Universitas Kristen Marantaha iv
ABSTRAK
OPTIMASI AMPLIFIKASI GEN fliC DENGAN METODE PCR UNTUK DETEKSI Salmonella typhi GALUR INDONESIA
T. Robertus, 2007. Pembimbing I : Johan Lucianus, dr., M.Si.
Pembimbing II : Ernawati Arifin Giri Rachman, Ph.D.
Salmonella typhi, bakteri penyebab demam tifoid, pada umumnya hanya memiliki satu jenis tipe gen flagel, yaitu H1-d, yang diekspresikan oleh fliC, yang berukuran sekitar 1,5 kb. Beberapa isolat yang hanya ditemukan di Indonesia, mempunyai antigen H1-j, yang memiliki perbedaan pada gen fliC karena adanya delesi 261 pb bila dibandingkan dengan antigen H1-d. Salmonella typhi tersebut memiliki sifat motil dan virulensi yang berbeda, namun bagaimana hubungan antara sifat tersebut dengan perbedaan di tingkat gen belum banyak diketahui. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mencari kondisi PCR untuk mengamplifikasi gen fliC menggunakan primer fliC-FWD dan fliC-REV agar dapat dipakai untuk membedakan Salmonella typhi H1-d dan H1-j, sehingga dapat digunakan untuk penelitian lebih lanjut. Sampel yang digunakan adalah DNA hasil isolasi kromosom darah pasien yang diperoleh dari Rumah Sakit Immanuel Bandung. Proses amplifikasi dikerjakan dengan menggunakan templat hasil isolasi kromosom dengan pengenceran 1000× dengan konsentrasi primer masing-masing 25 µM. PCR dilakukan dalam 30 siklus, 94°C selama 60 detik, 45°C selama 60 detik, dan 68°C selama 120 detik. Analisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% menunjukkan adanya pita antara 1 sampai 2 kb.
Universitas Kristen Marantaha v
ABSTRACT
OPTIMATION OF fliC GENE AMPLIFICATION BY PCR METHOD IN SCREENING OF INDONESIAN STRAIN OF Salmonella typhi
T. Robertus, 2007. First Tutor : Johan Lucianus, dr., M.Si.
Second Tutor : Ernawati Arifin Giri Rachman, Ph.D.
Salmonella typhi, the etiologic agent of typhoid fever, typically has only one type of flagellar antigen, H1-d, which is encoded by fliC, a 1,5 kb gene. Some isolates, found in Indonesia, however, have H1-j antigen. The fliC gene that produce H1-j antigen has 261 bp less nucleotides than H1-d. The difference of the fliC gene result in the differences of both its virulence and pathogenesis. The general purpose of this research is to determine a condition of PCR to amplify the fliC gene using primer fliC-FWD and fliC-REV, in order to determine the differences between H1-d and H1-j, so that it can be used for further research. The samples are collected from extracted chromosomal DNA taken from patient of Immanuel Hospital Bandung. DNA amplification was performed with 1000× dilution extracted DNA using 25 µM of each of the primer. PCR was performed for 30 cycles of 60 s at 94°C, 60 s at 45°C, and 120 s at 68°C. Analysis with 1% electrophoresis gel agarose showed a 1 to 2 kb fragment.
