direndam di larutan EtBr selama 20 menit dan direndam kembali selama 10 menit di aquades. Gel divisualisasi dengan Gel DocTM XR+ Imaging System.
Kadar PSA diukur menggunakan metode radioimmunoassay. Serum darah pasien direaksikan dengan antibodi bertanda I125
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil isolasi DNA pasien selanjutnya diamplifikasi dengan PCR untuk mengampilifikasi sekuens DNA yang diinginkan. Produk hasil PCR dapat dianalisis sesuai dengan informasi yang ingin didapatkan seperti untuk mengetahui ada atau tidaknya DNA target atau panjang produk DNA. Metode paling sederhana dan sering digunakan untuk analisis produk DNA yaitu dengan gel elektroforesis [13]. Teknik elektroforesis akan memisahkan molekul-molekul berdasarkan bentuk. muatan dan berat molekulnya yang dijalankan dalam sebuah medan listrik [14]. Hasil PCR divisualisasi dengan elektroforesis untuk melihat hasil produk PCR. Hasil elektroforesis dengan gel agarose 2% pada polimorfisme -252 memiliki panjang pita sekitar 200-230 bp. Hal ini sesuai dengan yang dilakukan oleh Wang et al. (2003) yang menyatakan bahwa polimorfisme -252 memiliki panjang pita sekitar 205 bp. sehingga hasil PCR dapat diproses lebih lanjut untuk dilakukan teknik RFLP.
Gambar 1. Hasil elektroforesis dengan PCR untuk polimorfisme -252 (Ket : 1-2 = Sampel. K
= kontrol negatif. M = ladder).
1012
Sampel DNA yang telah diamplifikasi selanjutnya diproses dengan metode RFLP dengan bantuan enzim restriksi. Teknik ini digunakan untuk mendeteksi adanya polimorfisme PSA yaitu polimorfisme -252. Enzim yang digunakan yaitu enzim NlaIII untuk polimorfisme -252. Enzim memotong sekuen spesifik target dan dipisahkan dengan elektroforesis gel agarose 2%. Gel agarose 2% dapat digunakan untuk menentukan panjang fragmen 0.2 – 20 kb. Hasil RFLP untuk polimorfisme -252 menghasilkan fragment yang kurang lebih sama seperti yang diperoleh Wang et al. (2003) yaitu fragmen alel G (163 bp) dan alel A (126 bp). Polimorfisme pada posisi -252 pada proksimal promotor PSA kemungkinan memiliki hubungan dengan ekspresi mRNA PSA dan level serum PSA pada pasien prostat.
Tabel 1. Hasil RFLP Polimorfisme -252
No.
Samp el
Diagnosis Polimorfisme -252 Nilai PSA
(ng/ml) AA
(126 bp) AG
(163 bp &126 bp) GG (163 bp)
1 3.83 BPH - - GG
2 5.25 BPH - - GG
3 1.61 BPH AA - -
4 38.0 BPH - - GG
5 21.16 PCa - - GG
6 10.81 BPH - - GG
7 45.33 PCa - - GG
8 99.29 PCa - AG -
9 4.77 PCa - - GG
10 4.3 BPH AA - -
11 3.21 BPH - - GG
12 1.17 BPH - - GG
13 1.09 BPH - - GG
14 2.58 BPH - - GG
15 16.72 BPH - - GG
16 0.57 BPH - - GG
17 4.31 BPH - - GG
18 1.51 BPH - AG -
19 1.08 BPH - - GG
20 12.17 PCa AA - -
1013 Tabel 2. Rekapitulasi hasil RFLP polimorfisme -252
Genotipe Polimorfisme -252 (N=30)
PCa BPH
GG 8 (80%) 15 (75%)
AG
AA 1 (10%)
1 (10%) 3 (15%) 2 (10%)
Pada polimorfisme -252 memiliki genotipe GG untuk kanker prostat sebanyak 8 (80%) dan lebih tinggi dibandingkan dengan genotipe AG (10%) dan AA (10%). Genotipe GG pada BPH untuk polimorfisme -252 berjumlah 15 (75%). AG berjumlah 3 (15%) dan AA berjumlah 2 (10%). Xue et al. (2000) dan menemukan bahwa alel G lebih sering ditemukan pada pasien kanker prostat dan genotipe GG meningkatkan resiko kanker prostat sebanyak 60%.