Universitas Kristen Marantaha ix
DAFTAR ISI
Halaman
LEMBAR PERSETUJUAN ... ii
SURAT PERNYATAAN ... iii
ABSTRAK... iv
ABSTRACT... v
PRAKATA... vi
DAFTAR ISI... ix
DAFTAR GAMBAR ... xi
BAB I PENDAHULUAN... 1
1. l Latar Belakang ... 1
1.2 Identifikasi Masalah... 2
1.3 Maksud dan Tujuan... 3
1.4 Manfaat Penelitian ... 3
1.5 Metode Penelitian ... 3
1.6 Waktu dan Lokasi Penelitian ... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 5
2.1 Salmonella typhi... 5
2.1.1 Karakteristik... 5
2.1.2 Faktor Virulensi dan Toksin ... 6
2.1.3 Patogenesis... 8
2.2 Gen fliC... 11
2.3 Salmonella typhi Galur Indonesia (H1-j) ... 13
2.4 Amplifikasi dengan Teknik PCR ... 17
BAB III ALAT, BAHAN DAN METODE ... 21
Universitas Kristen Marantaha x
3.2 Metode Penelitian ... 21
3.3 Alat dan Bahan... 21
3.3.1 Alat... 21
3.3.2 Bahan ... 22
3.4 Cara Kerja ... 22
3.4.1 Tahap I : Pembuatan Templat ... 22
3.4.2 Tahap II : PCR ... 23
3.4.2.1 PCR menggunakan Primer Ca8 dan Ca9 ... 23
3.4.2.2 PCR menggunakan Primer fliC-FWD dan fliC-REV... 23
3.4.3 Elektroforesis ... 24
BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN... 25
4.1 Penanaman Sampel pada Medium Salmonella Shigella... 25
4.2 PCR menggunakan Primer Ca8 dan Ca9 ... 26
4.3 PCR menggunakan Primer fliC-FWD dan fliC-REV... 27
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 30
5.1 Kesimpulan ... 30
5.2 Saran ... 31
DAFTAR PUSTAKA ... 32
Universitas Kristen Marantaha xi
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1 Salmonella enterica... 5 Gambar 2.2 Salmonella typhi, pewarnaan gram ... 6 Gambar 2.3 Salmonella typhi, pewarnaan flagel ... 6 Gambar 2.4 Faktor-faktor virulensi yang penting dalam patogenesis Salmonella .... 7 Gambar 2.5 Proses invasi Salmonella pada mukosa usus... 10 Gambar 2.6 Color-enhanced scanning electron micrograph showing Salmonella typhimurium invading cultured human cell ... 10
Gambar 2.7 Terjadinya rekombinasi gen fliC-d menjadi fliC- j ... 14 Gambar 2.8 Perbedaan fragmen DNA hasil PCR yang dianalisis pada
elektroforesis gel agarose ... 15 Gambar 2.9 Tahap-tahap utama pada proses PCR... 18 Gambar 2.10 Penggandaan gen secara eksponensial pada proses PCR... 19 Gambar 4.1 Sampel berupa media Bactec dan sampel yang ditanam pada
1 Universitas Kristen Maranatha BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Demam tifoid atau typhus abdominalis atau disebut juga demam enterik merupakan penyakit yang disebabkan salah satunya oleh bakteri Salmonella typhi. Penyakit ini mudah menular dan dapat menyerang banyak orang sehingga dapat menimbulkan wabah.
Demam enterik adalah penyakit endemik di sebagian besar negara-negara berkembang di dunia, khususnya di daerah Amerika Selatan dan Tengah, juga Asia, terutama Asia Selatan dan Asia Tenggara. Dilaporkan ada sekitar 16–33 juta kasus, dengan angka kematian 500.000–600.000 per tahunnya. Angka kejadian rata-rata penyakit ini 225–810 per 100.000 penduduk di Chili, Nepal, Indonesia dan Afrika Selatan (Girard, et al., 2005).
Pada tahun 1989 Frankel et al. mendapati adanya galur baru yang hanya didapatkan pada pasien positif demam tifoid di Jakarta, Indonesia, yaitu H1-j, yang memiliki gen yang mengkode flagel yang berbeda dari Salmonella typhi pada umumnya, yaitu fliC-j. Sementara gen yang mengkode flagel Salmonella typhi pada umumnya adalah fliC-d, galur ini disebut H1-d. Gen fliC-j lebih pendek 261 pb bila dibandingkan dengan gen fliC-d. Salmonella typhi galur H1-j ini mempunyai daya motilitas dan invasi yang lebih rendah dibandingkan galur H1-d secara in vitro (Frankel, et al., 1989). Sehingga virulensi galur H1-j ini lebih rendah daripada H1-d.