Santos et al. (2008) dalam Kalay et al. (2009) menyatakan bahwa genotipe GG memberi resiko adanya kanker prostat lebih tinggi dibandingkan dengan genotipe yang lain seperti AG dan AA. Pada populasi Turki, alel G memiliki resiko dua kali lebih tinggi pada resiko kanker prostat (Kalay et al. 2009). Samzadeh et al. (2012) menunjukkan bahwa genotipe GG lebih sering pada pasien kanker prostat sebanyak 32% sedangkan pada BPH sebanyak 22.6%.
Hasil analisis statistik korelasi terhadap hasil RFLP polimorfisme -252 menunjukkan bahwa tidak ada korelasi yang signifikan antara polimorfisme -252 dengan penyakit prostat (p=0.952). Dan tidak ditemukannya hubungan antara serum PSA dengan polimorfisme -252 (p=0,596). Hasil uji korelasi menunjukkan bahwa hasil p-value > dari 0.05 sehingga tidak memiliki korelasi yang signifikan. Berdasarkan hasil menunjukkan bahwa polimorfisme -252 belum dapat membuktikan dengan jelas adanya pengaruh polimorfisme ini dengan kanker prostat ataupun serum PSA.
Penemuan adanya hubungan antara variasi genetik pada promotor PSA dengan serum PSA pada pria menyebabkan banyaknya penelitian yang melakukan topik ini.
Penelitian dilakukan untuk melihat ada atau tidaknya hubungan antara polimorfisme PSA terhadap resiko kanker prostat ataupun serum PSA. Berbagai penelitian dilakukan dengan
21 37.82 PCa - - GG
22 1.40 BPH - - GG
23 0.43 PCa - - GG
24 2.78 PCa - - GG
25 3.99 BPH - - GG
26 4.99 BPH - AG -
27 8.85 BPH - - GG
28 21.61 BPH - AG -
29 0.04 PCa - - GG
30 2.62 PCa - - GG
Jumlah 3 4 23 30
1014
berbagai perbedaan. baik dalam jumlah populasi. perbedaan etnik ataupun jumlah kontrol dan sampel yang dipakai [17].
Studi mengenai hubungan polimorfisme PSA yaitu polimorfisme -252 sebelumnya telah dilakukan oleh Wang et al. (2003) menyatakan bahwa polimorfisme -252 tidak terdapat hubungan terhadap peningkatan resiko kanker prostat pada pria Jepang. Wang et al. (2003) juga melakukan pemeriksaan hubungan antara polimorfisme -252 dengan serum level PSA menunjukkan hubungan yang tidak signifikan antara polimorfisme ini untuk pasien kanker prostat dengan level PSA.
Menurut Samzadeh et.al (2012). penyebab hasil yang berbeda-beda antara penelitian satu dengan lainnya tidak dapat dijelaskan secara tepat. Hasil yang berbeda diduga karena adanya faktor seperti faktor etnik. gaya hidup ataupun lingkungan. Perbedaan juga dapat dikarenakan perbedaan jumlah populasi ras. sedikitnya peristiwa penyakit prostat pada populasi yang diperkirakan memberi efek terhadap hasil yang didapat sehingga hasilnya berbeda-beda [12]. Perbedaan hasil pada polimorfisme dapat dikurangi dengan meneliti dengan melibatkan jumlah sampel yang lebih besar [11].
KESIMPULAN
Genotipe pada kanker prostat untuk polimorfisme -252 menghasilkan genotipe GG (80%). AG (10%) dan AA (10%) dan untuk BPH yaitu GG (75%). AG (15%) dan AA (10%).
Polimorfisme -252 tidak berhubungan secara signifikan dengan kadar serum PSA dan penyakit pada prostat.