Universitas Kristen Maranatha 2
komplikasi yang dapat mengancam jiwa, seperti perforasi usus, perdarahan saluran cerna, myocarditis dan atau disertai gejala gangguan susunan saraf pusat (Augusto Franco, et al., 1992).
Menjadi hal yang menarik bagi kita untuk meneliti lebih lanjut tentang adakah hubungan antara gen yang mengkode flagel pada Salmonella typhi, fliC, dengan tingkat keparahan penyakit yang ditimbulkannya.
Langkah-langkah yang harus dilakukan untuk meneliti lebih lanjut mengenai adakah hubungan antara gen yang mengkode flagel pada Salmonella typhi, fliC, dengan tingkat keparahan penyakit yang ditimbulkannya adalah yang pertama mencari suatu cara untuk mendapatkan kuman galur baru ini, hal ini dapat kita lakukan dengan mengamplifikasi gen fliC-nya. Untuk itu kita butuh suatu metode untuk dapat mengamplifikasi gen fliC, dalam hal ini kita gunakan teknik PCR. Setelah didapatkan kuman galur H1-j ini, langkah selanjutnya adalah melakukan penelitian mengenai adakah perbedaan pola protein flagel, dalam hal ini yang dikode oleh gen fliC, antara galur H1-d dan H1-j. Kemudian dilihat fenotipenya, apakah ada perbedaan antara kedua galur ini yang berhubungan dengan tingkat virulensi atau keparahan penyakit yang ditimbulkannya.
Penelitian ini mengerjakan tahap pertama, yaitu mencari kondisi PCR yang paling optimal untuk mengamplifikasi gen fliC dengan cara modifikasi dan optimalisasi kondisi PCR yang sudah ada sebelumnya.
1.2 Identifikasi Masalah
Universitas Kristen Maranatha 3
1.3 Maksud dan Tujuan
Maksud dari penelitian ini adalah untuk mengetahui adakah hubungan antara gen yang mengkode flagel pada Salmonella typhi, fliC, dengan tingkat keparahan penyakit yang ditimbulkannya.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mencari kondisi PCR gen fliC menggunakan primer fliC-FWD dan fliC-REV.
1.4 Manfaat Penelitian
Karya tulis ini diharapkan dapat dijadikan penelitian pendahuluan bagi para peneliti selanjutnya dalam melakukan penelitian lebih lanjut mengenai adakah hubungan antara gen yang mengkode flagel pada Salmonella typhi, fliC, dengan tingkat keparahan penyakit yang ditimbulkannya.
1.5 Metode Penelitian
Universitas Kristen Maranatha 4
1.6 Waktu dan Lokasi Penelitian
30 Universitas Kristen Maranatha BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Penelitian ini bertujuan untuk mencari kondisi PCR gen fliC menggunakan primer fliC-FWD, dan fliC-REV. Primer fliC-FWD dan fliC-REV dirancang dengan mengoptimalisasi primer yang sudah ada sebelumya. Rancangan primer baru ini ternyata bisa digunakan untuk amplifikasi dengan kondisi sebagai berikut :
Formula PCR untuk satu kali reaksi menggunakan primer FWD dan fliC-REV adalah :
- Bufer 10× - Mg 2+ 2,5 M - dNTP 200 M - fliC-FWD 25 M - fliC-REV 25 M - Taq polymerase 5 U/ l - H2O steril
- Templat atau air : templat hasil isolasi kromosom dengan pengenceran 1.000×
Kondisi PCR untuk mengamplifikasi gen fliC adalah : - Jumlah siklus : 30
- Denaturasi : 94˚C 1 menit - Annealing : 45˚C 1 menit
Universitas Kristen Maranatha 31
5.2 Saran
Perlu dilakukan sekuensing terhadap gen fliC Salmonella typhi yang digunakan sebagai sampel untuk mendapatkan urutan nukleotida dan memastikan bahwa pita hasil amplifikasi adalah benar gen fliC
32 Universitas Kristen Maranatha DAFTAR PUSTAKA
A. Rudiretna. 1998. Gen mirip CarA pada Salmonella typhi. Desertasi Program Pasca Sarjana. Institut Tekhnologi Bandung.
Anonymous. 1999. Principle of the PCR.
http://www.biology.lsa.nmich.edu/research/labs/maddock/protocols/PCR/general _pcr_ protocol.html, April 14th, 2006.
Anonymous. Polymerase chain reaction.
http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction, January 4th, 2007.
Anonymous. Color-enhanced scanning electron micrograph showing Salmonella typhimurium invading cultured human cells.
(http://images.googleco.id/imgres?imgurl=http://www.idph.state.il.us/images/sal monella.jpg&imgrefurl=http://www.idph.state.il.us/public/hb/hbsam.htm&h=270 &w=277&sz=44&tbnid=cQdx9FOu_h6uGM:&tbnh=111&tbnw=114&prev=/ima ges%3Fg%3Dsalmonella%2Bpicture&start=l&sa=X&oi=images&ct=image&cd= 1, January 3rd, 2007).
Brown, T. A. 1995. Gene Cloning, an Introduction, 3rd ed. Chapman & Hall. p. 228-238.
Coyne, V. E., James, M. D., Reid, S. J., and Rybicki, E. P. 2001. Molecular Biology Techniques Manual, 3rd ed.
E. A. Giri Rachman, T. Robertus, S. Hadi. 2006. PCR for detection Salmonella typhi from Indonesia strain. Oral Presentation. International Conference of Natural and Mathematical Science. Institut Tekhnologi Bandung.
E. A. Giri Rachman, T. Robertus, S. Hadi. 2006. PCR for detection Salmonella typhi from Indonesia strain. Proceeding. International Conference of Natural and Mathematical Science. Institut Tekhnologi Bandung. Submitted.
Franco, A., Gonzalez, C., Levine, O. S., Lagos, R., Hall, R. H., Hoffman, S. L., et
al. 1992. Further consideration of the clonal nature of Salmonella typhi:
Universitas Kristen Maranatha 33
Frankel, G., Newton, S. M., Schoolnik, G. K., and Stocker, B. A. 1989. Intragenic recombination in a flagellin gene: characteristics of the HI-j gene of Salmonella typhi. EMBO J. 8:3149-3152.
Gelehrter, T. D., Collins, F. S., Ginsburg, D. 1997. Principles of Medical Genetics, 2nd ed. Maryland: Williams & Wilkins. p. 347.
Girard, M. P., Steele, D., Chaignat, CL., Kieny M. P. 2005. A review of vaccine research and development: human enteric infections. Science Direct. p. 2744.
Groisman, E. D. 2001. Principles of Bacterial Pathogenesis. California: Academic Press. p. 267.
Rachmat Juwono. 1996. Demam Tifoid. In: Noer, H. M. S., Waspadji, S., Rachman, A. M., Lesmana, L. A., Widodo, D., Isbagio, H., et al. eds. Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam, 3rd ed. Jilid 1. Jakarta: Balai Penerbit FKUI. p. 435-462.
Kutsukake, K., Ohya, Y., and Iino, T. 1990. Transcriptional analysis of flagellar regulon of Salmonella typhimurium. J. Clin. Microbiol. 172:741-747.
Lau, Susanna K. P., Patrick C. Y. Woo, Clair Y. F. Chan, Wai-Lan Woo, Gibson K. S. Woo, and Kwok-Yung Yuen. 2005. Typhoid fever associated with acute appendicitis caused by an HI-j strain of Salmonella enterica serotype typhi. J. Clin. Microbiol. 43:1470-1472.
Lesser, C. F., Miller, S. I. 2005. Salmonellosis. In: Kasper, D. L., Fauci, A. S., Longo, D. L., Braunwald, E., Hauser, S. L., Jameson, J. L. eds. Harrison's Principles of Internal Medicine. 16th ed. Volume 1. New York: The MacGrawHill Companies, Inc. p. 897-898.
Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J. 2003. Brock's Biology of Microorganisms, l0th ed. New Jersey: Pearson Education, Inc. p. 741-742.