UCAPAN TERIMA KASIH
Terimakasih saya ucapkan kepada dr Amrizal SpU dan team yang telah memberikan sumbang dan saran terhadap penelitian ini dan pada rekan rekan PTKMR BATAN yang telah bekerjasama dalam terlaksananya penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
1. PDPERSI, Kanker Prostat, diambil dari www.pusdiknakes.or.id pada tanggal 1 Februari 2010
2. W. A. SCHULZ, Molecular Biology of Human Cancer, 383-386, (2005)
3. BEEBE-DIMMER JL. LANGE LA. CAIN JE. LEWIS RC. RAY AM. SARMAL AV. LANGE EM. Polymorphisms in the prostate-specific antigen gene promotor do not predict serum prostate-specific antigen levels in African-American men. Prostate Cancer and Prostatic Diseases. 9 :50-55 (2006)
4. K.O.H. WILLIAM, et.al., Neoplasms of The Prostate, Holland-Frei Cancer Medicine. 5th edition
5. IAEA, Development of kit for Radiometric assays for Tumor Marker: Final report of a Coordinated Research Project, 1997-2001, IAEA-TECDOC-1307, August, (2002) 6. NATIONAL COMPREHENSIVE CANCER NETWORKS, Practice Guidline in Oncology:
Prostate Cancer Early Detection, Versi 2, (2007)
7. U.S. PREVENTIVE SERVICES TASK FORCE (USPTF), Screening for Prostate Cancer:
Recomendation and Rationale, Annals of Internal Medicine, Vol.137, Number 11, 3 December 2002, www.annals.org
8. K. OKIHARA, R. J. BABAIAN, Complexed Prostate Spesific Antigen Improvement in detecting Prostate Cancer, Current Urology Reports, 2, 253 - 258, (2001)
9. LOEB, STACY, ET.AL., What to Do with an abnormal PSA test, The Oncologist, 13:299- 355 (2008)
10. BROSMAN, STANLEY A, Prostate Spesific Antigen, diambil pada www.emedicine.medscape.com pada tanggal 18 Februari 2009, Updated 15 Juni 2006
1015 11. SAMZADEH M. HASANZAD M. JAMALDINI SH. HAGH-DOOST AA. AFSHARI M.
ZIAEE SAM. Association of G/A Polymorphism. rs266882. in AREI Region of the Prostate-Specific Antigen Gene with Prostate Cancer Risk and Clinicopathological Features. Urology Journal. 9 (4) :691-699 (2012)
12. WANG L.Z. SATO K. TSUCHIYA N. YU JG. OHYAMA C. SATOH S. HABUCHI T.
OGAWA O. KATO T.. Polymorphisms in prostate-specific antigen (PSA) gene. risk of prostate cancer. and serum PSA levels in Japanese population. Cancer Letters (202) : 53-59 (2003)
13. DORAK MT. Real-time PCR. UK: Taylor & Francis Group (2006)
14. ELROD DAN STANSFIELD. Schaum’s Outlines teori dan Soal-soal Genetika Edisi Keempat. Tyas D. penerjemah; Safitri A. editor. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari:
Schaum’s outlines of Theory and Problems of Genetics 4th ed. (2006)
15. XUE W, IRVINE RA, YU MC. ROSS RK, COETZEE GA, INGLES SA, Susceptibility to prostate cancer: Interaction between genotype at the androgen receptor and prostate- specific antigen loci, Cancer Res (60): 839-841 (200)
16. KALAY E. ERGEN A. NARTER F. AGACHAN B. GORMUS U. YIGIT N. ISBIR T, ARE-I Polymorphism on PSA gene in prostate cancer patients of a Turkish population, ANTICANCER RESEARCH 29 : 1395-1398 (2009)
17. LAI J. KEDDA MARY-ANNE. HINZE K. L.G.SMITH R. YAXLEY J. B.SPURDLE A.
MORRIS CP. HARRIS J. A.CLEMENTS J., PSA/KLK3 AREI promotor polymorphism alters androgen receptor binding ands is associated with prostate cancer susceptibility.
Carcinogenesis 28: 1032-1039 (2006)
18. MEDEIROS R. MORAIS A. VASCONCELOS A. COSTA S. PINTO D. OLIVEIRA J.
CARVALHO R. LOPES C., Linkage between polymorphisms in the prostate spesific antigen AREI gene region. prostate cancer risk. and circulating tumor cells. The Prostate (53): 88-94 (2002)
